棘阿米巴分离株的分子生物学特性研究

[目的]研究土壤和淡水中分离的3种棘阿米巴分离株分子生物学特性.[方法]提取棘阿米巴株CJY/S3,CG/S1和CJY/W1基因组18SrDNA,行PCR扩增后测定序列,与T1^T13型序列进行比较分析;提取线粒体DNA用EcoRⅠ酶切,观察限制性片段长度多态性(RFLP).[结果]3种棘阿米巴分离株CJY/S3,CG/S1和CJY/W1的18S rDNA大小分别为2 292,2 292,2 252bp.CG/S1和CJY/S3的基因型为T5,基因序列接近于A.lenticulata 68-2;CJY/W1的基因型为T13,基因序列接近于Acanthamoeba sp.U/HC1株.CJY/S3和CG/S1株显示相同的线粒体DNA片段模式,不同于CJY/W1株.[结论]棘阿米巴CJY/W1株与CJY/S3,CG/S1株具有不同的分子生物学特性.     

飞行员线粒体DNA调控区基因多态性分析

目的探讨线粒体DNA调控区基因多态性与飞行员飞行耐力的关系。方法利用聚合酶链反应和限制性片段长度多态性分析（PCR—RFLP）分析86例飞行员和80例普通人群线粒体调控区基因多态性。结果飞行员线粒体DNA调控区RFLP分布与普通人群有统计学差异。结论线粒体DNA调控区基因多态性可能在飞行员的飞行耐力中起重要作用。     

人巨细胞病毒株DNA限制性片段长度多态性分析

为深入开展人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）感染的分子流行病学和发病机理研究，作者从不同人群获得１０株ＨＣＭＶ，经培养、传代和增殖后提取病毒ＤＮＡ，而后分别用限制性内切酶ＨｉｎｄⅢ和ＥｃｏＲＩ消化，用３２Ｐ标记的ＨＣＭＶＤＮＡＨｉｎｄⅢ亚克隆片段（ｐＣＭ１０１５、ｐＣＭ１０３５）做探针，进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交和限制性片段长度多态性分析。结果显示：该１０株ＨＣＭＶ的主要限制性片段与标准株ＡＤ１６９相同，证明该病毒基因组的结构相当稳定，但其Ｌ－Ｓ结合区和末端片段有变异，表现为酶切位点的丢失或获得；流行病学上相关毒株限制性酶谱相似，而无相关毒株的限制性酶谱则有所不同。由此表明，以ＥｃｏＲＩ酶切片段与ｐＣＭ１０３５探针杂交易于发现其基因组变异。临床毒株的Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析可用于ＨＣＭＶ感染的分子流行病学和发病机理的研究。     

棘阿米巴延吉土壤分离株CJY/S3的18S rDNA基因型鉴定

致病性自由生活棘阿米巴(Acanthamoeba sp.)广泛存在于土壤、水、空气、腐败物等自然环境中,某些虫种可引起人体棘阿米巴性角膜炎(acanthamoeba keratitis,AK)和肉芽肿性阿米巴性脑炎(granulomatous amoebic encephalitis,GAE)[1-2].棘阿米巴不仅可直接对人体致病,还可作为部分致病性细菌的宿主,如军团菌(Legionella pneumophila)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、大肠杆菌(Escherichia coli O157)、分枝杆菌(Mycobacterium marinum)等[3-5].     

聚合酶链反应与限制性片段长度多态性分析检测沙门菌

沙门菌是常见的人畜共患致病菌 ,有 2 32 4个血清型。在我国发现 2 6个菌群 ,16 1个血清型 ,人群中最常见的是伤寒杆菌 (Ｓ ,ｔｙｐｈｉ) ,肠炎沙门菌(Ｓ ,ｅｎｔｅｒｉｔｄｉｓ)等 10余种 ,临床上常见的为肠炎型 ,口服此型细菌污染的食物引起中毒 ,潜伏期短 ,发病急。目前对沙门菌的检测仍沿用传统分离培养及血清学方法 ,不仅繁琐 ,需要 4～ 7天才能出报告 ,而且检出率低 ,已不适于临床的快速诊断。因此 ,建立快速而特异的检测方法具有重要的流行病学意义和临床应用价值。本文在传统聚合酶链基础上 ,引入限制性内切酶片段长度多态性分析法 …     

广东地区土壤中分离的棘阿米巴CG/S1株的18Sr DNA基因分析

[目的]从广东地区土壤中分离棘阿米巴CG/S1株,测定其18 SrDNA基因序列.[方法]从土壤中分离棘阿米巴CG/S1株,提取基因组18 S rDNA,应用棘阿米巴属特异性引物进行PCR扩增,测定序列,用分子生物学软件Clustal X进行序列分析,并与其他棘阿米巴分离株进行比较分析.[结果]棘阿米巴CG/S1的18 S rDNA全基因序列为2 292 bp,基因型为T5型;CG/S1与A.lenticulata7327株的序列差异率为0.61%,与CB/S1株的序列差异率为0.74%.[结论]广东地区土壤中分离的棘阿米巴Acanthamoeba sp.CG/S1为A.lenticulata株.     

St14/BclⅠ限制性片段长度多态性基因频率

St14-1(DXS52)是位于人X染色体长臂远端的一段DNA顺序,与第Ⅷ凝血因子(FⅧ:C)基因紧密连锁.用其作探针,BcII酶切,对人基因组DNA进行Southern印迹杂交分析,可检测到一限制性片段长度多态性(RFLP).我们分析广东地区汉族人群中st14/BcII RFLP,等位基因片段长度分别为17.4kb和16·6kb(见附图).15条无遗传关系的X染     

Ha-ras在正常人和胃癌患者DNAs的限制性片段长度多态性研究

以癌基因 Ha-ras 为探针,对10例正常人组织和22例人胃癌组织的 DNA 用限制性内切酶 Bam HI 酶切后,再通过瑟慎印迹法(Southern Blot)杂交,发现正常组织中的 Ha-ras 常见等位片段的出现频率高于胃癌组织,而稀有等位片段的出现频率低于胃癌组织;正常组织中Ha-ras常见等位基因纯合子的出现频率高于胃癌组织,而稀有杂合子的出现频率低于胃癌组织。提示 Ha-ras 限制性片段长度多态性(RFLPs)和胃癌可能存在着连锁关系。     

耐拉米夫定乙肝病毒变异株的人工构建及其限制性片段长度多态性分析

目的　建立简便易行的筛检常见的耐拉米夫定乙肝病毒变异株的方法。方法通过PCR定向点突变 ,构建最常见的耐拉米夫定乙肝病毒变异株 (YMDD变异株 ) ,并建立相应的错配PCR结合限制性片段长度多态性分析 (RFLP)检测此变异株。结果PCR成功引入点突变 ,构建了YMDD变异株的克隆 ,同时错配PCR结合限制性片段长度多态性分析可有效区分YMDD变异株和HBV野毒株。结论采用PCR的方法可诱导定向点突变 ,错配PCR结合限制性片段长度多态性分析可用于筛检临床常见的耐拉米夫定乙肝病毒变异株 (YMDD变异株 ) ,为临床监测提供了一种很好的模式。     

3个鼠源性肿瘤线粒体DNA编码区基因RFLP分析

目的了解线粒体DNA突变在肿瘤发生发展中的作用.方法应用PCR-限制性片段长度多态性分析技术对LA795、CT26和SCC891等3个肿瘤细胞系mtDNA编码区基因片段进行了分析.结果 mtDNA编码区的tRNAMet Glu Ⅰle及NDI基因核酸片段经HaeⅢ等16种内切酶消化后,这些肿瘤细胞系表现出完全相同的酶切图谱,其酶切格局及酶切片段大小完全相同.结论本组肿瘤细胞系mtDNA编码区基因结构相对稳定.     

60株临床分离犬小孢子菌的聚合酶链反应-限制性片段长度多态性鉴定

目的探索采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）方法进行犬小孢子菌的快速鉴定。方法采用真菌通用引物第1内转录间隔区（ITS-1）与第4内转录间隔区（ITS-4）对60株犬小孢子菌进行PCR扩增,然后利用限制性内切酶TaqⅠ和HinfⅠ分别对PCR产物进行酶切分析。结果真菌通用引物ITS-1和ITS-4在60株犬小孢子菌中均扩增出1条长约750 bp的DNA条带;2种内切酶HinfⅠ和TaqⅠ各自显示相同的酶切结果,酶切片段稳定而清晰。结论应用PCR-RFLP方法可以快速、敏感、特异地鉴定犬小孢子菌。     

Detection of bacterial pathogens in cerebrospinal fluid using restriction fragment length polymorphism

Background: Polymerase chain reaction (PCR) is useful for rapid microbial detection in body fluids with low microbial load. It is easier to use universal or broad range primers for the amplification of conserved stretches of DNA common to all bacteria like 16S rRNA gene, followed by restriction fragment length polymorphism (RFLP) of PCR products.     

应用错配PCR和限制性片段长度多态性分析技术检测HBV YMDD变异株

目的：建立简便易行的检测乙型肝炎病毒（HBV）多聚酶基因（P基因）上YMDD变异株的方法，评价运用拉米夫定治疗慢性乙型肝炎患对此变异的影响，方法：采用套式／错配聚合酶链反应（PCR）结合限制性片段长度多态性（RFLP）分析技术对108例治疗前HBV DNA（PCR）阳性正在拉米夫定治疗中的慢性乙型肝炎患者的HBV YMDD变异情况进行检测。结果：运用上述技术能有效区分HBV YMDD野生株和变异株，上述108例患者经拉米夫定治疗后，HBV DNA阴转者63例（58．3％），HBV YMDD野生株和变异株分别为23例（21．3％）和22例（20．4％），结论：建立的套式／错配PCR－RFLP分析技术可用于HBV YMDD变异株的临床监测，拉米夫定治疗慢性乙型肝炎患者可导致部分患者的HBV多聚酶基因上YMDD发生变异。     

碱裂解法快速提取口腔拭子DNA对CHRNA3基因多态性的研究

目的 建立一种快速的从口腔拭子中提取DNA的方法,研究其在尼古丁乙酰胆碱受体α3(CHRNA3)基因多态性分析中的应用.方法 以NaOH和乙二胺四乙酸(EDTA)配制碱裂解液,以三羟甲基氨基甲烷-EDTA(TE)为中和液,经加热裂解和中和两步提取口腔拭子DNA.以提取的DNA为模板,用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析对CHRNA3基因的rs6495309进行分型.对不同基因型的样本测序验证.结果 PCR扩增和酶切的靶带清晰,无非特异性条带.酶切结果与测序结果吻合.结论 碱裂解法提取口腔拭子DNA具有快速、简便、经济、可靠的特点,可以用于CHRNA3基因多态性的分析.     

运用限制性长度多态性和单链构象多态性技术鉴别大肠杆菌血清型

目的　扩增大肠杆菌GroEL基因并通过限制性长度多态性 (RFLP)和单链构象多态性 (SSCP)分析 ,探讨进行大肠杆菌血清型鉴定的可行性。方法　选择大肠杆菌GroEL基因作为鉴别的靶基因 ,通过设计合适的通用引物进行PCR扩增 ,并对 5种不同血清型大肠杆菌扩增产物的酶切片段进行RFLP分析和SSCP分析。结果　运用通用引物可以扩增出 5种不同血清型大肠杆菌的GroEL基因 ,PstI酶切产物的RFLP分析表明 ,不同血清型大肠杆菌表现出不同的RFLP图谱 ,SSCP分析表明 ,图谱变异性更大 ,有利于进行血清型鉴别甚至株间的鉴别。结论　运用PCR RFLP和PCR SSCP可以进行不同血清型大肠杆菌的鉴定诊断     

乙型肝炎病毒毒株X基因/C基因启动子的热点变异

目的ＨＢＶ／Ｘ基因存在调控ＨＢＶ复制的调节序列,Ｘ基因变异将影响这些调节序列功能,研究中国ＨＢＶ毒株Ｘ基因／Ｃ基因启动子（ＢＣＰ）区的变异情况。方法设计ＢＣＰ下游反义链错配引物,将点突变附近的一个碱基（ｎｔ１７６７）由Ａ→Ｔ,则正好可在ＢＣＰ变异株中引进一个ＢｃｌＩ（Ｔ↓ＧＡＴＣＡ）酶切位点,结合限制性片段长度多态性分析（ＲＦＬＰ）筛检１４３例中国人感染的ＨＢＶ毒株ＢＣＰ区变异,并与前Ｃ区变异比较。结果１１４例血清ＨＢＶＤＮＡ阳性慢性ＨＢＶ感染者,ＢＣＰ区和／或前Ｃ区变异者４９例（４３％）,ＢＣＰ变异者３７例（３２％）。ＢＣＰ变异无论在ＨＢｅＡｇ阳性或阴性慢性肝炎病例的发生率均显著高于慢性ＨＢＶ无症状感染者。ＢＣＰ可与前Ｃ终码变异共存或单独出现。结论在中国ＨＢＶ毒株ＢＣＰ区存在热点变异。ＨＢＶ毒株ＢＣＰ变异可能影响ＨＢＶ前Ｃ基因组ｍＲＮＡ转录,是ＨＢＶ感染持续和肝病变进展的原因之一。     

红花基因组扩增片段长度多态性反应体系的建立和优化

目的:探讨影响红花扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)的各种因素,建立并优化红花AFLP反应体系,为研究红花品质性状的遗传基础及建立分子辅助标记育种的技术平台奠定基础.方法:CTAB法提取红花基因组DNA,用Beckman紫外可见分光光度计测定样品DNA浓度与纯度质量(D值);检测后分别进行一步法酶切与连接,或两步法酶切与连接,以检测哪种方法更适合;酶切连接产物设置不同的稀释倍数(5倍、10倍、15倍、20倍、25倍和30倍)进行预扩增,预扩增产物设置不同稀释倍数(10倍、25倍、50倍、75倍、100倍、150倍和200倍)进行选择性扩增;选择性扩增产物95℃变性8 min后,用6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,银染检测.结果:本研究建立适用于红花的AFLP体系:用乙醇沉淀DNA,建立的模板不含PCR反应抑制剂及其他酶反应抑制剂,可被限制性内切酶MseⅠ和EcoRⅠ完全酶切;确定两步法进行酶切、连接,酶切时间为37℃ 3 h,连接16℃过夜,缓冲液采用NEB公司Buffer 2;预扩增产物最佳稀释倍数为25倍;选择性扩增最佳稀释倍数为75倍;上述建立的AFLP反应体系,PAGE电泳中主带清晰,没有降解.结论:本研究建立的反应体系适用于红花基因组DNA的AFLP研究.