三七总皂苷对缺氧复氧致皮质神经元损伤细胞凋亡相关基因及蛋白表达的影响*

【目的】研究三七总皂苷（PNS）对缺氧复氧致皮质神经元损伤细胞凋亡相关基因及蛋白表达的影响,探讨PNS抗神经元缺氧,复氧诱导的细胞凋亡的作用。【方法】体外原代培养大鼠胎鼠大脑皮质神经元细胞（CNC）,采用缺氧／复氧（H／R）诱导皮质神经元细胞氧化应激损伤模型,采用PNS50、10、2mg／L进行干预。采用实时荧光定量逆转录酶-聚合酶链式反应（RT—PCR）技术检测B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、B细胞淋巴瘤-2相关蛋白（Bax）、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）mRNA表达的变化,采用福林-酚法（Lowrry）法检测caspase-3蛋白含量的变化。探讨PNS抑制神经元细胞凋亡的分子机制。【结果】PNS50、10mg／L剂量组可以显著降低Bax表达;PNS50mg／L组可以显著增加Bcl—2表达;PNS有降低caspase-3表达的趋势。PNS各剂量组均能够抑制cas—pase-3的活性,有剂量依赖性趋势。【结论】PNS可能是通过增加抑制凋亡基因Bcl-2的表达,抑制促凋亡基因Bax的表达,抑制caspase-3的活性等作用抑制神经元缺氧／复氧诱导的细胞凋亡。     

三七总皂苷对缺氧复氧致皮质神经元损伤细胞凋亡相关基因及蛋白表达的影响

【目的】研究三七总皂苷（PNS）对缺氧复氧致皮质神经元损伤细胞凋亡相关基因及蛋白表达的影响，探讨PNS抗神经元缺氧，复氧诱导的细胞凋亡的作用。【方法】体外原代培养大鼠胎鼠大脑皮质神经元细胞（CNC），采用缺氧／复氧（H／R）诱导皮质神经元细胞氧化应激损伤模型，采用PNS50、10、2mg／L进行干预。采用实时荧光定量逆转录酶-聚合酶链式反应（RT—PCR）技术检测B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、B细胞淋巴瘤-2相关蛋白（Bax）、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）mRNA表达的变化，采用福林-酚法（Lowrry）法检测caspase-3蛋白含量的变化。探讨PNS抑制神经元细胞凋亡的分子机制。【结果】PNS50、10mg／L剂量组可以显著降低Bax表达；PNS50mg／L组可以显著增加Bcl—2表达；PNS有降低caspase-3表达的趋势。PNS各剂量组均能够抑制cas—pase-3的活性，有剂量依赖性趋势。【结论】PNS可能是通过增加抑制凋亡基因Bcl-2的表达，抑制促凋亡基因Bax的表达，抑制caspase-3的活性等作用抑制神经元缺氧／复氧诱导的细胞凋亡。     

冰冻葡萄粉及其多酚化合物抗凋亡的分子生物学机制研究

目的：探索冰冻葡萄粉抗胆酸诱导细胞凋亡的机制并调查冰冻葡萄粉中多酚化合物在此过程中的作用。方法：应用牛磺酸脱氧胆酸（TDCA）诱导Huh7细胞凋亡，同时用冰冻葡萄粉及其多酚化合物如表儿茶素、花青素、槲皮素、白藜芦醇进行干预，应用MTT法检测细胞活力，荧光探针DCFH—DA测定细胞内活性氧（ROS）生成量。免疫印迹法分析信号传导途径。结果：冰冻葡萄粉能显著降低TDCA诱导Huh7细胞产生的细胞内活性氧，凋亡蛋白Bax表达，并减少细胞色素c从线粒体内释放，抑制激活caspase-9，caspase-7和caspase-3。在300／ag／mL浓度的冰冻葡萄粉中，4种多酚化合物只有槲皮素显示微弱保护细胞防止线粒体介导的凋亡。增加多酚化合物的剂量才能出现明显的细胞保护效应。4种多酚化合物按300μg／mL的冰冻葡萄粉中各自的含量组合能够一定程度重现冰冻葡萄粉的抗凋亡效应。结论：冰冻葡萄粉降低氧化应激和线粒体介导的凋亡，其作用机制是防止线粒体损伤，抑制TDCA诱导的活性氧生成和激活的凋亡信号传导。推测表儿茶素、花青素、槲皮素是冰冻葡萄粉抗氧化、抗线粒体途径凋亡的重要活性成分。     

地塞米松上调肝癌细胞株HepG2中bcl-xl表达的研究

目的 探讨地塞米松(dexamethasone,DEX)对肝癌细胞株HepG2中bcl-xl表达的影响.方法 应用不同浓度的地塞米松及顺铂(cisplatin,DDP)处理HepG2细胞后,应用噻唑蓝法检测细胞活性,利用免疫细胞化学法检测凋亡相关基因bcl-xl和caspase-3的表达.结果 在DDP浓度一定时,0.1～1.0 μmol/L浓度范围内DEX对DDP抑制人肝癌细胞株HepG2生长有不同程度的拮抗作用,并能抑制顺铂诱导肝癌细胞发生凋亡,上调bcl-xl的表达,降低caspase-3活性的表达.结论 在用DDP治疗肝癌前用DEX进行预处理后可能通过bcl-xl抗凋亡通路,抑制caspase-3活性,拮抗DDP诱导细胞凋亡.     

氧化应激在碘海醇诱导人肾小管上皮细胞凋亡中的作用

目的观察碘海醇诱导的人肾小管上皮细胞（HK-2）凋亡及氧化应激所起的作用。方法将体外培养的HK-2细胞分为4组：①对照组;②碘海醇组（100mgI/ml）;③N-乙酰半胱氨酸（NAC 10mmol/L）组;④共作用组：NAC10mmol/L预处理1h＋碘海醇100mgI/ml。各组以相应药物孵育6h。采用细胞增殖/毒性检测法（CCK-8）测定细胞存活率,核染色、流式Annexin Ⅴ-FITC/PI双染法检测细胞凋亡,DCFH-DA荧光结合流式细胞法检测细胞内活性氧（ROS）的产生,IF、Western blot检测相关信号转导途径。结果碘海醇降低HK-2细胞存活率至（63±5%）（P〈0.01）,细胞凋亡率升至24.41%（对照组0.9%,P〈0.05）,细胞内活性氧升高至对照组的1.3倍（P〈0.05）。NAC预处理与碘海醇共作用后,HK-2细胞存活率比碘海醇组明显增高（118%vs.63%,P〈0.05）,凋亡率比碘海醇组明显降低（13.46%vs.24.41%,P〈0.05）,活性氧降为对照组的0.93倍,比碘海醇组（1.3倍）明显降低（P〈0.05）。碘海醇作用于HK-2细胞,引起p53磷酸化,上调凋亡相关蛋白（Bax）,下调Bcl-2的表达,促进线粒体内细胞色素C（CytC）释放到胞质,进而引起Caspase-3活化,导致细胞凋亡。NAC降低细胞内活性氧浓度,下调Bax、上调Bcl-2、减少Caspase-3活化,从而减轻细胞损伤。结论碘海醇引起的氧化应激在其诱导的HK-2细胞凋亡中起重要作用。     

N-硬脂酰酪氨酸对H2O2诱导PC12细胞氧化应激损伤的影响

目的研究N-硬脂酰酪氨酸（NsTyr）预处理对过氧化氢（H2O2）诱导的PC12细胞氧化应激损伤的影响。方法体外培养传代的PC12细胞分为空白对照组、H2O2损伤组（不同浓度H2O2诱导16h）和NsTyr预处理组（不同浓度NsTy预处理30min后加入100μmol／LH2O2诱导16h）。流式细胞仪检测细胞凋亡率及活性氧类（ROS）生成,Westernblotting检测Bax和Bcl-2的表达。结果与H2O2（100μmol／L）损伤组比较,5、10μmol／LNsTyr预处理组PC12细胞存活率显著升高（P〈0．01）,凋亡细胞率降低（P〈0．05）,细胞内ROS生成减少（P〈0．05,P〈0．01）,Bcl-2／Bax比值升高（P〈0．05）。结论NsTyr能提高PC12细胞的抗氧化应激损伤能力,上调Bcl-2表达和下调Bax表达,抑制细胞凋亡。     

龙葵碱调控 Bcl-2 与 Bax 蛋白表达及 caspase-3 活性诱导HepG2 细胞凋亡的研究

目的 探讨龙葵碱诱导 HepG2 细胞凋亡的作用机制。方法 透射电镜观察凋亡细胞形态变化,原位缺口末端检测法 (TUNEL 法) 检测 DNA 断裂情况,流式细胞术检测细胞凋亡率,间接免疫荧光法激光共聚焦扫描显微术检测 Bcl-2 与 Bax 蛋白表达,比色法检测 caspase-3 活性的变化。结果 在透射电镜下观察,龙葵碱组细胞出现细胞固缩,染色质致密,核凝聚固缩,染色体断裂形成核碎块,凋亡小体形成等细胞凋亡特征形态。TUNEL 法发现龙葵碱高、中、低剂量组 HepG2 细胞均有绿色荧光,阴性对照组无荧光。流式细胞术分析表明 0.4、2、10 μmol/L 龙葵碱作用 HepG2 细胞 24 h 凋亡率分别为 4.0%、8.5%、20.1%。同时,龙葵碱升高 caspase-3 活性,下调 Bcl-2 蛋白表达,上调 Bax 蛋白表达。结论 龙葵碱通过降低 Bcl-2/Bax 的值,激活 caspase-3 酶活性诱导 HepG2 细胞凋亡。     

土大黄苷对人乳腺癌细胞SK-BR-3凋亡的影响

目的:观察土大黄苷对人乳腺癌细胞SK-BR-3凋亡的影响.方法:Annexin V-FITC/PI双标法检测100、200、400 μmol/L土大黄苷对SK-BR-3细胞凋亡的影响,Western blot法检测Bcl-2及Bax蛋白的表达情况,试剂盒检测caspase-3的活性变化.结果:土大黄苷可诱导SK-BR-3细胞出现明显的早期凋亡,并呈浓度依赖性(P<0.05～P<0.01).土大黄苷在100、200、400 μmol/L浓度时均可抑制Bcl-2蛋白的表达,且随着其浓度的增加,蛋白表达逐渐降低,并促进Bax蛋白的表达(P<0.01).土大黄苷对caspase-3具有激活作用,且随着土大黄苷浓度的增加,caspase-3的活化程度逐渐增强.结论:土大黄苷具有诱导乳腺癌细胞凋亡的作用,其机制可能与调节凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达及激活caspase-3有关(P<0.01).     

三氧化二砷诱导骨髓增生异常综合征SKM-1细胞凋亡机制的研究

目的：探讨三氧化二砷（ AS2O3）诱导骨髓增生异常综合征（MDS）SKM-1细胞的凋亡机制。方法将AS2O3与SKM-1细胞共育,采用形态学观察细胞生长,流式细胞术检测细胞凋亡,RT-PCR技术检测Bcl-2、Bax、caspase-3 mRNA表达。结果0．25、0．50μmol/L AS2 O3对SKM-1细胞无明显促凋亡作用（P＞0．05）,2．00、8．00、32．00μmol/L AS2 O3对SKM-1细胞有明显促凋亡作用,随着AS2 O3浓度增加及作用时间延长,凋亡发生率增加（P＜0．01）,抗凋亡基因Bcl-2 mRNA表达下降（Ρ＜0．01）,促凋亡基因Bax、caspase-3 mRNA表达增加（P＜0．01,P＜0．05）。结论2、8、32μmol/L AS2 O3对SKM-1细胞有促凋亡作用,可能通过下调Bcl-2、上调Bax及caspase-3基因表达参与其中。     

Survivin对辐射损伤的影响及与caspase-9/6、3的关系

目的观察survivin对辐射损伤的影响及与caspase-9/6、3的关系.方法①将IEC-6细胞放置于2%O2环境中低氧8 h后,复氧24、48h,采用Western-blot检测胞内survivin;②给予不同实验组IEC-6细胞35Gy60Co辐射照射,采用细胞流式PI法检测细胞凋亡率,并使用荧光免疫检测试剂盒检测各组caspase-9/6、3活性.结果低氧预处理方法可诱导IEC-6细胞表达survivin,Survivin可明显降低辐射诱导的细胞凋亡率(P＜0.01),其对caspase-9/6活性无明显影响(P＞0.05),可使caspase-3活性有明显下降(P＜0.01).结论低氧预处理方法诱导的抗凋亡蛋白survivin是通过抑制caspase-3的活性,达到抑制辐射诱导的细胞凋亡的目的.     

Effects of Panax notoginseng saponins on apoptosis induced by hydrogen peroxide in cultured rabbit bone marrow stromal cells via altering the oxidative stress level and down-regulating caspase-3

Objective

To investigate the effects of Panax notoginseng saponins (PNS) on hydrogen peroxide (H₂O₂)-induced apoptosis in cultured rabbit bone marrow stromal cells (BMSCs).

Methods

The effects of different concentrations of PNS on proliferation and early osteoblast differentiation of BMSCs were determined by the MTT assay and an alkaline phosphatase (ALP) assay. An optimal effective concentration of PNS was determined and used in subsequent experiments. The cultured BMSCs were divided into three groups: untreated control, H₂O₂ treated, and PNS pretreatment of H₂O₂ treated. The oxidative stress level was assessed by superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA) assays. Flow cytometry was used to determine BMSC apoptosis by staining with annexinV-FITC/propidium iodide (PI). The activity of caspase-3 enzyme was measured by spectrofluorometry.

Results

PNS (0.1g/L) significantly increased both BMSC proliferation rate and ALP activity, while it decreased the indicators of oxidative stress, caspase-3 activity, and the apoptosis rate of BMSCs induced by H₂O_2..

Conclusion

PNS, acting as a biological antioxidant, had a protective effect on H₂O₂-induced apoptosis in cultured rabbit BMSCs by decreasing oxidative stress and down-regulating caspase-3.     

Inhibition of hypoxia and serum deprivation-induced apoptosis by salvianolic acid in rat mesenchymal stem cells

OBJECTIVE:To investigate the influence and mechanism of salvianolic acid B(SalB) on apoptosis inhibition in rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells(BMSCs) induced by hypoxia and serum deprivation(hypoxia/SD).METHODS:SalB concentration of 0.1,1,10 or 100 mg/L(drug groups) were investigated for their ability to inhibit apoptosis in rat BMSCs.BMSCs in both the apoptosis model and drug groups were cultured under hypoxic conditions for 6 h,after which cell apoptosis and change in mitochondrial membrane potential(MMP) were detected using flow cytometry.Activation of caspase-3 was detected using western blot analysis.RESULTS:Hypoxia/SD induced apoptosis in rat BMSCs.The early apoptosis rate was lower in the drug groups compared to the apoptosis model group(P<0.05).SalB was found to inhibit the reduction in MMP and decrease the activation of caspase-3.CONCLUSION:0.1,1 and 10 mg/L of SalB inhibits activation of caspase-3 and early apoptosis of rat BMSCs induced by hypoxia/SD and could therefore enhance the survival rate of grafted stem cells.     

莫达非尼抑制过氧化氢诱导的PC12细胞凋亡

目的:研究莫达非尼(modafinil)对过氧化氢诱导的PC12细胞凋亡的抑制作用,并对其机制进行探讨.方法:以噻唑兰(MTT)法测定PC12细胞存活率;用流式细胞术检测PC12细胞凋亡的百分率;测定细胞内罗丹明123(Rhodamine123)的荧光强度,反映细胞线粒体膜电位的改变.结果:莫达非尼能抑制过氧化氢(200 μmol/L)、硝普钠(500μmol/L)和连二亚硫酸钠(2 mmol/L)对PC12细胞的损伤.过氧化氢(200 μmol/L)24h可以诱导PC12细胞凋亡(凋亡率为32.65%).莫达非尼(15,7.5 μmol/L)显著降低凋亡细胞的百分率(凋亡百分率分别为7.95%、15.46%).并且莫达非尼可以抑制过氧化氢引起的线粒体膜电位降低.结论:莫达非尼对PC12细胞有保护作用.能抑制过氧化氢诱导的PC12细胞凋亡,这一作用可能与其抑制过氧化氢引起的线粒体膜电位降低有关.     

维生素B12对氧化应激损伤下神经细胞的保护机制

目的：探索维生素B12预处理对H2O2诱导下的神经细胞损伤的保护作用及自噬和凋亡蛋白表达的影响。方法：将大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞（PC12）分为对照组（Control组）RPMI 1640培养、损伤组（H2O2组）RPMI 1640培养并加入200 μmol/L的H2O2刺激,维生素B12保护组（H2O2+VitB12组）RPMI 1640培养加入200 μmol/L维生素B12预处理和200 μmol/L的H2O2刺激。24 h后检测细胞的活性,Western blot和免疫荧光检测凋亡及自噬相关蛋白表达水平。结果：与Control组比较,H2O2组的细胞存活率、细胞DNA复制水平降低,Bcl-2和P62蛋白的表达量下降,Bax、ATG-5和LC3蛋白的表达量明显上升,胞浆内LC3的激活数量上升（均P＜0.05)。与H2O2组比较,H2O2+VitB12组细胞存活率和细胞DNA复制水平上升,Bcl-2和P62蛋白的表达量上升,Bax、ATG-5和LC3蛋白的表达量显著下降,胞浆内LC3的激活数量下降（均P＜0.05)。结论：维生素B12能通过调控自噬抑制氧化应激诱导下的细胞凋亡。     

硫氧还蛋白-2 在氧化损伤的人晶状体上皮细胞中的表达及其意义

目的：探讨硫氧还蛋白-2(thioredoin-2,Trx-2)是否参与白内障的发病过程及其对过氧化氢(H2O2)诱导的 人晶状体上皮细胞氧化损伤的影响。方法：选取志愿者(因外伤行透明晶状体取出术患者)10例和行超声乳化白内 障手术患者(年龄大于60岁)30例的晶状体前囊膜,采用链霉素亲生物素蛋白-过氧化物酶标免疫组织化学法检测志 愿者和白内障患者晶状体上皮细胞中Trx-2蛋白的表达情况。体外培养SRA01/04细胞,根据不同处理分为空白对照 组、20 μmol/L H2O2组、50 μmol/L H2O2组、100 μmol/L H2O2组、阴性对照组(转染对照空pCMV6质粒并用100 μmol/L H2O2处理)和过表达Trx-2组(转染pCMV6-Trx-2过表达质粒并用100 μmol/L H2O2处理)。采用噻唑蓝[3-(4,5-dimethyl-2- thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT]法检测各组细胞活力;采用流式细胞术检测各组细胞的凋亡;采用 化学比色法检测各组细胞中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和过氧化氢酶(catalase,CAT)活性,谷胱甘肽 (glutathione,GSH)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量;采用Western印迹检测各组细胞中Trx-2以及B细胞淋巴瘤/白 血病-2蛋白(B-cell lymphoma 2 protein,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)和含半胱氨酸的天冬氨酸 蛋白水解酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3,caspase-3)的表达。结果：与志愿者相比,白内障患者晶状体上皮 细胞中Trx-2蛋白表达明显减少(P<0.05)。与空白对照组比较,20, 50,100 μmol/L H2O2组Trx-2蛋白表达量均明显降低 (均P<0.05)。与空白对照组相比,100 μmol/L H2O2组和阴性对照组细胞存活率降低、凋亡率增加,细胞内SOD和CAT 活性降低、GSH含量减少、MDA含量增加,Trx-2和Bcl-2蛋白表达降低,Bax和caspase-3蛋白表达增加(均P<0.05)。与 阴性对照组比较,过表达Trx-2组细胞存活率增加、凋亡率降低,SOD和CAT活性增加、GSH含量升高、MDA含量降 低,Trx-2和Bcl-2蛋白表达增加,Bax和caspase-3蛋白表达减少(均P<0.05)。结论：Trx-2参与白内障发病中上皮细胞的凋 亡,过表达Trx-2能够减少H2O2诱导的细胞凋亡,这可能与拮抗H2O2诱导的氧化损伤有关。     

大麻受体激动剂WIN对白血病K562细胞增殖和诱导凋亡作用的研究

目的探讨大麻受体激动剂W／N-55,212-2（WIN）对白血病K562细胞增殖和凋亡的作用及机制。方法将细胞分成对照组和不同剂量大麻受体激动剂wIN用药组。CCK-8测定WIN对K562细胞增殖的影响;DAPI染色观察细胞核形态变化;JC-1分析线粒体膜电位变化;分光光度法检测Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的活性;流式细胞仪分析细胞凋亡率变化;Western印迹法分析Bax、Bcl-2及C-myc蛋白的表达。结果与对照组相比较,5、10、20μmol／L的WIN处理K562细胞24、48h后,增殖抑制作用明显且具有剂量依赖性,差异有统计学意义（P〈0．05）。DAPI染色和线粒体膜电位检测结果显示,K562细胞发生凋亡。流式细胞仪检测结果显示,细胞凋亡率升高。WIN处理24h后,Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9活性均增加（P〈0．05）。Western印迹法显示,Bax蛋白表达增加,C-myc、Bcl-2蛋白表达下降。结论大麻受体激动剂WIN能抑制白血病K562细胞增殖,并诱导凋亡,其机制可能通过上调Bax蛋白表达,下调C-myc、Bcl-2蛋白表达,以及促使线粒体跨膜电位下降。激活Caspase．3、Caspase-8、Caspase-9蛋白而实现。     

爆炸致兔急性肺损伤时细胞凋亡作用机制的研究

目的:探讨细胞凋亡在爆炸致兔急性肺损伤(ALI)中的作用机制。方法:选取兔40只,随机分为空白对照组10只;实验组30只,空气爆炸损伤胸部,制作ALI模型,分别于爆炸损伤4、12、24 h后采样(每时间点各10只),测定肺干/湿重比、动脉血氧分压,原位末端标记检测肺组织细胞凋亡情况,免疫组织化学法检测Caspase-3、Bax、Bcl-2含量。选取肺组织,显微镜观察光镜下肺组织病理形态。结果:光镜下,实验组4 h起可见肺间质、肺泡明显水肿,肺泡腔大量红细胞、炎性细胞及浆液性渗出,肺间质增厚。与对照组比较,各实验组肺干/湿重比均明显升高(P<0.01),动脉血氧分压均明显降低(P<0.01)。凋亡指数均明显升高(P<0.01),Caspase-3与Bax/Bcl-2比值均较对照组升高(P<0.05~P<0.01)。结论:细胞凋亡在兔ALI的发生、发展过程中起重要作用,参与了肺组织损伤,促进ALI病情进展。