人源抗-HBsAg dsFv-IFN融合基因的构建及在CHO细胞中的表达

目的 :探讨用抗体工程技术研制乙型肝炎导向干扰素。方法 :在已有的抗HBsAg_dsFv的基础上 ,用重叠延伸PCR的方法将抗_HBsAg_dsFvVL 基因和α_干扰素基因连接 ,形成融合基因。为避免IFN与dsFv空间折叠的影响 ,其间引入 15个氨基酸的柔性短肽 ;分别构建重链VH 基因、轻链VL_IFN融合基因的CHO表达载体 ,共转染CHO细胞。结果 :从细胞培养上清中检测到有抗病毒活性的IFN存在 ,有抗_HBsAg活性 ,但dsFv与抗原的结合活性较低。结论 :本研究为研制乙肝导向干扰素奠定了基础。     

人神经生长因子在CHO细胞中的高效稳定表达

神经生长因子 (nervegrowthfactor,NGF)是神经系统重要的营养因子[1 ] 。NGF的主要生物学效应是维持外周交感、感觉神经元和中枢胆碱能神经元的存活和发育 ,促进神经系统损伤后修复 ,同时还参与调节免疫和造血等非神经系统的功能[2 ] 。NGF在治疗神经损伤、早老性痴呆和外周神经病等方面具有广阔的临床应用前景[3] 。基因工程方法是获得人神经生长因子 (hNGF)的重要手段之一 ,大肠杆菌表达的hNGF ,其体外折叠困难 ,复性后的蛋白生物比活性低。而在哺乳动物细胞中可产生具有较高生物学活性的类似天然蛋白的人神经生长因子。国内尚未有h…     

IIn-UK融合基因在CHO细胞中的高表达研究

目的 :构建新型高效真核表达载体 ,实现人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体 低分子量尿激酶 (IIn UK)在CHO细胞中的高表达。方法 :利用常规分子生物学方法 ,通过对neo基因的表达进行不同程度的弱化 ,构建了一系列新型真核表达载体 ,以IIn UK融合基因为目的基因 ,比较这些真核表达载体实现外源基因高表达的能力 ,然后挑选高表达的克隆 ,通过MTX加压扩增 ,以提高IIn UK融合基因的拷贝数及表达水平。结果与讨论 :构建了 5种新型真核表达载体 ,并筛选出优化的真核表达载体 ,通过MTX加压扩增 ,实现了IIn UK融合基因在CHO细胞中的高表达 ,表达量达到 10 μg/ (10 6细胞·2 4h )。     

抗HBsAg人IgG表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达

尝试将一株来源于人源性噬菌体抗体库的抗ＨＢｓＡｇ人Ｆａｂ,转换成完整的抗ＨＢｓＡｇ人ＩｇＧ。方法：采用重叠ＰＣＲ方法,在抗ＨＢｓＡｇ人Ｆａｂ的Ｖｋ和ＶＨ基因的５’端接上合工合成的人ｋ链的前导序列,构建表达完整ＩｇＧ１的真核表达载体,转染ＣＨＯ（ＤＨＦＲ＾－）细胞,用ＥＬＩＳＡ、ＲＴ－ＰＣＲ和免疫印迹检测抗ＨＢｓＡｇ人ＩｇＧ的表达,通过ＤＨＦＲ／ＭＴＸ体系及金属离子诱导提高Ｉｇ表达。结果：获得表达量     

抗人CD40功能性嵌合抗体的制备及其高效表达

目的构建抗CD40嵌合抗体的真核表达载体,实现在真核细胞中的高效表达。方法采用RT-PCR法,从分泌鼠源抗人CD40抗体的杂交瘤细胞系5C11中钓取其轻、重链基因,进行序列测定。将5C11轻重链可变区基因分别克隆入表达载体pCMV-VH和pCMV-VL,构建成嵌合抗体（c5C11）的轻链真核表达载体5C11L-pCMV及重链真核表达载体5C11H-pCMV。将嵌合抗体的轻重链真核表达载体共转染入293T细胞,利用夹心ELISA法测定上清中c5C11的浓度,通过流式细胞术检测c5C11与膜抗原的特异性结合。通过生物信息学相关方法对c5C11的氨基酸序列进行合理改造,尝试在保持生物学功能的基础上提高c5C11的表达量。结果成功钓取鼠源单抗5C11的轻重链可变区基因并构建了真核表达载体,实现了c5C11的分泌表达;嵌合抗体较好地保留了鼠源母本抗体的抗原识别能力。利用计算机辅助设计,一定程度上提高了c5C11的表达量。结论为后续研究嵌合抗CD40抗体对B淋巴瘤等肿瘤的治疗提供了一定的依据。     

人白介素6在CHO细胞中的克隆与表达

本研究通过引物设计、转译优化、ＤＮＡ体外重组等技术，构建了ｐＳＶ２·ＩＬ６重组质粒，利用磷酸钙共沉淀法转染中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶缺陷型（ＣＨＯｄｈｆｒ－）株，经选择培养基筛选及逐渐提高甲氨蝶呤（ＭＴＸ）的浓度加压基因共扩增法，获得一株稳定表达人ＩＬ６的细胞株，用ＩＬ６依赖的杂交瘤细胞株７ＴＤ１测定细胞上清液的ＩＬ６生物学活性为１．９×１０５Ｕ／（１０６细胞·ｄ）。     

人源抗HBsAg Fab工程化大肠杆菌优化表达的实验研究

目的：探讨表达人源抗HBsAg Fab工程化大肠杆菌的优化培养模式及诱导方法，以期大量获取人源抗HBsAg Fab。方法：在摇瓶发酵条件下探讨工程菌的生长和表达规律，筛选最佳的培养模式及诱导表达条件，后于发酵罐中行补料高密度发酵试验，以确定最佳补料模式。结果：由摇瓶发酵获得的数据表明，当培养体系处于对数生长中期为诱导表达的起点，在250℃下以O．2％arabinose诱导12h条件下Fab的产率最佳，采用溶氧控制补料模式可使培养体系的最大OD600达到55．2，相当于湿菌含量110g/L水平。同时，经证实Fab的抗原结合活性良好。结论：确定了周期短、产率高且稳定可靠的发酵工艺，为应用原核表达体系工业化大批量生产基因工程抗体奠定了基础。     

二硫键稳定的抗肝癌人源化单链抗体—突变体人TNFα融合基因在CHO（dhfr^—）细胞中的表达

目的：提高抗肝癌靶向人肿瘤坏死因子（hScFv25-hTNFα)的稳定性和杀伤活性,构建二硫键稳定的抗肝癌人源化单链抗体－突变体人TNFα融合基因（ds-ScFv-hTNFα）,并在CHO细胞中表达。方法：常规构建ds-ScFv-hTNFα融合基因,并克隆入真核表达载体pCI(dhfrl）,磷酸钙共沉淀法转染中国仓鼠卵巢细胞株（CHO－dhfr^-）,甲氨蝶呤（MTX）高压筛选高表达细胞株,免疫荧光染色和MTT法检测重组蛋白的抗体和突变体hTNFα的双重活性。结果：目的基因在CHO（dhfr^－）中获得了表达,表达产物具有抗体和突变体hTNFα的双重活性,且稳定性得到大幅度提高,达到4℃放置4个月活性无明显下降。结论：抗肝癌人源化ds-ScFv-hTNFα融合基因在CHO细胞中获得功能性表达,为进一步的临床应用研究奠定了基础。     

人血小板生成素在CHO细胞中的稳定表达及其产物鉴定

目前，血小板生成素（ＴＰＯ）的基因工程研究是继促红细胞生成素（ＥＰＯ）之后的又一个热点。由于对ＴＰＯ结构与功能的关系了解不够，其基因工程方面的研究在表达系统的选择和分子结构的设计上均存在很大的盲目性。针对这一问题，作者欲对ＴＰＯ的糖基化程度与其生物学...     

抗基孔肯亚病毒人-鼠嵌合抗体真核表达载体的构建和表达

目的：表达具有中和活性的抗基孔肯亚病毒人．鼠嵌舍抗体。方法：用RT-PCR法克隆具有中和活性的抗基孔肯亚病毒鼠源单克隆抗体CHIK-IF1的轻重链可变区基因，克隆人IgG1恒定区基因组基因，构建了轻重链嵌舍基因和表达质粒pCdhfrlL，pcDNA3、1H，共转染二氢叶酸还原酶缺陷型CHO细胞，用ELISA检测培养上清中嵌舍抗体的表达，MTX加压筛选表达量高的克隆，扩大培养收集上清并纯化，纯化的嵌合抗体进行SDS-PAGE、Western印迹检测和抗原结合活性的检测。结果与结论：在CHO细胞中成功表达了抗基孔肯亚病毒的嵌舍抗体，为制备抗基孔肯亚病的被动免疫制剂奠定了良好的基础。     

抗人BlyS嵌合抗体的研制及功能鉴定

目的:在具有中和功能的母本抗体基础上,进行人源化改造,获得具有相同功能的嵌合抗体.方法:本研究以一株具有中和活性的抗人BlyS鼠单抗(B20)为母本,将抗人BlyS鼠单抗B20的轻、重链可变区基因分别插入到含有人κ链和IgG1重链恒定区基因的真核表达载体中,构建了人-鼠嵌合抗体表达载体,转染真核细胞,通过ELISA、RT-PCR、免疫印迹、体外中和实验分别对嵌合抗体(CB20)进行检测.结果:RT-PCR结果显示,转染后细胞系有人-鼠嵌合抗体mRNA的转录;ELISA、免疫印迹实验鉴定表明,该嵌合抗体与人BlyS特异性结合;体外中和实验表明,此抗体能中和BlyS对B淋巴细胞促增殖效应.结论:成功地构建人-鼠嵌合抗体CB20.     

EGFP-HBVP22e融合蛋白在HepG2中的表达

目的 利用pEGFP-C2真核表达载体,建立稳定表达乙型肝炎病毒(HBV)P22e的HepG2细胞系.方法 以含1.2拷贝HBV基因(adr亚型)的p3.8Ⅱ质粒为模板,PCR获得HBVP22e cDNA片段,分离插入通用T载体pMD18-T中鉴定,然后装入真核表达型载体pEGFP-C2中,HBVP22e与EGFP基因融合,脂质体转染HepG2细胞株,荧光显微镜下观察EGFP-HBVP22e融合蛋白的胞内表达,Western blot检测阳性克隆细胞EGFP-HBVP22e的表达.结果 成功构建了真核表达载体pEGFP-C2HBVP22e,并转染HepG2细胞,经多次传代培养鉴定,获得稳定表达EGFP-HBVP22e融合蛋白的HepG2细胞系.结论 该细胞系的建立为进一步研究HBVP22e的生物学功能与乙型肝炎发病机制的关系奠定了基础.     

XTP3基因融合蛋白的表达纯化及多克隆抗体制备

目的构建稳定表达乙肝病毒XTP3蛋白的原核表达载体并在大肠埃希菌中诱导融合蛋白的表达,制备兔抗XTP3蛋白多克隆抗体并检测该抗体在乙肝肝癌、正常肝组织中的作用效果。方法PCR获得XTP3基因片段,插入至pET-32a( )中构建原核表达载体pET-32a( )-XTP3,测序正确后转化大肠埃希菌BL21,IPTG诱导表达。SDS-PAGE、Western blotting分析鉴定融合蛋白的表达。利用Ni 亲和柱对表达蛋白进行纯化及柱上复性。免疫新西兰兔,制备多克隆抗体并进行ELISA、Western blotting及免疫组化验证。结果成功构建pET-32a( )-XTP3表达载体并在大肠埃希菌中诱导出高水平表达的XTP3融合蛋白,目的蛋白分子量为52kD,SDS-PAGE分析表明为包涵体表达。经亲和树脂纯化后免疫新西兰兔,成功获得融合蛋白及兔抗XTP3多克隆抗体。ELISA检测证明多克隆抗体效价>1:128000。免疫组化证实本实验中XTP3多克隆抗体在肝癌组织中的表达呈明显的细胞膜阳性,特异性良好。结论成功表达、纯化了XTP3基因融合蛋白,获得高特异性、高效价兔抗XTP3多克隆抗体,为进一步研究XTP3蛋白的生物学特性奠定了基础。     

我国登革2型病毒43株PrM-E基因的构建及其在哺乳动物细胞中的表达

目的：构建我国登革２ 型病毒４３ 株（Ｄ２－４３）的ＰｒＭ－Ｅ基因片段,观察其在哺乳动物细胞中的表达。方法：采用ＲＴ－ＰＣＲ和分子克隆技术构建ＰｒＭ－Ｅ基因片段,包括编码ＰｒＭ 的信号肽序列、完整的ＰｒＭ 蛋白和去除羧基端跨膜疏水区部分氨基酸的９７．８％ Ｅ蛋白的基因片段。用电穿孔法将构建的含有ＰｒＭ－Ｅ基因的ｐＣＭＶ－ＭＥ真核重组质粒导入哺乳动物细胞中进行表达。采用蛋白印迹和间接免疫荧光法对表达产物进行特异性鉴定。结果与结论：构建的ＰｒＭ－Ｅ基因全长２ ０１９个核苷酸,序列分析证明其核苷酸序列是正确的。ＰｒＭ－Ｅ基因在ＢＨＫ－２１ 细胞中获得高效表达,表达蛋白可与Ｄ２－４３ 多克隆抗体起特异反应,且表达蛋白主要位于细胞浆中。     

蚓激酶基因在真核细胞COS-7中的表达

目的：为了实现蚓激酶基因片段F-3，F-5在真核细胞COS-7中的表达，获得具有生物学活性的重组蚓激酶蛋白。方法：将F-3，F-5与分泌表达载体pcDNA3，1( )连接，构建重组表达质粒pcDNA-3和pcDNA-5，利用COS-7细胞进行基因F-3和F-5的瞬时表达；纤维蛋白平板法对培养液上清进行活性检测。结果：蚓激酶基因片段F-3，F-5在真核细胞COS-7中实现了表达；SDS-PAGE显示蛋白质条带，纤维蛋白平板法检测培养液上清有明显的纤溶活性。结论：蚓激酶基因片段F-3，F-5可在真核细胞COS-7中分泌表达，表达产物具有一定的纤溶活性。     

乙型肝炎病毒e抗原在肝细胞内作用蛋白AK026018亚细胞定位的研究

目的：确定肝细胞内乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)作用蛋白AK026018的亚细胞定位，初步研究该蛋白的生物学功能。方法：应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术，从HepG2细胞中扩增编码AK026018蛋白的全基因，构建真核表达载体pEGFP-AK，转染HepG2、293T细胞系，在激光共聚焦荧光显微镜下与转染空载体pEGFP-N1的细胞比较观察。结果：经限制性内切酶分析和DNA序列测定鉴定构建的重组表达载体正确。通过激光共聚焦荧光显微镜观察，转染了重组栽体pEGFP-AK的细胞绿色荧光信号较集中分布于胞浆中。而空载体pEGFP-N1转染的细胞绿色荧光信号在整个细胞中均匀分布。结论：成功分离了AK026018全基因序列并构建了真核表达载体，该基因表达产物亚细胞定位于细胞浆中。     

人前列腺特异性抗原的原核表达及多克隆抗体制备

目的：建立人前列腺特异性抗原（prostate specific antigen,PSA）的可溶性大肠杆菌表达系统,获得高活性重组人PSA及多克隆抗体,为临床相关疾病的监测、诊断和治疗提供关键材料。方法：构建可溶性表达载体pET-S1-S2-PSA质粒,采用化学法将pET-S1-S2-PSA质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）细胞,IPTG诱导BL21（DE3）细胞表达rPSA,阳离子交换层析纯化rPSA,经Western印迹鉴定后免疫大耳白兔制备PSA抗体,ELISA法检测抗体效价。结果与结论：构建了可溶性表达载体pET-S1-S2-PSA,获得了可溶性高表达rPSA的BL21（DE3）细胞株,并制备了可特异性结合天然PSA的抗体,其效价在1∶20000以上。     

人胰岛素样生长因子-1真核表达质粒的构建及其在成肌细胞中的表达

目的 :构建人胰岛素样生长因子 - 1(hIGF - 1)真核表达质粒pcDNA3.1(- ) /hIGF - 1并通过转染成肌细胞来验证其生物活性。方法 :应用DNA重组方法将编码hIGF - 1cDNA克隆于真核表达载体pcDNA3.1(- )中 ,构建pcDNA3.1(- ) /hIGF - 1真核表达质粒 ;应用阳性脂质体介导的基因转染技术 ,将真核表达质粒pcDNA3.1(- ) /hIGF - 1瞬时转染C2C12成肌细胞中 ;采用RT -PCR及免疫组化染色等方法检测hIGF - 1基因在成肌细胞中的表达情况 ;应用MTT法检测转染后细胞上清液中hIGF - 1的生物活性。结果 :将构建好的真核表达质粒pcDNA3.1(- ) /hIGF - 1转染成肌细胞后 ,hIGF - 1mRNA及蛋白表达水平明显增高 ;转染后的成肌细胞培养上清液具有促使成纤维细胞增殖的生物活性。结论 :成功构建了真核表达质粒pcDNA3.1(- ) /hIGF - 1,其转染成肌细胞后可获得较高水平hIGF - 1蛋白的表达 ,所表达出hIGF - 1蛋白具有生物学活性。     

人源抗HBsAg噬菌体抗体的筛选、鉴定及基因序列分析

目的筛选与鉴定人源抗乙肝表面抗原(HBsAg)噬菌体抗体,并对其进行基因序列分析。方法利用噬菌体表面递呈技术,从人的外周淋巴细胞中分离和扩增抗体基因,构建抗体组合文库,经亲和淘洗从该文库中筛选人源抗HBsAg噬菌体抗体,通过ELISA及竞争抑制实验鉴定其活性和特异性,并分析获得的抗HBsAg人源抗体重链和轻链基因序列。结果从第3轮淘洗洗脱下来的噬菌体感染细菌长出的菌落中挑出30个,进行ELISA检测,取A490值最高(1.47±0.08)的一株进行竞争抑制试验,结果A490为0.35±0.10,抑制率为76%,所筛出的噬菌体抗体为HBsAg的特异性抗体,酶切分析显示其包含重链和轻链基因,序列分析表明重链可变区(VH)属人免疫球蛋白VHⅠ亚群,轻链可变区(VL)属于VκⅠ和VκⅢ亚群。结论从所构建的抗体库中,筛选出能特异结合HBsAg的抗HBsAg噬菌体抗体,说明通过噬菌体抗体库筛选人源抗HBsAg噬菌体抗体在技术上是可行的,这为抗HBsAg基因工程抗体的应用以及设计针对乙型肝炎的新型靶向治疗策略奠定了基础。