梅毒螺旋体荧光定量PCR检测方法的建立和初步临床应用

目的建立一种利用MGB-Taqman探针的快速、灵敏、特异、准确定量检测梅毒螺旋体的方法.方法选择梅毒螺旋体的基因组的保守区域,设计合成引物和MGB-Taqman探针,构建质粒标准品pMD18-T-TP,优化定量PCR反应体系,并进行方法学评价.结果1)成功构建了重组质粒pMD18-T-TP.2)建立了利用MGB-Taqman探针的荧光定量PCR方法,其线性范围:101～1010copies/μl;灵敏度:10copies/μl;重复性:批内CV为2.02%,批间CV为2.83%,日间CV为4.23%;特异性:100%.3)初步临床应用证明:该方法比血清学检测方法灵敏度更高,假阳性率低.结论利用MGB-Taqman探针定量检测梅毒螺旋体的方法灵敏度高,特异性高,操作简便,适合临床检验诊断的要求.     

新型荧光定量PCR检测孕妇生殖道解脲脲原体方法的建立

目的 探讨建立自身淬灭探针荧光定量PCR方法检测解脲脲屏体（Uu）的可行性及价值。方法 根据Uu UreA基因序列设计合成引物和自身淬灭引物,采用基因克隆技术,将UreA基因片段插入到载体pMD18-T,以此作为标准品。优化PCR条件,建立以自身淬灭引物技术为平台的实时荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）方法,并对所建立的方法进行初步方法学评价。结果 成功构建了重组质粒pMD18-T-UreA;建立了以自身淬灭探针技术为基础的实时荧光定量PCR方法,其线性检测范围为10^1～10^9copies／μl;灵敏度为10copies／μl;重复性实验批内CV为2．35％,批间CV为3．68％,天间CV为4．92％;特异性好;通过初步临床应用发现,所建立的FQ-PCR方法与经典的培养方法相比,不仅能实时监测反应进程、绝对定量和快速检测,且检出率显著高于培养方法。结论自身淬灭探针荧光定量PCR方法检测Uu具有快捷、敏感、廉价等优点,可在临床诊断中应用。     

实时荧光定量PCR快速检测百日咳鲍特菌方法学建立及评价

目的 建立实时荧光定量PCR检测百日咳鲍特菌的方法。 方法 以百日咳鲍特菌的重复插入序列IS481为目的基因,设计探针和引物, 以克隆的IS481基因片段为DNA模板,在荧光定量PCR仪上建立实时荧光定量PCR检测方法和标准曲线,并进行灵敏度、重复性、特异性实验。 结果 建立的定量标准曲线阈值循环数（Ct）与模板拷贝数呈良好线性关系(r=0.998);最低检测浓度为10^{2 copies/μl;批内及批间变异系数均小于4%;对临床其他常见呼吸道病原体不出现特异性扩增曲线。 结论 实时荧光定量PCR法检测IS481基因可用于百日咳鲍特菌的快速检测,具有较好的灵敏度、特异性及重复性。}     

梅毒螺旋体荧光定量PCR检测方法的建立和初步临床应用

目的 建立一种利用MGB-Taqman探针的快速、灵敏、特异、准确定量检测梅毒螺旋体的方法。方法选择梅毒螺旋体的基因组的保守区域，设计合成引物和MGB-Taqman探针，构建质粒标准品pMD18-T-TP．优化定量PCR反应体系，并进行方法学评价。结果1）成功构建了重组质粒pMD18-T-TP。2）建立了利用MGB-Taqman探针的荧光定量PCR方法，其线性范围：10^1～10^10％opies／μl；灵敏度：10copies／μl；重复性：批内CV为2．02％，批间CV为2．83％，日间CV为4．23％；特异性：100％。3）初步临床应用证明：该方法比血清学检测方法灵敏度更高，假阳性率低。结论利用MGB-Taqman探针定量检测梅毒螺旋体的方法灵敏度高，特异性高，操作简便，适合临床检验诊断的要求。     

荧光定量PCR法检测肿瘤慢性贫血患者外周血淋巴细胞铁调素mRNA

目的建立检测肿瘤慢性贫血患者铁调素(hepcidin)mRNA表达水平的荧光定量PCR法,初步观察肿瘤慢性贫血患者淋巴细胞铁调素mRNA水平。方法建立荧光定量PCR检测铁调素mRNA的标准曲线,评价其灵敏度、特异性及重复性;检测50例体检健康者、49例肿瘤慢性贫血患者外周血淋巴细胞铁调素mRNA水平,同时检测血清白细胞介素6(IL-6)及血清铁(SI)水平。结果荧光定量PCR检测铁调素mRNA的灵敏度为10 copies/μL,线性范围为101~107copies/μL;熔解曲线示扩增峰单一;检测3份低、中、高浓度的阳性质粒批内CV分别为1.83%、1.27%、1.39%,批间CV分别为6.13%、7.48%、6.87%。肿瘤慢性贫血组铁调素mRNA水平为[10.51(8.02~16.31)]×10-3copies/cell,高于健康人对照组[2.57(2.20~3.20)]×10-3copies/cell,P0.01;外周血铁调素mRNA水平与IL-6水平呈正相关(r=0.92,P0.01),与SI呈负相关(r=-0.83,P0.01)。结论建立了定量检测外周血淋巴细胞铁调素mRNA的荧光定量PCR法,肿瘤慢性贫血患者铁调素mRNA水平高于健康人,可能与炎症反应有关。     

实时定量PCR检测胃癌组织miR-20a及初步应用

目的建立检测人胃癌组织中miR-20a的实时荧光定量PCR方法。方法建立miR-20a标准曲线,评价该法检测的线性范围及灵敏度;对标准质粒扩增产物进行熔解曲线分析和琼脂糖凝胶电泳检测以分析该法的特异性。取高、中、低3份不同浓度的标准质粒进行批内和日间变异系数(CV)的检测,分析该法的重复性。收集70例胃癌患者手术切除的癌组织和对应的癌旁组织,定量检测组织中miR-20a的表达水平。结果构建的实时荧光定量PCR法的灵敏度为101copies/μL,扩增的线性范围为101～109copies/μL;扩增产物的熔解曲线峰和电泳片段特异;3份不同浓度标准质粒定量检测的批内CV分别为6.33%、4.74%、5.89%,日间CV分别为9.45%、6.29%、7.48%。定量结果显示75.7%(53/70)胃癌组织中miR-20a的表达高于癌旁组织,差异有显著性(Z=-4.427,P<0.01)。结论建立的实时荧光定量PCR检测miR-20a的方法准确、快速、灵敏、特异,可用于胃癌组织中miR-20a的检测。     

实时荧光定量PCR检测人胰岛素样生长因子及其受体基因的方法学构建

目的建立检测人胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)、IGF-1受体(IGF-1R)、胰岛素样生长因子2(IGF-2)及IGF-2受体(IGF-2R)基因的实时荧光定量PCR。方法设计并合成检测上述4种基因的引物及TaqMan探针;提取胎盘组织RNA并逆转录为cDNA,分别将扩增的4种基因片段纯化后与质粒载体连接,克隆构建含目的基因片段的重组质粒,分别作为定量检测上述4种基因的标准品;用建立的实时荧光定量PCR检测上述4种基因,并用测序验证。结果 PCR扩增产物经测序分析证实分别为上述4种基因的特异性片段;定量检测IGF-1、IGF-1R、IGF-2及IGF-2R的线性范围分别为1.00×102~1.00×108copies/μL、2.00×102~2.00×108copies/μL、3.00×102~3.00×108copies/μL及5.00×102~5.00×108copies/μL;相关系数(r)分别为0.994、0.993、0.995及0.996;扩增效率分别为92.35%、96.06%、94.92%及98.84%;批间变异系数(CV)分别为1.64%~2.83%、1.73%~1.98%、2.47%~4.09%及2.25%~2.52%;批内CV分别为1.36%、1.02%、1.04%及0.96%。结论建立了高度敏感、特异检测人IGF及其受体的实时荧光定量PCR法。     

一种快速检测HBV基因的荧光定量PCR法的建立

目的：利用二聚体蝎型荧光探针技术,建立一种能用于临床的快捷、敏感、特异、价格低廉的HBV实时荧光定量PCR检测方法。方法：根据HBV基因组保守区域precore／core设计二聚体蝎型荧光探针和引物,构建质粒标准品,优化荧光定量PCR条件,并进行方法学评价。结果：所建方法的检测范围为10^1～10^8 copies／μl,灵敏度达到10copies／μl,低拷贝样品的批内和日间重复性（CV）分别为1．71％和2．57％,高拷贝样品的批内和日间GV,分别为3．00％和3．86％。与商品化TaqMan试剂盒相比,本法阳性检出率较高,且检测时间缩短了45min（约减少1／3）,成本降低50％。结论：成功建立了快速检测HBVDNA的二聚体蝎型荧光定量PCR方法,为研发适合临床应用的HBV基因定量检测试剂盒奠定了基础。     

建立检测产气肠杆菌的TaqMan荧光定量PCR和普通PCR方法

目的 建立敏感、特异的普通聚合酶链反应(PCR)方法和TaqMan 荧光定量PCR方法对产气肠杆菌进行快速检测。方法 以产气肠杆菌组氨酸脱氢酶基因(hdc)为靶基因设计引物以及TaqMan FAM探针,建立对产气肠杆菌进行检测的普通PCR方法和TaqMan 荧光定量PCR方法,并评价该方法的特异性、灵敏性和稳定性。结果 普通PCR和TaqMan 荧光定量PCR方法均能对产气肠杆菌进行特异检测;普通PCR方法对质粒标准品和粪便模拟标本的检测下限分别为 100 copies/l和1.0105 cfu/g,TaqMan 荧光定量PCR方法对质粒标准品和粪便模拟标本的检测下限分别为33 copies/l和1.0104 cfu/g;TaqMan 荧光定量PCR方法对质粒标准品和粪便模拟标本检测的扩增曲线良好;在稳定性评价试验中,普通PCR方法的重复性良好,TaqMan 荧光定量PCR方法对质粒标准品检测Ct值的组内差异为0.15%~0.98%,组间差异为0.55%~1.63%。结论 本研究建立的检测产气肠杆菌的普通PCR方法和TaqMan 荧光PCR方法特异性好、灵敏度高,能够用于产气肠杆菌的快速检测。     

EV71-CA16肠道病毒荧光定量RT-PCR诊断试剂盒的研制

目的研制一种能同时检测EV71,CA16肠道病毒的二联实时荧光定量PCR检测试剂盒,主要用于EV71,CA16肠道病毒的快速检测和流行病学监测。方法设计特异度的EV71型、CA16型基因的引物和探针,优化实时荧光定量PCR检测体系,并研究产品的灵敏度、精密度、稳定性和检测线性范围;同时对2014年5月份收集的26份样品进行检测。结果试验得到了阳性重组质粒,线性范围在5*102 copies/μl～105 copies/μl,该范围内检测结果良好;优化后肠道病毒CA16上下游引物和探针浓度分别为0.48,0.24μmol/L,EV71上下游引物和探针浓度分别为0．40,0.20 μmol/L。敏感度达到500 copies/μl,重复性变异系数CV≤5％;该荧光定量PCR检测试剂盒稳定性强,在-20℃下可以保存一年,对EV71,CA16肠道病毒具有良好的特异度。用该方法检测20份临床阳性样品和6份阴性样品,阳性检出率为100％(20/20),阴性检出率为100％(6/6)。结论试验建立的EV71,CA16肠道病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法可用于EV71,CA16肠道病毒的临床诊断。