大鼠脊髓损伤后坐骨神经GDNFmRNA表达变化及意义

目的：探讨大鼠脊髓损伤后GDNFmRNA在坐骨神经的表达变化及其意义。方法：Allen's方法致大鼠T13段脊髓不完全损伤后，以β-Actin为内参照物，应用半定量RT-PCR方法，观察大鼠坐骨神经在脊髓损伤前、后不同时间GDFNmRNA表达变化。结果：脊髓损伤前GDNFmRNA在大鼠坐骨神经仅有微量表达，脊髓损伤后24h表达增加4倍，72h增加15倍，7d增加3倍，10d仍高于正常水平。结论：脊髓损伤后坐骨神经高表达GDNFmRNA，是神经元通过“胞体--轴突--靶器官”途径自我保护的一种反应形式，GDNF治疗脊髓损伤时应早期用药以获得最佳效果。     

大鼠脊髓损伤后坐骨神经GDNFmRNA表达变化及意义

目的 探讨大鼠脊髓损伤后坐骨神经表达GDNFmRNA的变化及其意义。方法 Allen’s方法致伤大鼠T13段脊髓,造成不完全性脊髓损伤,截取坐骨神经,以β-Actin(β-肌动蛋白)为内参照物,应用半定量RT-PCR方法,观察大鼠坐骨神经在脊髓损伤前、后不同时间GDNFmRNA表达变化。结果 脊髓损伤前GDNFmRNA在大鼠坐骨神经仅有微量表达,脊髓损伤后24小时表达增加4倍,72小时增加15倍,7天增加3倍,10天仍高于正常水平。结论 脊髓损伤后坐骨神经高表达GDNF,是神经元通过“胞体—轴突—靶器官”途径自我保护的一种反应形式,GDNF治疗脊髓损伤时应早期用药。     

大鼠脊髓损伤后坐骨神经GDNFmRNA表达变化及意义

目的探讨大鼠脊髓损伤后坐骨神经表达GDNFmRNA的变化及其意义.方法 Allen's方法致伤大鼠T13段脊髓,造成不完全性脊髓损伤,截取坐骨神经,以β-Actin(β-肌动蛋白)为内参照物,应用半定量RT-PCR方法,观察大鼠坐骨神经在脊髓损伤前、后不同时间GDNFmRNA表达变化.结果脊髓损伤前GDNFmRNA在大鼠坐骨神经仅有微量表达,脊髓损伤后24小时表达增加4倍,72小时增加15倍,7天增加3倍,10天仍高于正常水平.结论脊髓损伤后坐骨神经高表达GDNF,是神经元通过"胞体-轴突-靶器官"途径自我保护的一种反应形式,GDNF治疗脊髓损伤时应早期用药.     

胶质源性神经营养因子对脊髓损伤后功能及前角运动神经元酶组织化学改变的

目的 探讨胶质细胞源性神经营养因子（ＧＤＮＦ）对损伤脊髓运动功能及前角运动神经元酶组织化学改变的影响。方法 改良Ａｌｌｅｎ撞击致Ｔ１３脊髓不完全损伤。蛛网膜下腔分别给予生理盐水和ＧＤＮＦ,不同时间分别：（１）测定大鼠后肢神经功能;（２）利用酶组织化学染色方法显示脊髓侧前角运动神经元中胆碱酯酶（ＣｈＥ）和酸性磷酸酶（ＡＣＰ）活性并通过计算机图像分析系统将酶活性量化、比较。结果 （１）神经功能随时间延长而逐渐恢复,ＧＤＮＦ有助于功能恢复,但３周时均未达正常标准;（２）ＣｈＥ和ＡＣＰ活性随时间延长而向正常趋近,ＧＤＮＦ显著加强了这一趋势,（３）随着ＣｈＥ水平上升和ＡＣＰ水平降低。大鼠后肢运动功能逐渐恢复,两者呈现较强的相关性。结论 （１）前角运动神经元酶学改变与神经功能恢复密切相关;（２）ＧＤＮＦ加强前角运动神经元酶     

rhGDNF对大鼠脊髓损伤后Ntyr表达影响的研究

目的研究大鼠脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）后应用人重组胶质细胞源性神经营养因子（recombinated human glial cell line derived neurotrophic factor,rhGDNF）对酪氨酸硝基化蛋白（nitrotyrosine,Ntyr）表达情况的影响。方法48只雄性SD大鼠随机分为正常组、假手术组、生理盐水对照组和rhGDNF实验组,改良Allen法致脊髓中等程度损伤,伤后1d、3d、7d、14d用免疫荧光染色法测定Ntyr的表达情况,同时评定下肢运动功能（Tarlov评分和改良Rivlin斜板）。结果伤后1d rhGDNF组Ntyr阳性神经元数量多于生理盐水对照组（P〈0．05）,伤后3d、7d、14d时较同时程生理盐水对照组明显减少（P〈0．05）。2组的运动功能评分比较：伤后1d无明显差异,伤后3d、7d、14d时rhGDNF治疗组较生理盐水对照组明显提高（P〈0．05）。结论SCI后应用rhGDNF可减少大鼠脊髓Ntyr的表达,促进其运动功能恢复。     

胶质细胞源性神经营养因子在神经系统损伤后表达变化意义

近二十年的研究表明 ,中枢神经损伤后具有可塑性 ,也能再生 ;并且在神经营养因子 (ＮＴＦｓ)作用下再生速度及质量都有显著增强[1～ 3] ,因而ＮＴＦｓ与神经系统损伤修复的研究已成为神经科学研究领域的一个“热点”。胶质细胞源性神经营养因子 (Ｇｌｉａｌｃｅｌｌｌｉｎｅｄｅｒｉｖｅｄｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒ,ＧＤＮＦ)是新近 ( 1993)发现并已克隆其基因的一种蛋白质 ,由于它的氨基酸残基的构象与转化生长因子 (ＴＧＦ β)超家族成员相同 ,而且其序列中有近 2 0 %的同源性 ,从结构上看属于ＴＧＦ β超家族远亲[4 ] 。通过…     

胶质细胞源性神经营养因子对大鼠脊髓损伤后神经元的保护作用

神经营养因子 (ＮＴＦｓ)在神经再生、突触形成以及神经损伤修复过程中起着重要的作用[1] 。胶质细胞源性神经营养因子 (ＧＤＮＦ)是目前发现的活性最强的运动神经元神经营养因子[2 ] 。本实验旨在观察外源性ＧＤＮＦ对大鼠脊髓急性压迫损伤后神经元的保护作用。一、材料与方法1.重组人ＧＤＮＦ、神经生长因子(ＮＧＦ) :第一军医大学神经生物教研室提供 ,纯度大于质量分数 90 % ,浓度为 1ｇ/Ｌ。2 .实验动物及分组 :体重 2 5 0～ 3 0 0ｇ的雄性Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ大鼠 45只 ,随机分为 3组 :生理盐水 (ＳＡＬ)组、ＧＤＮＦ组和ＮＧ…     

静脉移植骨髓间充质干细胞促进脊髓损伤后GDNF基因的表达

[目的]探讨经静脉移植骨髓间充质干细胞(MSCs)对大鼠脊髓损伤(SCI)后胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)表达的影响。[方法]MSCs提取自成年Wistar大鼠的股骨干骨髓,经原代培养、鉴定及5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)核标记。以改良Allen′s打击装置制作大鼠T10节段脊髓损伤(SCl)模型,于伤后立即缝合切口并经尾静脉注射移植MSCs。实验共分为3组MSCs尾静脉移植组(A组)、生理盐水注射组(B组)、正常对照组(C组)。术后不同时间点应用免疫组化法和逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)观察MSCs移植后的存活状态以及不同时间点GDNF基因的表达变化。[结果]免疫组化结果MSCs经尾静脉移植后在损伤脊髓平面可以检测到迁移及存活,标记细胞呈棕黄色的核标记,以损伤区域为多并向周围迁移,移植术后第14d,A组Brdu阳性细胞较多,最远于距离损伤区2.5cm处可检测到。B及C组则均未检测到阳性细胞。RT-PCR结果移植术后第1、3、5d,A组表达量呈逐渐升高趋势,B组呈一过性表达升高,C组无变化。各时间点A组GDNFmRNA的表达量明显高于B组,P<0.05。免疫组化结果移植术后第7、14、28dGDNF的表达量明显高于B组,P<0.05。[结论]骨髓间充质干细胞经尾静脉移植后可迁移至脊髓损伤区域,并上调胶质细胞源性神经营养因子基因的表达,是该移植方式修复大鼠脊髓损伤的机制之一。     

嗅鞘细胞移植对大鼠损伤脊髓组织中BDNF表达的影响及意义

目的 观察嗅鞘细胞(OEC)移植治疗大鼠脊髓损伤的作用以及脊髓损伤组织中脑源性神经营养因子(BDNF)表达的变化,从神经营养因子角度探讨OEC移植修复脊髓损伤的机制.方法 分离和培养绿色荧光蛋白转基因大鼠的OEC,备移植用.取SD大鼠制备脊髓损伤模型,用随机数字表法将建模成功后的SD大鼠分为2组.实验组:建模成功后立即进行OEC移植,移植部位为脊髓损伤处及其首尾正中血管的左右两侧;对照组:用DMEM/F12培养液替代OEC悬液,操作同实验组.移植后对各组大鼠的运动功能进行评分,每周1次.采用实时逆转录聚合酶链反应检测BDNF mRNA的表达,采用免疫组织化学法检测BDNF蛋白的表达,取正常SD大鼠BDNF mRNA和蛋白的检测水平作为正常对照.结果 移植后两组大鼠的运动功能均逐渐改善,移植后21 d时,实验组大鼠运动功能评分明显高于对照组(P＜0.05).移植后OEC存活良好,实验组损伤的脊髓组织周围分布有大量的呈绿色荧光的OEC.移植后21 d时,实验组BDNF mRNA和蛋白的表达水平显著高于对照组和正常对照组(P<0.05),而对照组也显著高于正常对照组(P<0.05).结论 OEC移植可明显修复大鼠的脊髓损伤,其机制可能与OEC通过增强损伤脊髓组织中BDNF mRNA和蛋白的表达,改善局部微环境有关.

Abstract：

Objective To observe the expression of brain-derived neurotrophical factor (BDNF) in injury spinal cord after transplantation olfactory ensheathing cells (OECs), and to investigate the mechanism of OECs repairing spinal cord injury.Methods OECs from GFP transgenic rats were separated and cultured for transplantation. Spinal cord injury rats were separated two groups by random digits table. In experimental group, OECs suspension were transplanted into injured spinal cord following spinal cord injury. In control group, DMEM was transplanted into the injured spinal cord after spinal cord injury. Motor function was evaluated per week after transplantation. The expression levels of BDNF mRNA and protein were detected by using RT-PCR and immunohistochemistry respectively, and compared with those from normal SD rats.Results Motor function of two groups was improved gradually after transplantation. The motor function scores in experimental group was obviously higher than in control group at 21st day after transplantation (P<0.05). A lot of survival GFP OECs distributed around impaired myeloid tissue. At 21st day after transplantation, BDNF mRNA and protein expression in experimental group were strongest (P<0.05), and stronger in control group than in normal group (P<0.05).Conclusion The transplantation of OECs can repair the injured spinal cord by increasing the expression of BDNF mRNA and protein to improve local microenvironment.     

阳离子脂质体介导GDNF体内转基因对脊髓损伤后运动神经元的保护作用

目的 :观察阳离子脂质体介导的胶质细胞源性神经营养因子 (GDNF)体内转基因对大鼠脊髓损伤 (SCI)后伤区脊髓前角运动神经元的影响。方法 :采用改良Nystr m法制备大鼠胸段脊髓后路压迫损伤模型 ,将阳离子脂质体DC Chol和重组质粒 pEGFP GDNFcDNA混合后直接注入大鼠损伤脊髓。利用RT PCR技术和荧光显微镜检测GDNF体内转基因的表达。应用尼氏染色、酶组织化学染色方法观察前角运动神经元死亡的数目和胆碱酯酶(CHE)及酸性磷酸酶 (ACP)的变化。结果 :1周后在注射局部GDNFmRNA和GDNF有较高表达。GDNF体内转基因早期 (1～ 4周 )SCI区前角运动神经元死亡的数目减少 ,CHE和ACP变化的幅度降低。结论 :GDNF体内转基因能减少脊髓不完全性损伤后引起的神经元坏死 ,阳离子脂质体介导GDNF体内转基因治疗创伤性SCI的方法是可行的。     

胶质细胞源性神经营养因子体内转基因对皮质脊髓束再生的影响

目的通过非病毒载体阳离子脂质体介导,探讨胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因体内转染对成年大鼠脊髓损伤后皮质脊髓束再生的影响.方法采用NystrOm法制备大鼠胸髓后路压迫损伤模型,压迫重量为50 g,时间为5 min,造成大鼠胸段脊髓急性重度损伤.用微量注射器将阳离子脂质体DC-Chol 6μl和重组质粒pEGFP-GDNF cDNA 2μg混合后注入大鼠损伤脊髓.应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术和荧光显微镜检测GDNF体内转基因后在局部的表达,通过辣根过氧化物酶(HRP)顺行追踪技术和神经微丝(NF)免疫组织化学活性的变化来评价GDNF基因体内转染对大鼠皮质脊髓束再生的影响.结果 GDNF基因体内转染1周后显示在基因注射局部有转录和蛋白水平表达.脊髓损伤后4周在损伤区可见较多的皮质脊髓束再生,损伤区NF阳性轴突数(524.33±80.55)/低倍视野较对照组(309.84±56.65)/低倍视野明显增多(P＜0.01).结论阳离子脂质体介导GDNF体内转基因能促进近端皮质脊髓束再生和神经骨架蛋白的修复.     

大鼠牵张性脊髓损伤后细胞凋亡及相关基因表达的实验研究

目的观察大鼠牵张性脊髓损伤后细胞凋亡现象,检测脊髓损伤后凋亡相关基因的表达。方法大鼠脊髓T13～L2经牵张损伤,皮层体感诱发电位(CSEP)监测P1N1波幅下降至术前波幅70%后,分别于术后30min、6h、1、4、7、14、21d处死大鼠,取材(n=4)。应用流式细胞仪、原位末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导dUTP标记(TUNEL)技术观察脊髓细胞凋亡情况,用免疫组化检测p53、bax和bcl2的表达。结果流式细胞仪及TUNEL法检测显示,损伤组术后6h凋亡细胞开始增多,术后7d细胞凋亡率达高峰,随后开始回落,持续21d,与空白对照组及椎板切除组比较,差异有显著性意义(P<005,001)。TUNEL法染色显示,白质中出现大量胶质细胞凋亡。免疫组化染色显示损伤组术后6h开始,p53、bax和bcl2阳性表达开始增多,p53阳性细胞数术后4d达高峰,bax和bcl2术后7d达高峰,损伤组各时相点的阳性表达与空白对照组与椎板切除组比较差异有显著性意义(P<005,001)。结论牵张性脊髓损伤后存在细胞凋亡现象,从形态上看包括神经元和胶质细胞凋亡,细胞凋亡是牵张性脊髓损伤继发损害中细胞死亡的一种重要形式,也是继发损伤期的重要病理变化。凋亡相关基因p53、bax大量表达,可能在脊髓细胞凋亡过程中起重要作用。     

胶质细胞源性神经营养因子对大鼠脊髓损伤后运动功能的影响

目的:研究胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）对大鼠脊髓损伤后后肢运动功能恢复的影响。方法:采用改良Nystr(?)m法后路压迫大鼠胸段脊髓造成损伤模型,经蛛网膜下腔置管局部连续给予NGF （10μg/d）或GDNF（10μg/d）1周,对照组给予生理盐水。伤后4周3组分别观测:①伤段脊髓残存组织面积;②采用斜板试验和运动功能评分观察大鼠后肢运动功能恢复情况。结果:大鼠脊髓损伤后4～14d,GDNF治疗组后肢运动功能评分明显高于NGF组和生理盐水对照组（P<0.05）。伤后28d GDNF组伤段残存脊髓组织面积大于对照组和NGF组（P<0.01）。结论:外源性GDNF能减少脊髓损伤后伤区的坏死、萎缩并促进大鼠后肢运动功能的早期恢复。     

转染胶质细胞源性神经营养因子基因的骨髓间充质干细胞对大鼠脊髓损伤后神经轴突再生的影响

目的:探讨转染胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因的大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植对大鼠脊髓损伤后神经轴突再生的影响。方法:取SD雌性大鼠的双侧股骨,冲洗髓腔分离培养得到的BMSCs,通过荧光素标记技术检测细胞表面标志物CD29、CD90、CD34、CD45,以确认是否得到BMSCs。构建GDNF过表达慢病毒用以感染BMSCs,加入感染分数分别为10、50、80、100、150、200的重组慢病毒悬液。在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达情况以表达细胞数量,评价转染效果,Western blot检测转染后GDNF在BMSCs中的表达,以四唑蓝比色法(MTT)法检测转染GDNF基因的BMSCs的细胞活力。将50只SD大鼠通过Allen′s打击法制备脊髓打击伤模型,造模成功后随机分为三组:A组(20只)为单纯BMSCs组,使用微量注射器移植未转染的BMSCs;B组(20只)为BMSCs转染组,使用微量注射器移植转染GDNF基因的BMSCs;C组(10只)为模型对照组,造模后脊髓内注射DMEM培养基。于造模后7d、14d、28d对大鼠进行BBB运动功能评分。各组均于造模后7d、14d、28d各取5只麻醉处死灌注取材后行HE染色并镜下观察。A、B两组采用免疫组织化学染色观察GFAP、NSE、NF-200在脊髓内的表达,以评估神经轴突生长情况。结果:经分离培养得到的细胞呈长纺锤状,以类似成纤维细胞样集落生长。流式细胞术测定结果示所培养的细胞阳性高度表达CD29、CD90,未表达CD34、CD45,表明分离培养所得细胞为BMSCs。当MOI=100时,转染12h后,BMSCs显著表达GFP,提示转染成功。Western blot结果示GDFP表达情况良好。MTT法显示转染7d后BMSCs组细胞活力明显高于未转染BMSCs组。术后7d时,三组BBB评分无显著差异。术后14d,B组的BBB评分5.80±0.19分与A组3.60±0.18分及C组3.10±0.14分相比均有显著性差异(P0.05)。术后28d,B组的BBB评分11.90±0.28分与A组8.30±0.29分及C组5.70±0.18分相比有显著性差异(P0.05)。GFAP、NSE、免疫组化染色光密度统计结果均显示A组和B组有显著性差异,B组明显优于A组,具有统计学意义(P0.05)。NF-200神经纤维长度统计结果提示B组为89.98±28.31μm,A组为23.64±13.45μm,两组之间存在显著差异(P0.05)。结论:GDNF转染BMSCs具有较高的细胞活性,能够提升BMSCs促进神经轴突再生的能力。     

大鼠脊髓损伤后胶质细胞生长因子的mRNA表达变化

目的：探讨胶质细胞牛长凼子（glial growth factor，GGF）在大鼠脊髓损伤后的表达变化及意义。方法：采川改良Allen’s脊髓损伤打击模型，用逆转录聚合酶链式反应法（RT-PCR）检测胚胎大鼠脊髓内、正常成年大鼠脊髓内以及脊髓损伤后不同时间点伤段脊髓组织中GGF的mRNA表达结果：GGF在成年大鼠正常脊髓内低水平表达，在胚胎脊髓中高水平表达。大鼠脊髓损伤后GGF的mRNA表达持续降低，在脊髓损伤后5d达到最低峰，之后GGF的mRNA表达可逐渐恢复。结论：GGF在脊髓乍长发育中起重要作用：大鼠脊髓损伤后GGF的表达降低可能与脊髓损伤后少突胶质细胞大量死亡或凋亡有关．与脊髓损伤后轴突无法再生、脱髓鞘的髓鞘再生困难有关。     

碱性成纤维细胞生长因子对大鼠牵张性脊髓损伤后细胞凋亡及基因表达的影响

目的观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对牵张性脊髓损伤后细胞凋亡及相关基因表达的影响,探讨bFGF对脊髓损伤保护作用的分子机制。方法大鼠脊髓T13～L2经牵张损伤,皮层体感诱发电位(CSEP)监测P1～N1波幅下降至术前波幅70%后,于损伤平面以下经蛛网膜下腔置细导管,治疗组分别于术后即刻1、2、3、4、8、12及24h经细导管注入bFGF溶液20μl(含bFGF20μg),对照组在相同时间注入等量生理盐水,然后于术后6h、1、4、7、14及21d处死取材,采用原位末端标记法(TUNEL)及免疫组织化学观察脊髓细胞凋亡及p53、bax、bcl2表达的变化情况,应用电生理观察大鼠的神经功能情况,并进行对比分析。结果术后4、7、14、21d,治疗组TUNEL法染色阳性细胞数明显低于对照组(P<0.01)。术后4、7、14、21d,治疗组p53、bax的阳性细胞数明显低于对照组,治疗组各时相点bcl2的阳性细胞数明显高于对照组,治疗组大鼠的神经功能恢复与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。结论bFGF能通过抑制p53、bax蛋白的表达及促进bcl2蛋白表达来抑制牵张性脊髓损伤后细胞凋亡,从而保护损伤的脊髓组织,这可能是bFGF对脊髓损伤具有的保护作用机制之一。