膀胱癌尿液脱落细胞角质素mRNA表达检测方法的建立

目的：建立采用RT—PCR对膀胱癌尿液脱落细胞CK8和CK20的mRNA表达进行分析的实验方法。方法：从22例膀胱癌患尿液脱落细胞中提取总RNA，采用RT—PCR和特异性引物进行逆转录、扩增，并用琼脂糖凝胶电泳进行分析。结果：从所有标本中提取的总RNA均有较好纯度和均一性；22例标本均表达CK8 mRNA，18例标本表达CK20 mRNA。结论：RT—PCR是一种敏感、快捷的检测膀胱癌尿液脱落细胞中CK8、CK20 mRNA表达的方法，可采用此方法从分子水平对膀胱癌患尿液脱落细胞表达产物进行无创性检测，为研究膀胱癌的发病机制、生物学行为和探索膀胱癌早期无创性诊断方法奠定了实验基础。     

Notch1 胞内段荧光表达质粒的构建及鉴定

目的：构建能够在鼻咽癌细胞株中高效表达人Notchl信号胞内段（NIC）的荧光质粒。方法：通过RT—PCR获得人NIC的cDNA;利用基因重组技术插入到pEGFP—N1中;在脂质体介导下转染人低分化鼻咽癌细胞CNE2后,经荧光显微镜、RT—PCR和Westernblot检测NIC的表达情况。结果：RT—PCR方法得到一条2424bp的特异性扩增产物,酶切和基因测序结果表明重组质粒构建成功。转染48h后,检测到绿色荧光表达,RT～PCR和Westernblot的结果显示NIC的表达量升高。结论：正确构建了人NIC荧光表达质粒。该质粒能够在鼻咽癌细胞株中高效表达,为研究Notch信号通路在鼻咽癌中的作用奠定了实验基础。     

mGM-CSF重组质粒的构建、表达及活性鉴定

目的 构建pc—mGM—CSF重组质粒载体，为mGM—CSF基因治疗肿瘤的研究奠定基础。方法 采用RT—PCR方法从小鼠脾脏中获得目的基因mGM—CSF，克隆于pcDNA3.1／Myc-His(-)(A)质粒上，成为pc-mGM-CSF，用PCR、酶切进行鉴定，然后用脂质体转染小鼠骨髓瘤细胞SP2／0，用G418筛选后通过RT—PCR和SDS—PAGE鉴定，将转染SP2／0上清加入NFS-60细胞，检测蛋白活性。结果 重组质粒中含有mGM—CSF基因，在SP2／0中有表达，且表达产物能分泌到肿瘤细胞外，分泌到细胞外的产物用mGM—CSF依赖株NFS-60细胞检测证明具有生物学活性。结论 成功构建含mGM—CSF真核表达重组质粒，有助于进一步研究其抗肿瘤作用。     

实时荧光定量RT—PCR检测NSCLC患者外周血CK19mRNA和LUNXmRNA实验研究

[目的]应用实时荧光定量RT—PCR检测非小细胞肺癌（NSCLC）患者外周血CK19mRNA和LUNXmRNA,探讨其诊断NSCLC外周血微转移的临床意义。[方法]选取初治NSCLC患者40例及健康志愿者50例,用实时荧光定量RT—PCR检测外周血CK19mRNA和LUNXmRNA相对定量分析结果。[结果]（1）肺癌组与健康对照组的CK19mRNA阳性表达率及相对表达量均有显著差异;肺癌组阳性表达率与原发肿瘤部位、原发肿瘤大小、临床分期、分化程度及病理类型无相关性,其相对表达量鳞癌患者高于腺癌患者（P〈0．05）。（2）肺癌组与健康对照组的LUNXmRNA阳性表达率有显著差异,其表达与临床病理特征无相关性。[结论]CK19mRNA和LUNXmRNA作为实时荧光定量RT—PCR法检测NSCLC外周血微转移的分子标志物,具有一定临床应用价值。     

MMP-2与PGP9.5在胃癌组织中的表达及其与肿瘤侵袭转移的相关性研究

目的探讨基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和蛋白基因产物9.5(proteingeneproduct9.5,PGP9.5)在人胃癌中的表达及其与肿瘤侵袭转移的相关性。方法采用免疫组织化学S-P法检测80例胃癌和10例正常胃组织中MMP-2和PGP9.5表达情况。结果MMP-2和PGP9.5在胃癌组织中阳性表达率分别为58.7%,70.0%;在正常胃组织中均无表达。MMP-2的表达与胃癌的浸润深度、淋巴结转移及TNM分期密切相关,而与肿瘤分化程度无关;PGP9.5的表达与肿瘤分化、浸润深度、淋巴结转移均有关。结论MMP-2和PGP9.5在胃癌侵袭及转移过程中发挥重要作用,可作为侵袭性胃癌的分子标志物,对其表达进行监控有助于胃癌预后的判断。     

肺癌组织和外周血中p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5和MAGE A1蛋白水平检测及其临床价值探讨

背景与目的：肺癌发病机制具有多样性,但一经确认,往往已错过最佳治疗时机,本文通过探讨肺癌组织和外周血中抑癌基因（p53）、蛋白基因产物（PGP9.5）、转录因子（SOX2）、肿瘤相关基因编码蛋白（GAGE7）、解旋酶（GBU4-5）和黑色素瘤抗原（MAGE A1）蛋白水平的相关性,同时分析其在肺癌诊疗中的应用价值。方法：回顾并分析2018年5月—2020年5月在复旦大学附属肿瘤医院确诊的100例肺癌患者的病历资料,临床TNM分期Ⅰ期25例,Ⅱ期45例,Ⅲa期30例;非小细胞肺癌80例,小细胞肺癌20例;取手术切除的肿瘤组织和癌旁组织,采用免疫组织化学染色法检测上述6种蛋白的水平,采用实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR）法检测其基因表达,采用酶联免疫吸附实验（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）检测外周血中6种蛋白的抗体阳性情况。结果：肿瘤组织中p53、PGP9.5、SOX2、GAGE7、GBU4-5和MAGE A1蛋...     

RT-PCR法检测外周血LUNX-mRNA诊断非小细胞肺癌微转移的研究

 目的　探索检测中早期非小细胞肺癌外周血微转移的理想途径以及手术对促进微转移的影响。方法　对 2 0例可手术的中早期非小细胞肺癌分别于术前、手术刚结束、术后一周取外周血 ,用RT PCR法检测肺癌特异性基因LUNX的表达情况 ,并与肺部良性疾病患者外周血LUNX基因的表达进行对比。结果　在被检测的 2 0例患者中 ,有 9例在不同时期被检测到有LUNX基因表达 ,而肺部良性疾病患者外周血均未发现LUNX基因表达。结论　RT PCR法检测外周血LUNX mRNA是理想的诊断非小细胞肺癌微转移的方法 ;手术治疗可以减少肺癌患者术后远处转移的发生 ;手术操作可能促进肿瘤细胞向外周血的脱落     

PML/RAR α融合基因检测临床应用及变异易位的研究

目的 :优化PML RARα融合基因检测方法 ,观察变异易位及其临床意义。方法 :RT PCR查骨髓及部分外周血PML RARα融合基因 ,变异易位产物作测序分析。结果 :发病期的 8例APL患者 (初发 4例、复发 4例 )PML RARα融合基因均阳性 ;缓解期APL患者的 2 0人次检查中 6人次阳性 ,而其骨髓涂片早幼粒细胞比率均小于 5 % ;发现一种新的S型变异易位 ,并见L、S型同时存在于同一个体。外周血中的阳性率低于骨髓中。结论 :证实S型 2 0 6bp的变异产物是一种新的变异易位产物 ;同一个体L、S型可同时存在 ;提取骨髓单个核细胞用于RT PCR查PML RARα融合基因效果最佳     

MUC1和CK7在乳腺癌外周血微转移检测中的应用

目的：以MUC1和CK7为基因标志物检测乳腺癌患者外周血中播散的肿瘤细胞，探讨肿瘤基因标志物在乳腺癌微转移诊断中的意义。方法：采用RT—PCR法检测乳腺癌患者外周血中有核细胞的MUC1和CK7mRNA表达。结果：1）检测15例正常人外周血MUC1、CK7mRNA表达，结果无假阳性；将乳腺癌细胞系MCF-7分别以1：10^5、1：10^6与正常外周血有核细胞混合，检测MUC1、CK7表达，结果无假阴性。2）检测35例乳腺癌患者外周血，以MUC1为标志物，外周血中肿瘤细胞检出率为30_3％（11／35）；以CK7为标志物，外周血中肿瘤细胞检出率为35．0％（12／35）。3）35例患者中有4例MUC1、CK7均表达阳性，7例仅MUC1表达阳性，8例仅CK7表达阳性，两种肿瘤标志物表达患者有交叉但不重叠。结论：以MUC1、CK7为基因标志物，采用RT—PCR方法检测乳腺癌患者外周血中的肿瘤细胞可能在乳腺癌微转移诊断及乳腺癌预后中具有意义，多种肿瘤基因标志物联合检测结果优于单一标志物检测。     

Survivin反义RNA真核表达载体的构建及鉴定

目的 为了特异封闭白血病细胞survivin的表达，抑制其功能，本实验构建了survivin反义核酸载体并导入白血病细胞系中。方法 应用RT—PCR获得survivin的cDNA片段，反向插入pcDNA3质粒载体中；经限制性酶切和测序鉴定所构建的反义核酸是否正确；采用电转染方法将重组体导入HL—60细胞中；RT—PCR技术检测转染细胞survivin表达的变化。结果 经限制性酶切和测序鉴定证明survivin反义核酸已成功构建；RT—PCR产物电泳结果显示，与转染前细胞、空质粒转染细胞相比，转染survivin反义核酸的细胞survivin mRNA水平明显降低。结论 本实验已成功建立了survivin反义核酸真核表达载体，而且在白血病细胞系中发挥了特异封闭作用，为进一步研究survivin反义核酸在白血病治疗中的作用提供了实验基础。     

乳腺癌患者外周血中CEA mRNA表达的检测及临床意义

目的探讨RT—PCR法检测乳腺癌患者外周血中的CEA mRNA表达的情况及在乳腺癌外周血微转移诊断中的应用。方法采用RT—PCR法,检测46例乳腺癌患者外周血中CEA mRNA表达情况,以良性乳腺疾病患者及健康志愿者外周血标本作为对照。结果46例乳腺癌患者外周血中CEA mRNA阳性率为32．6％。对照组中CEA mRNA表达均为阴性。CEA mRNA的阳性表达与患者的TNM分期、腋淋巴结状况差异有统计学意义（P〈0．05）,而与患者的年龄、原发肿瘤大小、病理类型以及激素受体状况等差异均无统计学意义（P〉0．05）。结论CEA mRNA可作为标志物来检测乳腺癌患者外周血中微转移,有助于指导临床治疗及判断预后。     

非小细胞肺癌患者淋巴结、外周血、骨髓微转移的MUC1基因诊断及临床意义

目的 :探讨非小细胞肺癌 (NSCLC)患者淋巴结、外周血、骨髓微转移的MUC1基因诊断的临床意义 ,以及三者微转移之间的相关性。方法 :应用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)技术 ,联合检测 31例肺癌患者和 10例肺良性病变患者的淋巴结、外周血和骨髓中MUC1基因mRNA表达。结果 :本实验建立的巢式RT PCR技术的敏感性达 10 -6。术前 10例患者外周血、7例患者骨髓检测到肺癌微转移。手术取 119枚淋巴结中 6 5枚检测到肺癌微转移。肺癌患者淋巴结、外周血、骨髓微转移阳性检出率分别为 5 4 .6 %、32 .3%、2 2 .6 % ,三者之间存在正相关(P <0 .0 5 )。结论 :RT PCR法是一种特异性、敏感性均较高的肿瘤微转移检测方法 ;MUC1基因mRNA可能是检测肺癌微转移的一个有价值的指标 ,为制定治疗方案和评估预后提供重要参考依据。     

SYBR Green Ⅰ实时定量逆转录PCR方法的建立及检测乳腺组织hMAM mRNA的表达水平

目的建立1种简便、有效的SYBR Green Ⅰ实时定量逆转录PCR（SYBR Green Ⅰ Q—RT—PCR）方法检测乳腺癌组织、癌旁乳腺组织人乳腺珠蛋白（hMAM）mRNA表达水平。方法对SYBR Green Ⅰ Q—RT—PCR检测乳腺癌细胞株MDA—MB—231表达hMAM mRNA的反应条件进行优化，初步检验该方法的重复性、灵敏性。应用该方法检测11例健康志愿者外周血hMAM mRNA表达，检验该方法的特异性，并对10例乳腺癌组织、10例对应癌旁乳腺组织hMAM mRNA表达水平进行测定。结果SYBR Green Ⅰ Q—RT—PCR可重复栓出乳腺癌细胞株MDA—MB-231极低表达hMAM mRNA，CT值为34．45～34．67，变异系数（CV）=0．25％。健康志愿者外周血中hMAM mRNA均阴性。乳腺癌组织hMAM mRNA阳性率为80．0％（8／10），其中Ⅰ期1例（100．0％），其量为37800；Ⅱ期6例（100．0％），量为100．4（中位）；Ⅲ期1例（33．3％），量为2．94。结论建立的SYBR Green Ⅰ Q—RT—PCR方法具有简便、特异、重复性、灵敏度好、定量结果可靠、直观等优点，应用于乳腺癌组织和癌旁乳腺组织hMAM mRNA的定量检测是理想的。     

用real-time RT-PCR 技术检测肺癌淋巴结的隐匿性微小转移

 目的 评价一种简单客观敏感的检测淋巴结中扩散的肿瘤细胞方法：real—time RT—PCR。方法 从手术的30例非小细胞肺癌病人获得纵隔淋巴结100组，分别进行常规病理学检查和real—time RT—PCR检测CK19 mRNA的表达。从12例手术的非癌症病人获得纵隔淋巴结18组作为正常对照，用15例肺癌病人原发肿瘤组织作为阳性对照。结果 在94（94．0%）组经组织病理学检查未发现肿瘤细胞的淋巴结中，用real—time RT—PCR在26（27．7％）组检测到CK19 mRNA的表达。6组经组织病理学检查有肿瘤细胞扩散的淋巴结中全部检测到CK19 mRNA的表达。组织病理学检查22例病人为pN0期，用real—time PCR方法在这些病人中发现13（59．1％）例病人淋巴结有微小扩散的肿瘤细胞。结论 应用real time RT—PCR检测CK19 mRNA的表达是一种在纵隔淋巴结发现扩散肿瘤细胞敏感而特异的方法。     

乳腺癌患者骨髓GalNAcT mRNA的检测及其临床意义

目的：研究乳腺癌患者骨髓β1，4-N-乙酰半乳糖胺转移酶（GalNAcT）mRNA的表达，探讨其作为乳腺癌骨髓微转移检测指标对临床的应用价值。方法：对40例乳腺癌患者的骨髓及外周血采用巢式RT—PCR方法检测GalNAcT mRNA表达，同时以免疫组化的方法检测骨髓标本中细胞角蛋白（cytokeratin，CK）的表达。结果：40例患者骨髓中GalNAcT mRNA阳性表达17例（42．5％），外周血阳性表达7例（17．5％）；10例血液系统良性疾病患者骨髓和15例健康志愿者外周血中GaINAcT mRNA均为阴性。免疫组化结果显示：40例乳腺癌骨髓中有11例（27．5％）CK阳性，其GalNAcT mRNA都阳性；有6例（15．0％）CK阴性而GalNAcT mRNA阳性。结论：RT—PCR和免疫组化都是检测乳腺癌患者骨髓微转移的可靠的方法，但前者的敏感性高于后者。GalNAcT mRNA可作为一种新的肿瘤标志物来检测乳腺癌患者骨髓微转移。     

大肠癌患者多药耐药基因表达与临床疗效的关系

目的 研究大肠癌患者多药耐药基因表达与临床疗效的关系。方法 利用RT—PCR法半定量分析84例大肠癌患者MDR_1基因表达水平。结果 未经化疗组与化疗组MDR_1表达水平具有显著性差异(P<0.05);病理类型高分化者与低分化者MDR_1基因表达水平具有极显著性差异(P<0.01)。结论 RT—PCR法检测大肠癌患者外周血中MDR_1表达水平灵敏度高,相对定量,结果可靠,为临床提供了一项监测和判断疗效的又一种新方法。     

隔蛋白7在神经上皮肿瘤中的表达

目的研究隔蛋白7（SEPT7）在神经上皮肿瘤中的表达。方法采用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）方法检测47例胶质瘤标本以及4个胶质瘤细胞系中SEPT7的mRNA表达水平,以及免疫组化法研究了肿瘤标本以及组织芯片中SEPT7的表达状况。结果胶质瘤中SEPT7的表达水平随肿瘤恶性程度增加而明显降低,低恶度胶质瘤与高恶度胶质瘤的mRNA、蛋白表达水平差异有统计学意义;胶质瘤细胞系TJ905、TJ899未检测到SEPT7的表达,U251、TJ862细胞系中SEPT7表达水平较正常组织显著降低。结论RT—PCR和免疫组化检测表明SEPT7在神经上皮肿瘤中表达下调,可能与肿瘤的发生、发展有关联,值得进一步研究。     

LunX和CK19基因定量表达在肺癌诊断及疗效观察中的应用研究

目的：探讨采用荧光定量RT—PCR检测肺癌患者外周血LunX和CK19基因的表达,以及在肺癌诊断和疗效观察中的应用价值。方法：建立定量检测LunX和CK19 mRNA的荧光定量RT—PCR技术,检测在肺癌患者外周血的表达及治疗前后的表达水平的比较。结果：外周血标本中治疗前病例、治疗后病例和肺部良性病例LunX mRNA的表达分别为83．87％（26／31）、46．67％（7／15）和10％（1／10）。治疗前肺癌组和肺部良性病例组LunX mRNA的表达差异有统计学意义,X^2=15．2,P〈0．001;肺癌治疗前后LunX mRNA的表达也有统计学意义,X^2=4．9,P〈0．05。正常对照10例和非肺癌的肿瘤患者4例LunX mRNA的表达均为阴性,与LunX基因相比较,CK19基因灵敏度相近,但特异性较差。结论：荧光定量RT—PCR检测LunX基因的表达可以作为肺癌诊断及治疗前后疗效考核的重要参考指标,应用价值优于CK19基因。     

人RASSF2基因的真核表达载体的构建及其表达

 目的　构建人RASSF2基因的真核表达载体 ,为研究RASSF2在肿瘤细胞凋亡、细胞周期阻滞等方面的作用奠定基础。方法　采用RT PCR自正常人外周血单个核细胞RNA中扩增出人RASSF2基因的全长cDNA ,利用DNA重组技术将其插入到真核表达载体 pcDNA3.1/HisC中获得重组质粒。用脂质体将重组质粒转染人胰腺癌细胞株PANC 1,RT PCR检测其表达。结果　酶切图谱分析及基因测序证明人RASSF2表达片段已被完整、正确的插入到 pcDNA3.1/HisC中 ,RT PCR结果显示转染细胞RASSF2表达水平上调。结论　成功构建了RASSF2基因的真核表达载体 pcDNA3.1RASSF2     

肺癌患者外周血淋巴细胞与癌细胞耐药基因表达的相关性研究

目的：探讨肺癌患者外周血淋巴细胞和癌细胞耐药基因表达的相关性。方法：采用RT—PCR法检测40例肺癌患者外周血淋巴细胞耐药基因MDR-1的表达,免疫组化法检测肺癌组织原代培养癌细胞耐药基因蛋白P—gp和MRP的表达。结果：肺癌患者外周血淋巴细胞耐药基因MDR-1的表达率37．5％（15／40）,与肺癌细胞耐药基因蛋白P—gp和MRP的表达具有相关性（P〈0．05）,与肺癌患者的年龄、分期、病理类型及性别无关（P〉0．05）。结论：外周血淋巴细胞耐药基因MDR-1的表达率较高,与癌细胞耐药基因蛋白P—gp和MRP的表达具有相关性,对肺癌临床化疗药物的选择具有重要的参考价值。