斑马鱼叶酸多聚谷氨酸合成酶基因的生物信息学特征及胚胎发育表达

目的 探索斑马鱼叶酸多聚谷氨酸合成酶（FPGS）的生物信息学特征及在胚胎发育中的表达模式。方法 利用Ensemble数据库及ClustalW程序进行序列比对,分析斑马鱼与哺乳动物FPGS蛋白之间的氨基酸同源性;利用系统发育树分析不同物种间fpgs基因的保守性;运用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）分析fpgs基因在斑马鱼重要器官及胚胎早期发育中的表达;运用整胚原位杂交技术检测野生型斑马鱼fpgsmRNA的表达。结果 生物信息学分析显示,斑马鱼FPGS蛋白在进化上与哺乳动物同源物高度保守。RT-PCR结果显示,斑马鱼fpgs基因不仅在胚胎的各个发育阶段均有表达,且在成鱼的脑、肝和胃组织中高表达。原位杂交结果显示,fpgs基因在斑马鱼胚胎4细胞期广泛表达,而在尾芽期开始仅在卵黄合体细胞层中表达;在斑马鱼胚胎20体节期,fpgs在产生初级造血祖细胞的中间细胞团、眼睛和后脑区域呈现特异性表达;从斑马鱼胚胎受精后48～96 h,fpgs基因在其肝脏及端脑与后脑的交界处特异性表达。结论 斑马鱼的FPGS蛋白与哺乳动物同源物高度保守,且fpgs基因在斑马鱼发育中的初级造血区、肝脏、后脑区及眼睛特异性...     

Nodal信号通路相关基因NOMO1在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达

目的:研究斑马鱼NOMO1基因在早期胚胎发育过程中的时空表达情况?方法:首先克隆斑马鱼NOMO1同源基因全长cDNA,然后运用半定量RT－PCR技术初步检测NOMO1基因在斑马鱼早期胚胎的表达情况,最后通过原位杂交技术检测NOMO1基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的时空表达情况?结果:通过半定量RT－PCR及原位杂交技术显示NOMO1从受精卵时期开始即有表达,在24 hpf(受精后24 h)之前,NOMO1基因表达广泛,并主要集中在中?内胚层?从24 hpf开始其表达主要集中于神经系统如前脑?中脑?小脑?脊索前板?眼和耳囊等处?在心脏处也有少量表达?结论:NOMO1基因对斑马鱼早期胚胎发育具有一定的作用,推测NOMO1基因影响早期心脏发育?     

hoxb4转基因斑马鱼造血发育中rap1b基因的表达

目的 为了发现在早期造血发育中关键的调控因子,利用hoxb4转基因斑马鱼研究rap1b基因的表达变化情况,以期明确hoxb4与rap1b在早期造血发育中的关系.方法 选取过表达hoxb4的斑马鱼系为研究对象,分为3组:实验组(表达hoxb4-EGFP的斑马鱼),实验对照组(表达EGFP的斑马鱼),空白对照组(野生型斑马鱼).通过流式分选技术将实验对照组和实验组18hpf(斑马鱼胚胎受精发育18h)、24、30、36、48hpf胚胎中带有绿色荧光(enhanced green fluorescent protein,EGFP)信号的细胞分选出来,利用实时荧光定量PCR检测分选出的细胞中的rap1b基因的表达变化;然后收集野生型斑马鱼多时相胚胎,制备rap1b基因的反义mRNA探针,通过胚胎原位杂交观察探针在3组斑马鱼胚胎18、24、30、36、48hpf杂交信号表达部位.结果 qRT-PCR结果显示实验组30、36、48hpf的斑马鱼胚胎的rap1b基因的表达明显增强(P＜0.05);制备了rap1b基因的反义mRNA探针,胚胎整体原位杂交结果显示:rap1b基因在3组斑马鱼胚胎18 ～ 48 hpf之间神经发育和造血发育部位都有表达.结论 在过表达hoxb4转基因斑马鱼中rap1b基因表达有明显的升高趋势,提示rap1b基因与hoxb4基因可能共同参与调节早期造血发育过程.     

ripply1在斑马鱼早期胚胎背腹发育中的作用

目的 探究ripply1基因在斑马鱼早期背腹轴发生过程中的作用。方法 利用斑马鱼整封原位杂交技术揭示ripply1基因在斑马鱼早期胚胎发育过程中的表达模式，通过显微注射技术在胚胎1细胞期注射ripply1的mRNA来高表达Ripply1蛋白并在后期观察胚胎背腹标记基因的变化及胚胎形态变化。利用Tol2转基因技术构建ripply1启动子驱动的GFP转基因鱼。结果 原位杂交结果显示ripply1基因在斑马鱼原肠早期胚盾期特异表达在胚盾处，即预定的背部。高表达ripply1后，在胚盾期背部标记基因表达范围扩大，腹部标记基因表达减弱，受精后24小时胚胎表现出严重的背部化表型：头部增大，腹部卵黄延伸减弱，尾部躯干及尾部区域减少，有的甚至形成了第二个体轴。得到的转基因鱼揭示ripply1母源表达，并且转录起始位点上游1200个碱基驱动的GFP能模拟内源基因的表达图式。结论 ripply1可能参与斑马鱼胚胎早期背腹轴的发生。     

斑马鱼rnf141基因结构与表达分析

目的:探讨斑马鱼rnf141基因在物种间进化以及在斑马鱼胚胎发育和成体中表达分布特点.方法:采用生物信息学方法分析斑马鱼rnf141基因结构特征;运用胚胎整体原位杂交和多组织RT-PCR技术分别检测斑马鱼胚胎发育不同阶段和成体各组织rnf141基因表达情况.结果:斑马鱼RNF141蛋白与人类和小鼠同源蛋白(ZNF230、Znf230)分别具有79.8%、78.5%的同源性,其中C3HC4型锌指结构域及其保守的半胱氨酸和组氨酸残基组成与人类(或小鼠)的同源性分别为84.8%、100%;而且,斑马鱼RNF141蛋白与人类ZNF230蛋白在C3HC4型锌指区域具有完全相同的二级结构.杂交结果显示,rnf141基因在斑马鱼胚胎中广泛表达,尤以端脑、小脑和后脑表达丰度为高.RT-PCR结果表明,rnf141基因在受检的成体组织中均有表达,但在睾丸组织中表达丰度较高.结论:斑马鱼rnf141基因为脊椎动物保守基因,并可能在胚胎发育和精子发生过程中起着重要作用.     

野生型斑马鱼胚胎中hoxd3基因mRNA的表达谱

目的:为探讨hoxd3基因在斑马鱼发育过程中与血管形成可能的作用机制,用hoxd3基因的反义mRNA探针进行斑马鱼全胚胎原位杂交,观测hoxd3基因在野生型斑马鱼胚胎发育过程中的表达情况。方法:提取斑马鱼胚胎总RNA,经RT-PCR扩增斑马鱼hoxd3基因片段,将得到的hoxd3基因片段和pCS2+质粒经EcoR I、Xba I双酶切后插入pCS2+质粒中,挑选阳性克隆,通过双酶切、菌落PCR以及测序鉴定;将pCS2+-hoxd3重组子经EcoR I酶切线性化,经T3RNA体外转录体系合成地高辛标记hoxd3基因的反义mRNA探针。用hoxd3基因的反义mRNA探针进行斑马鱼全胚胎原位杂交。结果:构建和鉴定了pCS2+-hoxd3重组质粒,经斑马鱼全胚胎原位杂交检测hoxd3基因的表达,发现在Tuebingen野生型斑马鱼24 hpf-72 hpf胚胎的中脑后脑交界处以及后脑中可以观察到hoxd3基因的表达。结论:hoxd3基因在Tuebingen野生型斑马鱼胚胎发育早期的神经系统高表达,未发现在血管生成区域的表达。     

野生型斑马鱼胚胎中hoxd3基因mRNA的表达谱

目的:为探讨hoxd3基因在斑马鱼发育过程中与血管形成可能的作用机制,用hoxd3基因的反义mRNA探针进行斑马鱼全胚胎原位杂交,观测hoxd3基因在野生型斑马鱼胚胎发育过程中的表达情况。方法:提取斑马鱼胚胎总RNA,经RT-PCR扩增斑马鱼hoxd3基因片段,将得到的hoxd3基因片段和pCS2+质粒经EcoRⅠ、XbaⅠ双酶切后插入pCS2+质粒中,挑选阳性克隆,通过双酶切、菌落PCR以及测序鉴定;将pCS2+-hoxd3重组子经EcoRⅠ酶切线性化,经T3RNA体外转录体系合成地高辛标记的hoxd3基因的反义mRNA探针。用hoxd3基因的反义mRNA探针进行斑马鱼全胚胎原位杂交。结果:构建和鉴定了pCS2+-hoxd3重组质粒,经斑马鱼全胚胎原位杂交检测hoxd3基因的表达,发现在Tuebingen野生型斑马鱼受精后24 h～72 h胚胎的中脑后脑交界处以及后脑中可以观察到hoxd3基因的表达。结论:hoxd3基因在Tuebingen野生型斑马鱼胚胎发育早期的神经系统高表达,未发现在血管生成区域的表达。     

胰岛素样生长因子结合蛋白-2参与斑马鱼胚胎心血管系统发育的实验研究

 目的 通过显微注射吗啡啉修饰的反义寡核苷酸制作斑马鱼IGFBP-2基因表达下调的动物模型,观察IGFBP-2表达下调导致斑马鱼胚胎心脏血管发育的异常表型及其对心脏发育相关基因表达的影响。方法 胚胎整体原位杂交验证IGFBP-2基因在斑马鱼胚胎发育早期的时空表达谱。特异抑制IGFBP-2基因启动子的吗啡啉（morpholino,MO）和标准对照吗啡啉（Con-MO）由Gene-Tools公司设计合成。设置0.05、0.10、0.25和1.0 mmol/L 4个不同浓度梯度的IGFBP-2 MO注射组,观察不同注射浓度对斑马鱼胚胎心脏异常表型发生率和死亡率的影响,并与Con-MO注射组以及野生型（Wild type,Wt）对照组比较。详细记录0.25 mmol/L浓度 IGFBP-2 MO注射组不同发育时段斑马鱼胚胎心脏发育的异常表型。荧光显微镜下观察IGFBP-2 EGFP重组质粒单独以及与IGFBP-2 MO或Con-MO共注射后12hpf胚胎的绿色荧光表达。原位杂交比较IGFBP-2 MO注射组与Wt组斑马鱼心房标记基因Amhc的表达情况;观察IGFBP-2基因下调的Vmhc-EGFP转基因斑马鱼心室特异性绿色荧光的变化;显微血管荧光造影显示IGFBP-2 MO注射组与Wt组胚胎外周血管发育的差异。结果 斑马鱼胚胎早期的发育过程中,IGFBP-2基因在眼球、中脑和肝脏先后表达。0.25 mmol/L浓度MO注射组12 hpf存活的胚胎在48 hpf有59.6%发生心脏发育的异常表型,包括心管搏动无力、心包水肿和房室环化障碍,部分胚胎发生心房扩大、房室反流伴循环瘀滞,且畸形随发育时间推移加重。接受单独显微注射IGFBP-2 EGFP重组质粒和与Con-MO共同注射的Wt胚胎12 hpf出现明显的绿色荧光表达,而重组质粒与IGFBP-2 MO共同注射的胚胎几乎无荧光表达,证实MO下调斑马鱼胚胎IGFBP-2基因的有效性。48 hpf胚胎整体原位杂交显示IGFBP-2 MO注射组心房特异标记基因Amhc的表达下调;48 hpf IGFBP-2基因下调的Vmhc-EGFP转基因斑马鱼心室特异绿色荧光蛋白的表达减弱;60 hpf IGFBP-2 MO注射组显微血管荧光造影显示体节间血管显影稀疏紊乱。结论 显微注射IGFBP-2 MO能够有效实现斑马鱼胚胎的IGFBP-2基因下调。IGFBP-2基因下调导致斑马鱼胚胎心脏血管的异常表型,并抑制心脏发生基因Amhc和Vmhc的表达。IGFBP-2在斑马鱼胚胎心血管系统的正常发育过程中起到重要作用。     

raldh2基因阻抑导致斑马鱼心脏发育畸形的机制

目的通过显微注射吗啡啉修饰的反义寡核苷酸(MO)阻抑视黄醛脱氢酶2(raldh2)基因表达,探讨raldh2基因阻抑对斑马鱼胚胎心脏发育的影响及可能的分子机制。方法根据斑马鱼raldh2基因起始密码区域序列设计合成吗啡啉修饰的反义寡核苷酸,采用显微注射方法阻抑斑马鱼胚胎raldh2基因表达。构建raldh2-EG-FP重组质粒进一步验证MO的特异性和有效性。分析raldh2基因阻抑后对胚胎发育,尤其心脏表型和功能的影响。通过胚胎整体原位杂交,分析心脏相关nppa和tbx20基因表达模式以及raldh2阻抑后对其表达的影响。结果显微注射raldh2-MO能有效地特异地阻抑斑马鱼胚胎raldh2基因表达,raldh2-MO对胚胎发育影响呈剂量依赖性。raldh2基因阻抑可导致胚胎心脏发育畸形,干扰正常的房室分化和向右环化,导致房室瓣血液反流。与野生型胚胎比较,raldh2基因阻抑组胚胎心率和心室收缩分数降低(P<0.05),心功能受损。整体原位杂交结果显示raldh2基因阻抑后nppa基因表达改变,心室部位nppa表达清晰,而心房部位表达减弱。tbx20基因在心脏、运动神经元、顶盖及视网膜表达,raldh2基因阻...     

过表达miR⁃155对斑马鱼胚胎发育的影响

目的：探讨过表达miR?155对斑马鱼胚胎发育的影响和机制。方法：利用qRT?PCR检测miR?155在斑马鱼胚胎发育各阶段的表达;通过显微注射的方法将miR?155 mimic转入斑马鱼胚胎,实现基因的过表达;利用qRT?PCR和Western blot方法检测过表达miR?155后发育相关标志性基因的表达变化;利用ETS1的mRNA对过表达miR?155的胚胎进行补救实验。结果：miR?155在胚胎发育时期均有表达,在器官形成期表达量明显增高;过表达miR?155导致斑马鱼胚胎发育迟缓、褪膜延迟、腹部及心包积液、尾部变短变粗,肝脏、小肠、心脏及肌肉发育相关标志性基因表达下调;ETS1能缓解过表达miR?155所致发育畸形。结论：过表达miR?155可能通过负向调控ETS1而影响斑马鱼胚胎肝脏、小肠、心脏及肌肉的发育。