硼替佐米联合伊马替尼诱导K562细胞凋亡机制的研究

目的研究硼替佐米（BOR）单独或联合伊马替尼（IM）对慢性粒细胞性白血病（CML）急变期细胞株K562凋亡的影响并探讨其可能的机制。方法不同浓度的BOR、IM处理K562细胞,于12、48、72h分别采用四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT）检测细胞增生活性;流式细胞仪检测细胞凋亡;反转录聚合酶链反应（RT—PCR）法检测LivinmRNA的表达。结果MTT和流式细胞仪结果显示BOR单药可以抑制K562细胞增生,诱导其凋亡,并且能够增强IM对细胞的杀伤作用。RT-PCR结果显示BOR或IM可以下调LivinmRNA的表达,联合作用后,LivinmRNA的水平明显降低。结论BOR单药或联合IM可以诱导K562细胞的凋亡,其机制可能与下调LivinmRNA的表达有关,两药联合具有协同作用。     

三氧化二砷诱导K562细胞凋亡过程中Par-4及WT1基因表达的变化

 目的　探讨三氧化二砷（As2O3）诱导K562细胞凋亡过程中前列腺凋亡反应因子-4（Par-4）和WT1基因表达的变化。方法　用不同浓度As2O3（2～10 μmol／L）处理K562细胞24～72 h,MTT法测定细胞增生活力,流式细胞术检测细胞凋亡,采用荧光定量RT-PCR检测Par-4和WT1基因 mRNA表达变化,Western blotting检测Par-4和WT1蛋白表达的变化。结果　不同浓度As2O3作用于K562细胞,随浓度增加能明显抑制细胞的生长,诱导细胞发生凋亡。同时Par-4基因mRNA和蛋白表达逐渐增加;而WT1基因mRNA及蛋白表达逐渐下降。结论　As2O3可抑制K562细胞生长,诱导细胞凋亡,Par-4与WT1基因可能参与As2O3诱导K562细胞凋亡的调控。     

三氧化二砷诱导K562细胞凋亡机制的研究

目的了解三氧化二砷(As2O3)诱导慢粒细胞系K562细胞株凋亡是否与线粒体跨膜电位(mitochondrial transmembrane potentials,△ψm)改变有关及其可能机制。方法联合应用As2O3、DTT和BSO处理K562细胞株,通过细胞内荧光染料PI/Rh123的色强度分析(△ψm),测定细胞活力、亚G1期细胞含量及形态学观察等鉴定细胞凋亡。结果As2O3可明显诱导K562细胞线粒体△ψm下降。BSO可加强As2O3诱导的K562细胞凋亡和线粒体△ψm下降,而DTT则有部分拮抗作用。在2×10-6mol/L As2O3处理72h的K562细胞,PI-Rh123-细胞达(26.0±2.5)%,当1×10-3mol/LBSO同时处理时,PI-Rh123-细胞和凋亡细胞数上升达(37.2±5.7)%和(39.1±4.5)%;而当2×10-4mol/L DTT同时处理时,PI-Rh123-细胞和凋亡细胞数分别降至(11.5±1.3)%和(15.4±3.5)%。结论线粒体跨膜电位下降是As2O3诱导K562细胞凋亡的关键环节,其机制可能与巯基氧化有关,巯基可能是As2O3凋亡细胞的重要靶分子。     

短发夹RNA抑制三氧化二砷耐药的白血病K562/AS2细胞MRPI基因表达的实验研究

目的 研究短发夹RNA(shRNA)对耐三氧化二砷(As2O3)的白血病K562/AS2细胞MRPI基因表达的抑制作用.方法 设计并合成3条针对MRPI基因的shRNA序列,在脂质体的介导下转染K562/AS2细胞;用荧光实时定量PCR分析MRPI mRNA的表达水平;流式细胞术检测MRPI蛋白表达和细胞内柔红霉素蓄积量.结果 经MRPI shRNA作用24 h后,K562/AS2细胞株中MRPImRNA和蛋白表达水平明显下降,最大下调幅度分别为(79.1±0.07)%和(62.48±0.86)%(P<0.05),同时细胞内柔红霉素蓄积量显著增加(P<0.05).结论 MRPI shRNA可抑制As2O3耐药的白血病细胞株K562/AS2细胞MRPl基因的表达.     

紫草素诱导人白血病细胞K562的凋亡

目的: 研究紫草素对人白血病细胞株K562增殖抑制和诱导凋亡作用.方法: 四氮甲唑蓝(MTT)观察细胞的生长状况,应用彗星分析法、TUNEL技术和流式细胞仪检测细胞凋亡.结果: 紫草素在(1-9)×10-5mol/L浓度范围内能明显抑制K562细胞的增殖,并具有时间和浓度依赖性,9 X 10-5mol/L紫草素作用72h的K562细胞株A值最低;彗星分析法显示经紫草素作用的K562细胞出现长的彗尾条带;原位细胞凋亡可见细胞变小,核固缩为一个或多个染色质团块;流式细胞仪检测细胞凋亡主要发生在G1/S期.结论: 紫草素在体外一定浓度范围内能抑制K562细胞增殖,诱导凋亡.     

三氧化二砷与HMBA对白血病K562细胞增殖抑制作用及其分子机制的研究

目的:探讨诱导分化荆对K562细胞增殖抑制的作用与分子机制.方法:通过MTT试验和细胞形态学观察K562细胞增殖的改变和分化情况.通过流式细胞仪实验检测细胞周期改变,RT-PCR检测EⅥ1、TGF-β1和WT1基因表达的变化.结果:K562细胞经六亚甲基二乙酰胺(HMBA)和(或)三氧化二砷(As2O3)作用后增殖明显受到抑制,并向不同方向分化,细胞被阻滞在G1期.K562细胞的增殖抑制作用与EVI1和WT1基因表达下调,TGF-β1基因表达上调一致.EⅥ1/β-aetin从0.925 3渐降至0.137 9,WT1/β-actin从0.995 3降至0.197 8.TGF-β1/β-actin从0.331 5增至1.245 2.结论:HMBA、As2O3及其联合抑制K562细胞增殖作用与EⅥ1和WT1基因表达下调,TGF-β1基因表达上调有关.     

超声体外诱导白血病细胞K562凋亡的研究

 目的 研究超声对诱导白血病细胞K562凋亡的作用,为超声治疗的临床应用提供实验依据。方法 以人慢性粒细胞白血病急变细胞株K562为研究对象,用频率为1.8 MHz的超声波辐照白血病细胞K562,用光学显微镜观察凋亡细胞形态学改变,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果 超声辐照K562细胞后24 h,8 mV×5 min组及8 mV×10 min组细胞凋亡率分别为2.3 %和8.28 %;10 mV×5 min及10 mV×10 min组细胞凋亡率分别为9.36 %和21.46 %。电压为7mV时,超声辐照K562细胞后0.5 h,1 h,3 h,5 h细胞凋亡率分别为1.9 %,3.6 %,5.7 %,7.7 %。同时光学显微镜下可见凋亡小体形成等典型形态学改变。结论 超声可以诱导白血病K562细胞凋亡。     

增加细胞内三氧化二砷浓度恢复耐三氧化二砷的K562细胞对其敏感性的研究

目的 探讨耐受三氧化二砷（ATO）的白血病ATO耐药K562细胞（K562/AS2细胞）内砷浓度与耐药性的关系.方法 亲代敏感K562细胞（K562/S细胞）按照逐步增加ATO浓度诱导,建立K562/AS2细胞.采用原子荧光光谱法检测细胞内砷浓度.采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测不同浓度ATO对细胞的毒性作用.结果 1μg/ml ATO培养24、48、72h后,K562/S细胞内的砷浓度比K562/AS2细胞增高[（15.63±0.42） μg/L比0μg/L、（22.27±0.15） μg/L比（3.51±0.12） μg/L、（24.31±0.21） μg/L比（3.61±0.11） μg/L;均P＜0.05].随着ATO浓度的增加及培养时间的延长,K562/AS2细胞内砷浓度逐渐增加（P＜0.05）,在1μg/ml和2μg/ml间砷浓度增加较快.K562/AS2细胞生长抑制率也逐渐增加（P＜0.05）,在1μg/ml和2μg/ml间增加较快.直线相关分析显示,当K562/AS2细胞与ATO接触分别为24、48和72 h时,其细胞生长抑制率均与细胞内ATO浓度呈正相关.结论 增加ATO浓度或延长ATO作用时间均可增加耐药细胞内ATO浓度,细胞内ATO浓度与ATO对细胞的毒性呈正相关,增加细胞内ATO浓度能够增强耐ATO K562细胞对ATO的敏感性.     

As2S2诱导K562细胞凋亡的分子机制初步研究

目的　探索As2 S2 对K5 6 2细胞的诱导凋亡作用及其机制。方法　细胞凋亡的检测用流式细胞分析、基因组DNA电泳、细胞形态学观察等方法 ,Westernblot方法用于蛋白表达的检测 ,基因表达的变化用半定量RT PCR方法。结果　 3～ 5 μmol L的As2 S2 作用 4 8～ 72h即可诱导K5 6 2细胞凋亡。 3μmol LAs2 S2 作用 72h时 ,细胞凋亡率达 (34.4± 3.3) % ;5 μmol LAs2 S2 作用 4 8,72h时 ,细胞凋亡率分别为 (2 1.8± 3.6 ) %和 (4 6 .0± 5 .2 ) %。 5 μmol LAs2 S2 作用下 ,As2 S2 可降低Bcr Abl和JAK2的蛋白含量。As2 S2 从基因水平上调bax表达 ,下调c myc表达。As2 S2 作用后 ,Caspase 3被激活。As2 S2 也能诱导慢性粒细胞性白血病 (CML)患者单个核细胞凋亡。结论　As2 S2 可诱导CML细胞凋亡 ,Bcr Abl含量的降低可能起了很重要的作用。bax表达的增加、c myc表达的减少、JAK2蛋白含量的降低以及Caspase 3激活也可能参与了该细胞凋亡机制。     

As2O3与STI571单用及联用对K562细胞bcr-abl磷酸化的影响

目的 研究As2O3单用及联用ST1571对K562细胞bcr-abl蛋白酪氨酸磷酸化的影响。探讨其抗白血病的分子机制,为As2O3和ST1571联合应用治疗CML提供理论依据。方法 采用细胞增生实验检测细胞生长;采用Annexin-V／PI双染实验、DNA的PI染色及DNA电泳等方法检测细胞凋亡：运用免疫沉淀和Western blot检测K562细胞bcr-abl蛋白酪氨酸磷酸化水平。结果 As2O3和ST1571明显抑制K562细胞生长。并检测出凋亡细胞群。DNA电泳出现“梯”状条带;bcr-Abl蛋白酪氨酸磷酸化水平出现时间剂量依赖性下调。结论 As2O3和ST1571能诱导K562细胞凋亡和抑制其增生．两药联用具有协同作用．机制似与下调K562细胞bcr-abl蛋白酪氨酸磷酸化有关。     

STI571诱导K562细胞红系分化及其机制的初步研究

目的 :探讨 STI5 71诱导 K5 6 2细胞向红系分化的可能机制。方法 :单用 STI5 71及联用信号传导阻滞剂处理 K5 6 2细胞 ,采用联苯胺染色法检测 K5 6 2细胞向红系分化比例变化 ,流式细胞术检测细胞周期改变 ,Western blot检测 Rb、p- Rb、Erk、p- Erk、p2 7蛋白改变 ,RT- PCR检测 GATA1、GATA2、p2 7m RNA水平变化。结果 :STI5 71诱导 K5 6 2细胞向红系分化 ,呈时间剂量依赖性改变。K5 6 2细胞经 STI5 71处理后 1 2 h即可发生 G1 期阻滞 ,随时间延长趋于明显 ,伴随 p2 7,p- Rb水平下降。p- Erk水平升高。STI5 71与信号传导阻滞剂 U0 1 2 6联合应用后 ,K5 6 2细胞联苯胺阳性率明显下降 (P<0 .0 5 )。STI5 71作用后 ,GATA1、GATA2、m RNA水平未见明显变化。结论 :STI5 71通过上调p2 7,降低 p- Rb水平 ,诱导 K5 6 2细胞发生 G1 期阻滞 ,活化 Erk促使 K5 6 2细胞向红系分化     

三氧化二砷治疗真性红细胞增多症的初步研究

目的：在观察Ａｓ２Ｏ３对Ｋ５６２细胞系和真性红细胞增多症（ＰＶ）患者外周血单个核细胞的体外效应的基础上,分析Ａｓ２Ｏ３治疗３例ＰＶ患者的临床结果。方法：以Ｋ５６２细胞和ＰＶ患者的新鲜细胞为体外靶子,通过细胞形态学,流式细胞仪和Ａｎｎｅｘｉｎ－Ｖ的测定检测细胞凋亡。每日静脉滴注１０ｍｌ０．１％Ａｓ２Ｏ３注射液治疗３例ＰＶ患者,至完全缓解停药并继续随访。结果：１￣２μｍｏｌ／Ｌ Ａｓ２Ｏ３注射液诱导Ｋ     

K562细胞硫氧还蛋白还原酶活力测定及其抑制剂体外抗白血病的初步研究

 目的　探讨慢性粒细胞白血病（CML）细胞株K562中硫氧还蛋白还原酶（TrxR）的活力及其新型抑制剂乙烷硒啉（BBSKE）体外抗白血病作用。方法　应用胰岛素还原法检测K562细胞株及健康人骨髓单个核细胞中TrxR的活力。运用CCK-8法测定BBSKE对K562细胞的增殖抑制率。应用激光共聚焦显微镜、琼脂糖凝胶电泳以及Annexin Ⅴ-FITC／PI双标记流式细胞术观察BBSKE的抗白血病作用。结果　K562细胞中TrxR的活性明显高于健康人骨髓单个核细胞,10 μmol／L BBSKE与K562细胞作用24 h,激光共聚焦显微镜可见典型的细胞凋亡表现,琼脂糖凝胶电泳后可见典型的DNA“梯”条带出现,流式细胞术检测凋亡率为（10.28±2.74）%;10 μmol／L BBSKE对CML患者原代细胞有诱导凋亡的作用,凋亡率为（5.70±0.48）%。结论　慢性粒细胞白血病细胞株K562中TrxR活力高于健康人骨髓单个核细胞,BBSKE有抑制TrxR活力、抑制K562细胞增殖和诱导凋亡的作用,是治疗CML潜在的有效药物。     

六亚甲基二乙酰胺对K562细胞作用的实验研究

目的：研究六亚甲基二乙酰胺（HMBA）体外对K562细胞的抑制增殖、诱导凋亡和促进分化的作用。方法：MTT法检测不同浓度HMBA对于K562细胞的增殖抑制率;流式细胞仪（FCM）检测HMBA对于K562细胞周期分布的影响;Annexin V／PI染色方法检测HM—BA诱导K562细胞凋亡的作用;通过瑞氏染色、联苯胺染色和FCM检测分化抗原研究K562细胞分化情况。结果：HMBA可以抑制K562细胞增殖,1、2、3和4mmol／L对K562细胞增殖抑制率分别为21．97％、36．05％、41．56％和47．59％;HMBA可以阻滞K562细胞周期,主要表现为G0／G1期的阻滞;HMBA诱导K562细胞凋亡的作用不明显,4mmol／L的HMBA对K562细胞诱导凋亡率〈5％;HMBA处理后,瑞氏染色显示K562细胞有一定程度的成熟表现,联苯胺染色基本为阴性;K562细胞膜表面CD11b、CD14、CD68和胞质内溶茵酶抗原的表达在HMBA处理前后均为阴性。结论：HM—BA可以抑制K562细胞的增殖,提示具有一定的治疗作用;HMBA对K562的作用机制和阻滞细胞周期有关,诱导凋亡不是主要作用机制;HMBA有促进K562细胞分化的迹象,但分化方向和机制有待进一步研究。     

三氧化二砷联合miR-203对人白血病K562细胞的抑制作用及其机制

目的： 研究三氧化二砷（As 2O 3）联合过表达的微小RNA-203（microRNA-203,miR-203）对白血病K562细胞的抑制作用及其可能的分子机制。 方法： 将miR-203的真核表达载体pmiR-203转染K562细胞,Real-time PCR检测细胞内miR-203的表达。将K562细胞分为空白对照组、As 2O 3组、pmiR-203组、空质粒对照组、As 2O 3联合空质粒对照组和As 2O 3联合pmiR-203组,MTT法检测各组细胞增殖抑制率,流式细胞术仪检测细胞凋亡率,Western Blotting检测细胞内Bcr/abl蛋白的表达水平。构建Bcr/abl 3′UTR和Bcr/abl mut-3′UTR的双荧光素酶报告基因载体,将其与pmiR-203共转染K562细胞,通过荧光素酶活性分析判断miR-203是否与Bcr/abl基因的3′UTR结合。 结果： miR-203的真核表达载体pmiR-203转染K562细胞后,细胞内miR-203的表达水平明显增高( P <0.05)。高表达miR-203联合As 2O 3使K562细胞对As 2O 3的敏感性提高到单用As 2O 3的4.86倍,IC50 从3.4 μmol/L降低至0.7 μmol/L,两者联用表现为协同作用。As 2O 3联合pmiR-203组的细胞凋亡率显著高于As 2O 3联合空质粒对照组\[（29.97±3.19）% vs （10.77±1.71）%, P <0.05\]。过表达miR-203显著下调K562细胞内Bcr/abl蛋白的表达水平。Bcr/abl 3′UTR中带有明确的miR-203结合位点。 结论： miR-203可提高白血病K562细胞对As 2O 3的敏感性,miR-203和As 2O 3联用对K562细胞具有协同抑制作用,其作用机制可能与miR-203直接下调Bcr/abl融合基因的表达有关。     

以microRNA-17为靶点的反义核酸对白血病细胞K562的作用

目的 研究以microRNA-17(miR-17)为靶点的反义核酸对人类白血病K562细胞的生长抑制作用.方法 人工合成miR-17的反义核酸,硫代修饰,用Lipofectamine 2000转入K562细胞.四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测转染反义核酸后K562细胞的增殖活性,流式细胞术(FCM)检测细胞的凋亡水平,实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测反义核酸作用后K562细胞内miR-17的相对表达水平.结果 MTT结果显示,转染反义核酸后的24、48、72 h,K562细胞的增殖活性分别为0.872±0.001、0.710±0.002、0.551±0.001,与随机核酸序列组(随机对照组)(增殖活性分别为1.001±0.002、1.009±0.003、1.211±0.003;t值分别为182.58、269.77、660.40)、空白对照组(增殖活性分别为1.113±0.001、1.114±0.001、1.101±0.001;t值分别为537.98、571.20、1230.51)相比较差异有统计学意义(均P＜0.05);FCM检测结果表明,在转染反义核酸48 h后细胞的凋亡率为(20.14±0.01)％,与随机对照组的(3.54±0.02)％及空白对照组的(1.98±0.01)％比较差异有统计学意义(t分别为2347.6、2568.2,均P＜ 0.01);实时荧光定量PCR结果证实,在反义核酸作用后,K562细胞内miR-17的相对表达水平(0.07)明显下降,与随机组(1.00)、空白组(1.01)相比较差异有统计学意义(t值分别为148.63、147.04,均P＜0.05).结论 以miR-17为靶点的反义核酸可抑制K562细胞的增殖活性,并显著促进细胞的凋亡.