p73基因在人非小细胞肺癌组织中的表达

目的　研究人非小细胞肺癌中p73基因的mRNA表达状况 ,并探讨其表达水平与肿瘤各项临床病理指标间的相关性。方法　应用半定量RT PCR方法检测人非小细胞肺癌组织、相应癌旁肺组织及远癌肺组织中p73的mRNA表达。结果　p73基因的表达水平及表达阳性率在肺癌组织中为 87.5 % (2 8/32 )明显高于相应的癌旁肺组织和远癌肺组织 (P <0 .0 1) ;不同临床病理学类型、分化程度及TNM分期的肺癌组织间p73mRNA的表达差异无显著性 (P >0 .0 5 )。结论　p73基因在人非小细胞肺癌组织中的表达显著上调。     

肺癌中细胞凋亡水平和p73基因的转录表达的研究

目的：通过观察肺癌癌组织,对应癌旁组织和远癌肺组织中细胞凋亡及p73基因转录表达水平的变化,探讨细胞凋亡及P73基因转录表达水平与肺癌发生,发展的关系。方法：采用TUNEL及RT－PCR技术检测32例非小细胞肺癌癌组织,癌旁组织和7例肺良性病变组织,以及对应正常肺组织细胞凋亡和P73 mRNA的表达水平,并结合临床病理学资料进行统计学分析,结果：（1）肺癌组织中的凋亡指数明显高于癌旁肺组织和远癌肺组织（P＜0．01）,细胞凋亡水平与肺癌组织学类型,分化程度和P－TNM分期无明显关系（P＞0．05）;（2）肺癌组织中p73 mRNA表达水平和表达率明显高于癌旁肺组织,远癌肺组织和肺良性病变组织（P＜0．01）;（3）组织中凋亡指数的升高和P73基因转录表达水平的增加呈显著的正相关（P＜0．01）。结论：肺癌组织中存在细胞凋亡水平的升高和P73基因的过度转录表达。     

黑素瘤抗原-a基因在煤焦沥青烟气诱发小鼠肺癌组织中的表达及其意义

目的：探讨煤焦沥青（CTP）烟气诱发小鼠肺癌组织中黑素瘤抗原－a(mage-a)基因mRNA的表达及其意义。方法：CTP烟气诱发小鼠肺癌，提取癌组织中RNA，用逆转录－巢式聚合酶链反应（RT－PCR）方法对癌组织和相应癌旁组织mage-a mRNA表达情况进行研究；pUC18质粒克隆，大肠杆菌DH5α转化；PE－377DNA测序仪对2个阳性克隆中的目的基因片段进行DNA序列测定。结果：实验组29只小鼠中8只诱发出肺癌（8／29）；8只小鼠肺癌中，有5只癌组织mage-a mRNA表达阳性（5／8）；相应的癌旁组织均未表达。DNA序列测定证明扩增产物中目的基因片段均为mage-a cDNA序列。结论：小鼠肺癌组织中mage-a mRNA呈高比例表达，CTP烟气诱发小鼠肺癌可能是MAGE－A抗原肺癌免疫治疗的理想模型。     

人肺腺癌细胞单羧酸转运泵基因的克隆及基因序列分析

目的 克隆人肺腺癌细胞单羧酸转运泵基因编码序列并对此序列作同源性分析。方法 通过ＲＴ－ＰＣＲ方法克隆人肺腺癌Ａ５４９细胞单羧酸转运泵基因ｄＤＮＡ编码序列,应用ＰＣＲ、四色荧光、双脱氧终止法测序;通过Ｇｅｅｂａｎｋ数据库应用分析软件对克隆基因序列进行同源性分析。结果 应用ＲＴ－ＰＣＲ方法克隆出人肺癌细胞的单羧酸转运泵基因;肺癌民人心肌细胞单羧酸转运泵基因第一亚型的ｃＤＮＡ编码序列具有主度同源性。结论     

荧光定量RT PCR法检测OATP B和OATP D mRNA表达

目的建立荧光定量RT—PCR检测肺癌及正常肺组织中人类有机阴离子转运多肽(organic anion transporting polypeptide, OATP) OATP B、OATP D mRNA表达的方法,了解肺癌和正常肺组织中OATP B、OATP D mRNA的表达水平。 方法利用RT PCR方法从肺癌及正常肺组织中扩增出目的基因片段,用TA克隆的方法将基因片段插入到PGEM T质粒载体中,在Line Gene荧光定量检测系统上建立检测OATP B、OATP D mRNA表达的标准曲线,并通过40例肺癌及正常肺组织标本进行验证。结果成功构建了OATP基因的质粒重组子,建立了在mRNA水平定量检测OATP B、OATP D基因的标准曲线,相关系数为0.998。以荧光定量RT—PCR法检测, OATP B、OATP D 的mRNA在肺癌及正常肺组织中均有表达,且肺癌中OATP B、OATP D mRNA的表达水平高于正常肺组织（P＜0．05）。 结论成功建立了荧光定量RT PCR检测OATP B、OATP D mRNA表达的方法,检测结果用绝对拷贝数表示,定量准确可靠,敏感性高。     

MCT1、CD147在非小细胞肺癌中的表达及其相关性研究

目的探讨单羧酸转运泵家族1(MCT1)、CD147(EMMPRIN)在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达规律及其在NSCLC发生、发展、预后中的意义。方法取经病理确诊的56例NSCLC患者癌组织、癌旁组织(距肿瘤边缘>5 cm)和20例肺良性病变组织,并将癌旁组和肺良性病变组划为对照组与肺癌组比较,采用免疫组化法和实时荧光定量PCR法检测MCT1、CD147蛋白及mRNA表达,进行定性和定量分析。结果①在NSCLC组织中MCT1、CD147表达均明显高于癌旁组织及肺良性肿瘤差异具有统计学意义(P<0.05);②MCT1在肺癌细胞膜中表达、CD147表达呈正相关(P<0.05);③MCT1、CD147表达与NSCLC患者的肿瘤组织类型、淋巴转移均有关(P<0.05),另外MCT1(细胞膜)蛋白表达还与肿瘤分化程度及吸烟史有关(P<0.05),MCT1mRNA表达还与肿瘤分化程度有关(P<0.05)。结论在NSCLC患者组织中MCT1、CD147的表达具有显著相关性。     

Expression of relevance and significance of MCT1,CD147 in non-small cell lung cancer

目的 探讨单羧酸转运泵家族1(MCT1)、CD147(EMMPRIN)在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达规律及其在NSCLC发生、发展、预后中的意义.方法 取经病理确诊的56例NSCLC患者癌组织、癌旁组织(距肿瘤边缘＞5 cm)和20例肺良性病变组织,并将癌旁组和肺良性病变组划为对照组与肺癌组比较,采用免疫组化法和实时荧光定量PCR法检测MCT1、CD147蛋白及mRNA表达,进行定性和定量分析.结果 ①在NSCLC组织中MCT1、CD147表达均明显高于癌旁组织及肺良性肿瘤差异具有统计学意义(P＜0.05);② MCT1在肺癌细胞膜中表达、CD147表达呈正相关(P＜0.05);③ MCT1、CD147表达与NSCLC患者的肿瘤组织类型、淋巴转移均有关(P＜0.05),另外MCT1(细胞膜)蛋白表达还与肿瘤分化程度及吸烟史有关(P＜0.05),MCT1 mRNA表达还与肿瘤分化程度有关(P＜0.05).结论 在NSCLC患者组织中MCT1、CD147的表达具有显著相关性.     

肺癌组织中黑色素瘤抗原-3基因mRNA的表达

目的：检测肺癌组织中黑色素瘤抗原－3基因（MAGE－3）mRNA的表达，方法；用逆转录－套式聚合酶链反应（RT－PCR）对31例肺癌患者癌组织和相应癌旁组织MAGE－3 mRNA表达情况进行测定；PE－377DNA测序仪对5例10个RT－PCR扩增产物中的目的基因片段进行DNA序列测定。结果：31例肺癌患者癌组织中26例表达MAGE－3 mRNA，阳性率为83.9%；相应的癌旁组织均未表达。DNA序列测定证明PCR扩增产物中目的基因片段均为MAGE－3 cDNA序列，所测5例样本中4例样本有2个相同位置的碱基发生了点突变，导致一个氨基酸残基改变。结论：（1）MAGE－3 mRNA在肺癌中呈高比例表达，提示此抗原有可能作为肺癌患者免疫治疗的靶抗原；（2）我国肺癌患者中存在MAGE-3基因个别位点的变异。     

1个新的胰腺癌相关基因的筛选和初步鉴定

目的 筛选和鉴定胰腺癌相关基因.方法 提取胰腺癌和癌旁正常胰腺组织中的RNA和mRNA,应用抑制消减杂交技术(SSH)构建消减cDNA文库.采用随机数字表法挑选有插入片段的阳性克隆进行测序及同源性分析.应用RT-PCR和Northern blot检测新基因在12例胰腺癌和癌旁正常胰腺组织以及4种胰腺癌细胞株(PaTu8988、SW1990、BxPC-3、AsPC-1)中的表达情况.结果 随机挑取50个直径＞1 mm的白色克隆进行PCR扩增分析,其中47个克隆有插入片段,克隆阳性率为94%.对47个有插入片段的阳性克隆进行测序, 得到42个可用序列.同源性分析发现41个为已知基因,1个为无任何功能线索的未知基因,可能代表了新基因.RT-PCR显示新基因在12例胰腺癌组织和4种胰腺癌细胞株中均表达,而在正常胰腺组织中未见表达.Northern blot分析得到相同的结果.结论 应用SSH技术成功构建了人胰腺癌抑制消减cDNA文库,并筛选出1条新的胰腺癌相关基因.新基因与胰腺癌的发生、发展密切相关,可作为胰腺癌诊断和基因治疗的分子靶标.     

hTERT启动子的克隆及其在端粒酶阳性肺癌细胞中的靶向转录活性研究

目的克隆人端粒酶催化亚单位（hTERT）启动子序列片段,并探讨hTERT启动子在肿瘤细胞中的靶向转录活性。方法用PCR方法克隆293细胞DNA hTERT 5＇端上游旁侧序列长约1．1kb的启动子片段,经测序无误后将其克隆入荧光素酶报告质粒pGL3-Basic的荧光素酶基因上游,构建pGL3-hTERTp重组质粒,瞬时转染肺癌细胞A549、SPC-A-1、LTEPα-2、NCI-H446、YTMLC-9、GLC-82、95D、A2以及正常成纤维细胞MRC-5,检测荧光素酶活性。并用RT-PCR和TRAP-ELISA方法分析各细胞hTERT mRNA的表达及其端粒酶活性。结果琼脂糖电泳显示PCR克隆的hTERT启动子片段长约1．1kb,DNA测序结果与GenBank中hTERT启动子DNA序列完全一致,位于hTERT基因转录起始位点上游1126bp（-1126～-40）,片段长度为1084bp;采用双酶切和PCR两种方法鉴定pGL3-hTERTp重组质粒,均显示构建成功;hTERT mRNA和端粒酶活性在肺癌细胞中呈不同水平的表达,而正常细胞则均为阴性;瞬时转染及荧光素酶活性检测实验显示,hTERT启动子片段在所有检测的肺癌细胞中均有高低不同的转录活性,在正常细胞MRC-5无转录活性。结论克隆的1084bp大小的hTERT启动子片段在hTERT mRNA和端粒酶阳性的肺癌细胞中有特异性的转录活性,hTERT启动子可能作为靶向性基因治疗的调控元件。     

不同转移潜能人肺癌细胞系KAI1基因的表达

目的:探讨KAI1基因与人肺癌细胞系转移潜能的关系.方法:利用逆转录-PCR和Northern blot杂交法分析不同转移潜能人肺癌细胞系中KAI1 mRNA的表达,并用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)检测与突变的关系.结果:在高转移潜能细胞系PG中KAI1 mRNA表达降低,在无转移潜能的PAa细胞中KAI1的表达量比PG细胞高10倍以上(积分光密度比值分别为0.7313和0.0549).PCR-SSCP结果显示在PG细胞KAI1基因第7外显子出现异常改变.结论:肺癌细胞的转移潜能可能与KAI1基因表达量有关,KAI1基因的低表达可能由基因突变所致.     

人结肠癌组织环加氧酶-2 mRNA剪接异构体片段分离与克隆

目的 探讨人结肠癌组织中是否存在环加氧酶-2(COX-2)选择性剪接异构体的表达及其可能意义。方法 针对人COX—2 DNA第7、8外显子序列，设计一对全新引物，并采用RT—PCR技术，从结肠癌组织中分离COX—2 mRNA，然后对电泳条带进行克隆、测序和分析。结果 正常结肠组织和结肠癌组织均发现COX—2目的条带(252bp)，但结肠癌组织则出现了一条新的电泳带(534bp)，经克隆和测序证实，该条带除目的条带的COX—2 DNA的第7、8外显子序列外，还包含第7、8外显子间的内含子序列，即保留的内含子(282bp)。根据阅读框推测，在保留的内含子第48～50碱基出现终止密码。结论 首次发现结肠癌组织中存在COX—2基因的选择性剪接异构体(Genbank accession number：BU493602，AY1512980)，其所编码蛋白可能较已报道的COX—2酶蛋白小，且蛋白质的C末端缺少阿斯匹林作用位点。     

凋亡抑制基因survivin表达载体的构建及其在HepG2中的表达

目的:克隆细胞凋亡抑制蛋白Survivin(SVV)的编码序列,构建含SVV基因的真核细胞表达载体并在肝癌细胞系HepG2中表达,为进一步研究该基因在肝癌发病中的作用奠定基础. 方法:根据已发表的SVV基因的核苷酸序列设计并合成一对引物,以HL-60细胞系抽提的RNA为模板进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),扩增产物用BamHI和XhoI双酶酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.0中,用限制性内切酶酶切重组质粒pcDNA3.0-SVV和DNA序列测定进行鉴定. 用脂质体法将pcDNA3.0-SVV导入肝癌细胞系HepG2中,G418选择培养,经免疫组化法和RT-PCR鉴定其表达. 结果:RT-PCR扩增出长445 bp的特异性片段,经克隆至pcDNA3.0后酶切鉴定证实,并测序表明序列与GenBank报道完全一致. pcDNA3.0-SVV在HepG2细胞中有稳定表达. 结论:成功克隆了SVV的编码序列,构建了其真核细胞表达载体pcDNA3.0-SVV,有助于对SVV基因在肝癌发生中的致瘤机制做进一步研究.     

人肺癌细胞NHE-1基因部分正调控序列的克隆

目的 克隆人肺癌细胞Na∧ /H∧ 交换泵-1（NHE-1）基因上游正调控序列部分,为进一步将该片段导入肺癌细胞株,竞争性结合转录因子,达到抑制细胞内NHE-1基因的表达奠定基础。方法 采用PCR技术从人肺癌A549细胞基因组中扩增长约170bp的NHE-1基因调控序列中起正调控作用的片段。在上、下游引物的5′-端带上BanHI和EcoRI酶切位点。然后将该片段连接到pUC18载体上,最后对产生的重组子进行酶切、PCR和测序鉴定。结果 经酶切及PCR鉴定,所克隆的目的片段大约为180bp,而NDA测序证实克隆并插入到载体中的片段为目的的片段,长度为168bp,与报道的序列比较缺失2个t。结论 本实验已成功地克隆了人肺癌细胞NHE-1基因调控序列中正调控序列片段。     

人骨骼肌TnI-fast基因克隆和体外表达

目的：构建人骨骼肌TnI-fast基因分泌型真核表达载体，为利用TnI-fast基因进行抗肿瘤血管生成基因治疗奠定基础。方法：采用PCR和RT－PCR制备TnI-fast cDNA，构建TnI-fast基因克隆质粒，测序证实后将TnI-fast cDNA插入到pSecTag2B构建分泌型重组真核表达质粒。然后用TnI-fast基因重组表达质粒转染COS－1细胞，检测TnI-fast基因体外表达。结果：DNA测序证实，我们从人骨骼肌总RNA和cDNA文库中扩增的TnI-fas cDNA序列与NCBIGenebank TnI-fast cDNA序列完全一致。ELISA检测证实，TnI-fast/pSec Tag2 B转染后目的基因可在真核细胞中分泌表达。结论：本研究成功地构建了TnI-fast基因重组表达质粒，可进一步用于抗肿瘤血管生成基因治疗动物实验。     

Real time RT-PCR定量检测AFP mRNA表达水平方法的建立

目的　建立realtime逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)检测AFPmRNA表达水平方法。方法　提取BEL740 2细胞总RNA ,进行RT PCR扩增并纯化AFP基因片段 ,构建重组质粒 ,建立realtimeRT PCR检测AFPmRNA表达水平方法。结果　重组质粒的阳性克隆效率为 81.8% ,经酶切鉴定 ,目的基因片段已插入PMD 18T载体内 ,得到realtimeRT PCR动力学曲线。结论　成功建立了realtimeRT PCR定量检测AFPmRNA表达水平方法。     

人尿酸转运蛋白基因的克隆与序列分析

目的 获得编码人尿酸转运蛋白(humanuricacidtransporter,hUAT)的全长基因。方法 从人肾小管上皮细胞株(HK-2)中提取总RNA,根据Genbank中hUAT基因序列设计特异性引物,然后通过RT-PCR法扩增目的片段。所得目的片段酶切后与载体pEGFP-C1连接,经酶切及序列分析鉴定。结果 成功扩增出980 bp的hUAT全长基因,克隆到pEGFP-C1载体后酶切分析结果与预期一致,序列分析结果与Genbank上公布的hUAT序列完全一致。结论 成功克隆出hUAT基因,序列分析结果完全正确,为对该基因进一步研究奠定了基础。     

Effect of antisense transfecting of monocarboxylate transporter gene on biological characteristics of lung adenocarcinoma A549 cells

Objective: To study the influence of transfecting antisense expression vector of the first subtype of the monocarboxylate transporter (MCT1) gene into lung cancer cells on pHi regulation, lactate transportation and cell growth. Methods: MCT1 antisense gene recombinant vector was introduced into human lung cancer cell line A549 by electroporation. The transfected A549 cells resistant to G418 were selected. Positive clones were examined by using PCR. The changes of intracellular pH and lactate were examined with spec-trophotometric method. Cell growth was studied with cell growth curve. Results: Intracellular pH and lactate were remarkably decreased in the cells transfected pLXSN-MCT1 in comparison with A549 cells without transfection (P<0. 001). The growth of A549 cells transfected pLXSN-MCTl was also inhibited remarkably. Conclusion: MCT1 gene may play an important role in pHi regulation, lactate transportation and cell growth in tumor cells.     

逆转录多聚酶链反应检测角蛋白19mRNA表达方法的建立

目的：探讨角蛋白１９（Ｋ１９）逆转录多聚酶链反应（ＲＴＰＣＲ）方法检测肿瘤隐匿性微小转移灶。方法：检测Ｌ７８、ＳＷ４８０、Ｋ５６２细胞株，正常人外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）及肺癌患者骨髓细胞（ＢＭＭＣ）中特异性的Ｋ１９ｍＲＮＡ表达，并与病理学和免疫组织化学方法进行比较。结果：可在１０６个ＰＢＭＣ中检测到１个Ｋ１９阳性细胞的Ｋ１９ｍＲＮＡ表达，而正常人ＰＢＭＣ未见表达。在４例肺癌患者ＢＭＭＣ中，３例Ｋ１９呈阳性，与病理学及免疫组化结果相同。１例Ｋ１９呈阳性而免疫组化为阴性。结论：本方法特异、敏感、快速，可用于检测外周血、骨髓及淋巴结中鳞癌、腺癌的隐匿性微小转移灶