人IL-1 Ra基因真核表达载体的构建及体外转染大鼠骨髓间充质干细胞

目的:构建人IL-1Ra真核表达载体,体外转染大鼠骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)。方法:从PHA活化的人外周血单个核细胞中提取总RNA,RT-PCR法获得hIL-1Ra cDNA,经HindⅢ、EcoRⅠ双酶切,定向克隆到真核表达载体pcD-NA3。经酶切分析及PCR鉴定后,脂质体介导下体外转染大鼠BM-MSCs,免疫荧光法检测hIL-1Ra在大鼠MSCs的表达。结果:获得570 bp大小的IL-1Ra cDNA片段;经酶切分析、PCR鉴定及DNA测序,证实IL-1Ra cDNA定向插入pcDNA3质粒,目的序列与GenBank源序列完全一致;脂质体介导转染48h后,免疫荧光检测到hIL-1Ra在大鼠MSCs的表达。结论:成功构建pcDNA3-hIL-1Ra真核表达载体并在大鼠BM-MSCs中表达,为进一步的hIL-1Ra基因修饰MSCs研究提供了实验基础。     

小鼠4-1BBL基因真核表达载体构建及其在COS-7细胞中的表达

目的：构建含小鼠4-1BBL编码区cDNA序列的真核表达载体，并检测其在COS-7细胞中的表达。方法：将目的基因4-1BBL克隆人pUCl9载体中并进行酶切鉴定和DNA序列测定。亚克隆入真核质粒pIRES2-EGFP，构建真核表达载体pIRES2-EGFP-m4-1BBL。用脂质体法将重组质粒转入COS-7细胞，以RT-PER和观察细胞内荧光的方法检测m4-1BBL的表达。结果：酶切鉴定和序列分析证实，重组质粒含有人4-lBBL全长cDNA编码序列，转染实验表明4-lBBL基因能在COS-7细胞中表达。结论：鼠4-1BBL全长cDNA基因真核表达载体构建及其在COS-7中的表达均获成功，为进一步研究奠定了基础。     

pcDNA3.1(-)/PSMA7真核表达质粒的构建及其在A549细胞中的表达

目的 构建pcDNA3.1(-)/PSMA7真核表达质粒并建立人肺腺癌细胞株A549的稳定表达株.方法 采用RT-PCR法从正常人支气管上皮细胞株HBE135-E6E7中克隆得到PSMA7 cDNA全长序列,将之与pMD18-T载体连接.双酶切和测序鉴定后,再将PSMA7片段亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)上.构建好的pcDNA3.1(-)/PSMA7真核表达质粒经双酶切和测序鉴定后,经脂质体转染法转入A549细胞株中,经CA18筛选,得到阳性克隆细胞株,再用RT-PCR及Westem blotting法检测转染后PS-MA7的mRNA及蛋白表达水平.结果 pcDNA3.1(-)/PSMA7质粒经双酶切鉴定和DNA测序证实.目的 基因PSMA7的序列完全正确,真核表达质粒构建成功.RT-PCR检测显示,转染pcDNA3.1(-)/PSMA7组的PSMA7 mRNA表达水平(2.698±0.661)明显高于未转染组(1.243±0.176)和转染pcDNA3.1(-)组(1.198±0.514,P<0.05),后两者间无明显差异.Western blotting检测同样显示,转染pcDNA3.1(-)/PSMA7组的蛋白表达水平(1.978±0.661)明显高于未转染组(0.891±0.234)和转染pcDNA3.1(-)组(0.782±0.375,P<0.05),后两组间亦无明显差异.结论 成功构建了PSMA7基因的真核表达质粒,并建立了稳定表达PSMA7的A549细胞株,为后续研究奠定了基础.     

人LDLR基因的克隆及在Hepa1-6细胞中的表达

目的 :从能感染HCV的人肝癌细胞HepG2中克隆出人LDLR基因 ,构建其真核表达质粒 ,并在小鼠肝癌细胞Hepa1 6中进行表达。方法 :从HepG2中提取总RNA ,采取逆转录PCR(RT PCR)方法得到人LDLR的cDNA。将获得的人LDLR基因克隆到真核表达载体pcDNA3中 ,进行酶切和序列鉴定。将重组质粒pcDNA3 hLDLR和空载体转入Hepa1 6 ,G4 18筛选 ,并用RT PCR和FACS检测人LDLR基因转录和蛋白的表达。结果 :人LDLR的cDNA已插入载体pcDNA3构建成真核表达质粒pcDNA3 hLDLR ,双酶切和测序表明 ,克隆的人LDLR与已登录GenBank的序列存在核苷酸多态性 ,但编码的氨基酸序列完全一致 ,该序列的GenBank登录号为gi|2 16 2 96 4 7|gb|AY114 15 5 .1,并且真核表达质粒的构建正确。用脂质体介导的方法转入Hepa1 6后 ,用RT PCR和FACS检测表明 ,细胞可表达人LDLR。结论 :成功地构建了真核表达质粒pcDNA3 hLDLR ,为进一步研究HCV和人LDLR的相互作用 ,以及建立可能的HCV细胞感染模型奠定了基础。     

免疫组化研究白介素1和白介素1受体拮抗剂在人发育骨与软骨中的表达

为观察白介素1（IL-1）和白介素1受体拮抗剂（IL-1Ra）在人发育骨与软骨组织中的表达及分布,认识IL-1系统在人发育骨与软骨中的作用,用组织学及免疫组化技术,对临床经过石蜡包埋的人发育关节软骨组织进行定位定性检测,结果显示3月龄胚胎的软骨组织,IL-1β在肥大样改变的软骨细胞染色。在4～6月龄胎儿,生长板软骨细胞自增殖后期到肥大样改变,IL-1β染色阳性。骨骺软骨（未钙化）内新生髓腔周围软骨细胞及骨髓腔内成骨细胞IL-1β也呈阳性染色。IL-1Ra蛋白表达区域基本类似于IL-1β,但表达的量较多,区域分布较广泛。结果显示,IL-1和IL-1Ra可能在人发育骨与软骨组织中通过旁分泌及自分泌方式协同发挥作用。     

稳定表达人MAGE-1基因的小鼠细胞系的建立与鉴定

目的：克隆人黑素瘤抗原-1（MAGE-1）基因，构建真核表达载体，建立稳定表达人MAGE-1的小鼠细胞株。方法：提取人肝癌细胞的总RNA，RT-PCR法获得人MAGE-1cDNA，将测序正确的MAGE-1基因克隆至真核表达载体pcDNA3中，进行酶切鉴定和序列测定。将重组质粒pcDNA／MAGE和空载体pcDNA3分别转染入小鼠骨髓瘤细胞SP2／0中，经G418筛选获得稳定表达株，用RT-PCR和Western印迹检测MAGE-1基因的转录及蛋白表达。结果：从肝癌细胞中成功克隆到人MAGE-1基因，经测序证明基因正确，酶切和序列测定表明，人MAGE-1基因的真核表达质粒已成功构建。将此重组质粒转入的SP2／0细胞可稳定表达人MAGE-1基因。结论：成功构建可稳定表达人MAGE-1基因的小鼠转基因细胞，为MAGE-1的免疫治疗研究奠定了基础。     

人LDLR基因的克隆及在Hepal-6细胞中的表达

目的：从能感染HCV的人肝癌细胞HepG2中克隆出人LDLR基因，构建其真核表达质粒，并在小鼠肝癌细胞Hepal-6中进行表达。方法：从HepG2中提取总RNA，采取逆转录PCR(RT-PCR)方法得到人LDLR的cDNA。将获得的人LDLR基因克隆到真核表达载体pcDNA3中，进行酶切和序列鉴定。将重组质粒pcDNA3-hLDLR和空载体转入Hepal-6，G418筛选，并用RT-PCR和FAcs检测人LDLR基因转录和蛋白的表达。结果：人LDLR的cDNA已插入载体pcDNA3构建成真核表达质粒pcDNA3-hLDLR，双酶切和测序表明，克隆的人LDLR与已登录GenBank的序列存在核苷酸多态性，但编码的氨基酸序列完全一致，该序列的GenBank登录号为gil21629647｜gb｜IAYll4155．1，并且真核表达质粒的构建正确。用脂质体介导的方法转入Hepal-6后，用RT-PCR和FACS检测表明，细胞可表达人LDLR。结论：成功地构建了真核表达质粒pcDNA3-hLDLR，为进一步研究HCV和人LDLR的相互作用，以及建立可能的HCV细胞感染模型奠定了基础。     

人β-防御素3基因在COS-7细胞中的表达

目的：构建人β—防御素3(hBD3)的真核表达载体，建立稳定表达hBD3的细胞株。方法：用EcoR Ⅰ酶切合有hBD3全长基因的pGEM-hBD3重组质粒，获得其编码区全长序列，将其连接入EcoR Ⅰ预处理过的pcDNA3中。转化大肠杆菌，酶切鉴定筛选出插入方向正确的转化子。采用脂质体转染法将重组pcDNA3-hBD3真核表达载体导入COS-7细胞，用G418进行抗性筛选，用RT-PCR和Western印迹检测目的基因hBD3的mRNA和蛋白表达水平。结果与结论：构建的pcDNA3-hBD3真核表达载体转染COS-7细胞后可稳定表达hBD3的mRNA和蛋白，且蛋白主要以分泌形式存在于培养上清中。     

人宫颈癌HPC2基因的克隆及其原核和真核表达载体的构建

目的:构建人宫颈癌HPC2基因的原核及真核表达载体,进一步研究该基因在宫颈癌发生中的作用。方法:从人宫颈癌HeLa细胞中提取总RNA。用RT-PCR方法扩增出人宫颈癌HPC2全序列基因,插入pT7 b lue载体。酶切鉴定及序列分析后,构建人HPC2基因的原核及真核表达载体。结果:成功扩增出人宫颈癌HPC2基因;并构建pGEX4T1-HPC2原核表达载体及pCMV-F lag-HPC2真核表达载体。结论:人HPC2基因的原核及真核表达载体的构建为深入研究HPC2基因与宫颈癌的发生奠定了基础。     

含CpG和CTB的HIV多表位基因真核表达载体的构建及表达

目的构建含非甲基化的CpG ODN序列及霍乱毒素B亚单位（CTB）的HIV复合多表位基因的真核表达载体,并在体外进行表达。方法设计并合成含CpG ODN序列和linker序列的CTB基因引物,用PCR方法扩增CpG-CTB基因（CC）,定向连接到真核表达载体pVL上,然后在CC基因下游插入HIV复合多表位基因MEGNp24,构建重组质粒pVL-CC-MEGNp24,酶切鉴定。纯化重组质粒,转染293T细胞,RT-PCR和细胞免疫染色方法分别检测CTB和p24基因的转录及表达,同时设质粒pVL及空白对照。结果构建了重组质粒pVL-CC-MEGNp24,该质粒转染293T细胞后,CTB和复合多表位基因在293T细胞中得到稳定表达。结论成功构建了含免疫佐剂的HIV复合多表位真核表达载体,为后期疫苗的研究奠定了基础。     

IL-1和TNF-α拮抗剂治疗骨关节炎实验研究

目的:观察腺病毒载体介导的白细胞介素1受体拮抗蛋白(IL-1Ra)和可溶性肿瘤坏死因子Ⅰ型受体(sTNF-RI)基因转移对兔骨关节炎的治疗作用,并探讨IL-1和TNF-α在骨关节炎发生中的作用。方法:构建Ad-IL-1Ra和Ad-sTNF-RI腺病毒载体,注射到兔骨性关节炎膝关节腔内。关节内注射腺病毒后第3天和第7天,分别用1ml生理盐水灌洗膝关节,抽取关节腔灌注液采用ELISA分析外源基因的表达。第7天处死动物,取膝关节股骨内侧髁软骨和滑膜常规石蜡切片,软骨HE染色、甲苯胺蓝染色和滑膜组织HE染色检查病理改变,并进行软骨组织学评分。结果:膝关节内注射IL-1Ra能明显抑制关节软骨的破坏,但对滑膜炎无明显治疗作用;单独sTNF-RI基因治疗对关节软骨的破坏和滑膜炎均无明显的作用。结论:IL-1Ra对骨关节炎关节软骨有明显的保护作用,而sTNF-RI对骨关节炎无明显的治疗作用,这提示在骨关节炎的发生中IL-1可能起主要的作用,因而抑制IL-1的作用对骨关节炎的治疗更为有效。     

氨基胍对大鼠创伤性面瘫恢复及面神经核IL-6表达的影响

 目的研究诱导型一氧化氮合酶抑制剂氨基胍对大鼠创伤性面瘫恢复的影响及面神经核内IL-6表达的变化.方法通过大鼠面瘫前后腹膜内小剂量给予氨基胍,在伤后各个时间点上观察面瘫的恢复情况,并采用免疫组织化学ABC法对面神经核内IL-6阳性神经元的变化进行研究.结果氨基胍在创伤性面瘫的轻、中度恢复上有促进作用,其面神经核内IL-6免疫反应性明显比对照组增强.结论氨基胍慢性干预明显促进面神经核内IL-6的表达,并促进创伤性面瘫的轻、中度恢复.     

人骨髓间充质干细胞Toll样受体3和4活化对IL-10、IL-12和IL-6分泌的影响

目的：研究人骨髓间充质干细胞（BM—MSCs）中Toll样受体（TLR）3和4的活化对IL-10、IL-12和IL-6分泌的影响。方法：用RT—PCR法检测体外培养的BM—MSCs中是否存在TLR3和TLR4的表达;用不同剂量的聚肌胞和脂多糖分别进行诱导后,用ELISA法检测培养上清中IL-10、IL-12和IL-6的变化。结果：BM—MSCs中有较高水平的TLR3和TLR4mRNA表达。聚肌胞可明显促进IL-6分泌（P〈0．05）,且0．025g／L组明显强于0．0025g／L组（P〈0．01）;明显抑制IL-10分泌（P〈0．01）,且0．25g／L组明显强于0．025g／L组（P〈0．05）;对IL-12的分泌无明显影响。脂多糖可明显促进IL-6的分泌（P〈0．01）,而对IL-12和IL—10的分泌无明显影响。结论：BM—MSCs中有较高水平的TLR3和TLR4表达。TLR3活化影响BM—MSCs对IL-6和IL-10的分泌,TLR4活化影响IL-6的分泌,TLR3或TLR4活化均不影响IL-12的分泌。     

裂变中子照射小鼠脾脏NK活性和IL－2产生能力的变化

研究了裂变中子照射对小鼠脾脏ＮＫ活性和ＩＬ－２产生能力的剂量效应关系，并与γ线作了比较。裂变中子照后２４ｈＮＫ活性的量效曲线不典型：低剂量时明显下降，１．５—５．５Ｇｙ时高于正常，以后又下降。以Ｄ＿（３７）或Ｄ＿０为指标，中子相对生物学效应（ＲＢＥ）分别约为１．７和１．６。脾细胞ＩＬ－２产生能力对裂变中子和γ线的辐射反应相近，Ｄ＿（３７）均约为２．５Ｇｙ，裂变中子ＲＢＥ为１。     

严重烧伤后早期大鼠肾脏细胞粘附分子1和白介素6的表达

目的:观察严重烧伤早期大鼠肾脏细胞粘附分子l(Intercellulal adhesion molecule-1,ICAM-1)、白细胞介素6(Interleukin 6,IL-6)在不同时间点的表达及早期病理变化,为阐明伤后早期肾脏损伤机制及为伤后早期损伤的防治打下基础。方法:①光镜和电镜观察大鼠在烧伤后早期(5min至72h)肾脏的病理变化;②免疫组织化学、原位杂交和图像分析技术对伤后不同时间点肾脏ICAM-1进行染色和分析;③免疫组织化学、原位杂交和图像分析技术对伤后不同时间点肾脏IL-6进行染色和分析。结果:①伤后早期主要病理变化为出血、充血和水肿;电镜显示:肾脏毛细血管内皮细胞受损;②伤后30min,免疫组化和原位杂交显示ICAM-1、IL-6表达增强,伤后2-24h明显增强,呈阳性或强阳性;伤后 72h,表达逐渐减弱。结论:伤后早期肾脏的损伤可能与内皮细胞损伤有关,ICAM-1、IL-6在伤后早期肾脏损害机制中占有重要地位。     

红景天对高原去势大鼠骨质疏松症的血清IL-6和TNF-α含量的影响

目的：探讨红景天对高原去势大鼠血清白细胞介素6（IL-6）和肿瘤坏死因子（TNF-α）的影响及红景天抗高原组织缺氧和预防高原骨质疏松症的效果。方法：本实验在高原建立了切除卵巢诱发绝经后骨质疏松症Wistar大鼠模型，分为A组（假手术或正常组），B组（切除卵巢组），C组（切除卵巢＋尼尔雌醇组），D组（切除卵巢＋红景天混合饲料组），E组（切除卵巢＋红景天浸液组）。术后置海拔3100m高原饲养3个月后，测定血清IL-6和TNF-α含量，观察红景天对高原去势大鼠骨质疏松症的预防作用。结果：术后3个月，A组、C组、D组和E组IL-6和TNF-α血清含量均显著低于B组。鳍论：红景天能降低体内血清IL-6和TNF-α含量，具有抑制骨吸收促进骨形成的作用。     

肾综合征出血热患者TNF-α IL-6 IL-4 IFN-γ水平变化及意义

目的：了解肾综合征出血热（HFRS）患者不同病期和病型TNF-α、IL-6、IL-4、IFN-γ的水平变化及意义,为HFRS的发病机制研究提供资料。方法：用酶联免疫检测仪定量检测35例HFRS患者和10例健康对照血清TNF-α、IL-6、IL-4、IFN-γ水平,数据处理采用SPSS10.0统计学软件分析。结果：在不同病期的HFRS患者中,TNF-α、IL-6在发热期已升高,低血压期和少尿期达到高峰;不同病期IL-4含量没有明显变化,而IFN-γ在发热期已显著升高,至低血压期和少尿期仍处于较高水平。不同病型的HFRS患者中,随病情加重,TNF-α、IL-6的含量亦相应增高,特别在重型和危重型患者TNF-α、IL-6持续较高水平。不同病型IL-4含量在各组之间没有明显变化,而各病型IFN-γ含量均显著高于健康对照。结论：动态检测HFRS患者血清细胞因子含量,对病情进展和疾病严重程度的判断有一定意义;HFRS患者的免疫平衡偏向Th1。     

云南东川非铀矿山矿工血清IL-2、IL-6、TNF-α检测及其基因多态性的初步研究

目的 通过对云南非铀矿山矿工血清IL-2、IL-6和TNF-α浓度及基因多态性位点的检测,对氡致非铀矿山矿工机体生物效应进行初步探讨。方法 血清中IL-2、IL-6和TNF-α的浓度测定采用双抗夹心ABC-ELISA法。TNF-α(-308,G→A)检测基因型采用基因体外扩增限制性片段长度多态性分析方法,IL-2(-330, T→G)基因型检测采用PCR体外扩增后测序的方法。结果 矿工组与对照组比较,年龄(F＝1.07,P>0.05),工龄(F＝0.40,P>0.05),血清IL-2浓度(F＝0.71,P>0.05),血清IL-6浓度(F＝1.09,P>0.05),血清TNF-α浓度(F＝0.95,P>0.05),IL-2基因型频度(χ²=0.02,P>0.05)和TNF-α基因型频度(χ²=2.21,P>0.05),差异均无统计学意义。结论 云南东川非铀矿山矿工血清IL-2、IL-6和TNF-α平均浓度有下降的趋势, TNF-α(-308,A A)基因型频度有增高的趋势。     

急性胰腺炎患者血清IL-8、IL-10和血Ca2+水平变化及意义

 目的:通过对急性胰腺炎(AP)发病过程中血清IL-8、IL-10、血Ca2+含量变化,分析其变化规律,判断病情的发展及变化.方法应用ELISA法测定,对52例AP及30例健康对照组(NS)IL-8、IL-10、血Ca2+的水平比较.结果AP患者血清IL-8、儿-10水平明显高于NS组(P＜0.05),在发病第1天,重症胰腺炎(SAP)与轻症胰腺炎(MAP)血清Ca2+水平明显降低,而在AP病程中、后期无明显差异.结论IL-8、IL-10参与了AP发生发展过程,且IL-8、IL-10、血Ca2+水平可以作为AP病情轻重及转归的指标.