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相似文献
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1.
目的建立基于TaqMan探针三重荧光PCR检测沙门菌(salmonella,Sa)、肠炎沙门菌(salmonella enteritidis,SE)和鼠伤寒沙门菌(salmonella typhimurium,ST)的方法。方法根据沙门菌aceA基因、肠炎沙门菌特异序列(GenBank:AF370707.1)、鼠伤寒沙门菌的STM4599序列(GenBank:AERV01000023.1),分别设计引物和TaqMan探针,在探针的5′端分别标记FAM、VIC、cy5,建立基于TaqMan探针三重实时荧光PCR检测沙门菌的方法。结果 29种不同血清型沙门菌均扩增出aceA基因,肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌的引物和探针分别特异性地扩增出15株肠炎沙门菌和11株鼠伤寒沙门菌,而其他血清型沙门菌和17株非沙门菌扩增结果阴性。aceA、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌的三重荧光PCR扩增效率分别为89%、87%、90%,最低检测浓度分别达到280cfu/ml、260cfu/ml、300cfu/ml。结论本研究建立的方法特异性好、灵敏度高,可用于食品中沙门菌、肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌的特异性检测。  相似文献   

2.
目的建立基于TaqMan探针双重荧光PCR检测鼠伤寒沙门菌和(Salmonella typhimurium,ST)和肠炎沙门菌(Salmonella enteritidis,SE)的方法。方法根据ST的STM4599序列(GenBank:AERV01000023.1)和SE特异序列(GenBank:AF370707.1),分别设计引物和探针,ST探针的5'端标记FAM、SE探针的5'端标记VIC,建立基于TaqMan探针双重荧光PCR检测方法。结果 ST和SE的引物和探针分别特异性地扩增出16株ST和15株SE,而28种不同血清型沙门菌和17株变形杆菌等扩增结果均为阴性。ST和SE的双重荧光PCR扩增效率均为94.2%,R2分别为0.998和0.995,最低检测浓度分别达到300 CFU/ml、260 CFU/ml。结论建立的方法特异性好、灵敏度高,整个试验可在31h完成,是快速检测ST和SE的有效方法,可用于食品中ST和SE的特异性检测。  相似文献   

3.
[目的]建立实时荧光TaqManTM检测沙门氏菌的快速检测方法,为食物中毒快速准确的定性检测及食品中沙门氏菌染菌的调查提供手段,也为建立实时荧光TaqManTM同时检测多种细菌性食物中毒目标菌奠定基础. [方法]通过分析沙门氏菌invA、hilA、fimA、hns、spy、hut基因和16S rDNA等目的基因,对比不同目的基因的优缺点,最终选择hut基因作为目的基因,在Genebank进行中查找多条hut基因序列,并利用DNAssist软件进行同源性分析,选取相对保守区段,用Beacon Designer软件自行设计引物和TaqManTM探针,并利用硅胶模型基因组DNA提取法制备基因组DNA,通过对TaqManTM实时荧光PCR缓冲液浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度、Taq酶浓度、引物浓度和探针浓度等反应条件的优化,初步建立沙门氏菌的TaqManTM实时荧光PCR快速检测方法. [结果]选取的hut基因同源性达到99%以上,特异性好.通过对各实验条件的优化,得到沙门氏菌TaqManTM实时荧光PCR的最佳反应条件,初步建立TaqManTM实时荧光PCR检测沙门氏菌的快速检验方法,该方法能在1h内完成整个检测过程.[结论]TaqManTM实时荧光PCR检测不但灵敏度高、特异性好,而且检测周期短,能提高沙门氏菌的检出率和检测准确性,可望应用于沙门氏菌食品及食物中毒的快速定性检测.  相似文献   

4.
目的利用荧光定量PCR技术,研制适合各层次实验室使用的,快速、准确地检测鉴定食品中副溶血弧菌污染的定性、定量方法。方法根据副溶血弧菌gyrase基因序列,设计并合成特异性引物和荧光标记探针,将扩增后的特异片断制成阳性模板,绘制标准曲线。以副溶血弧菌菌株8株及同源、非同源参考菌株24株,做特异性检测;将阳性污染菌按梯度加入阴性样品为模拟样本,做敏感性检测。同时使用PE7000型定量PCR仪和国产DA620微量荧光检测仪检测。结果该方法有良好的特异性:8株副溶血弧菌结果均为阳性,而其它24株菌株均为阴性(其中8株是弧菌科,16株分别来自不同的菌属);该方法有良好的敏感性:阳性模板浓度与定量曲线循环阈值之间相关系数达到0.9871。在纯培养的条件下,其检测低限为10cfuml。对32个模拟样本直接进行定量检测,则检测低限在102cfug;经过24小时增菌培养,检测低限可达2cfug。结论该方法特异性强、敏感性高,操作简便快速,能避免常规PCR方法易污染的缺陷,在国产仪器上测试同样取得较好的敏感性和特异性,便于基层实验室使用,具有很好的推广应用前景。  相似文献   

5.
《中国预防医学杂志》2015,16(10):774-780
摘要:目的 建立基于TaqMan探针三重荧光PCR 检测沙门菌(狊犪犾犿狅狀犲犾犾犪,Sa)、肠炎沙门菌(SE)和鼠伤寒沙门菌(ST) 的方法。方法 根据沙门菌犪犮犲犃基因、肠炎沙门菌特异序列(GenBank:AF370707.1)、鼠伤寒沙门菌的STM4599 序列(GenBank:AERV01000023.1),分别设计引物和TaqMan探针,在探针的5′端分别标记FAM、VIC、cy5,建立基于TaqMan探针三重实时荧光PCR 检测沙门菌的方法。结果 29 种不同血清型沙门菌均扩增出犪犮犲犃基因,肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌的引物和探针分别特异性地扩增出15株肠炎沙门菌和11株鼠伤寒沙门菌,而其他血清型沙门菌和17株非沙门菌扩增结果阴性。犪犮犲犃、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌的三重荧光PCR 扩增效率分别为89%、87%、90%,最低检测浓度分别达到280cfu/ml、260cfu/ml、300cfu/ml。结论 本研究建立的方法特异性好、灵敏度高,可用于食品中沙门菌、肠炎沙门菌和鼠伤寒沙门菌的特异性检测。  相似文献   

6.
[目的]建立阪崎克罗诺杆菌TaqMan—MGB探针实时荧光定量聚合酶链反应(RT.PCR)快速检测方法。[方法]在阪崎克罗诺杆菌保守序列设计一对特异性引物和TaqMan—MGB探针,通过对PCR反应条件和扩增体系的优化,建立阪崎克罗诺杆菌TaqMan—MGB探针实时荧光PCR检测方法;用已知浓度的阪崎克罗诺杆菌验证其敏感性;用阪崎克罗诺杆菌、大肠埃希菌、鸭沙门菌株、柠檬酸杆菌等菌株验证其特异性;用婴幼儿配方粉等食品开展TaqMan—MGB探针实时荧光PCR技术与常规检测方法符合性比较。[结果]本研究建立的阪崎克罗诺杆菌实时荧光PCR检测技术,反应循环(cyclethreshold,CT)值-9模板浓度的对数值具有良好的对应关系[Y=-3.06×log(X)+36.63,R^2=0.999],最低检测浓度为100CFU/mL,经36℃增菌8h最低检测限可达1CFU/mL,敏感性较普通TaqMan探针高10倍;11株阪崎克罗诺杆菌CT值均小于30,而大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌、柠檬酸杆菌等30株菌株CT值大于30或扩增曲线成一平滑直线;隔天连续5次反应CT值变异系数小于5%;140件不同批次不同婴幼儿配方粉、192件婴幼儿谷物辅助食品检测结果与常规分离培养比较,差异无统计学意义(X^2=0.624,P〉0.05)。[结论]阪崎克罗诺杆菌TaqMan—MGB探针实时荧光PCR快速检测技术具有特异性强、敏感性高、易操作等优点,适用于婴儿配方粉等食品开展阪崎克罗诺杆菌快速检测与监测工作。  相似文献   

7.
目的建立一种布鲁氏菌S2疫苗株的实时荧光定量PCR检测体系。方法依据布鲁氏菌S2疫苗株与其他布鲁氏菌参考菌株全基因组序列的差异, 设计引物和探针, 建立实时荧光定量PCR检测体系。自中国疾病预防控制中心传染病预防控制所, 收集22株布鲁氏菌参考菌株及8种非布鲁氏菌对照菌株的DNA;同时自布病疫苗生产厂采集环境样本, 使用血液/组织基因组DNA提取试剂盒提取环境样本细菌DNA。对获取的DNA先行普通PCR预扩增, 再以扩增的PCR产物为模板进行实时荧光定量PCR二次扩增(巢式荧光定量PCR), 观察是否出现特异荧光曲线及相应的循环数(Ct值), 并测试其灵敏性。结果建立的实时荧光定量PCR检测体系, 除S2疫苗株外, 其他21株布鲁氏菌参考菌株和8种非布鲁氏菌对照菌株均未检出特异荧光曲线(无Ct值)。建立的检测体系, 检测布鲁氏菌S2疫苗株DNA的最低限为4.34 fg;采集的14份环境样本, 其中3份检测到布鲁氏菌S2疫苗株DNA。结论建立的实时荧光定量PCR检测体系, 能够检测到样本中布鲁氏菌S2疫苗株, 具有较好的灵敏性和特异性。  相似文献   

8.
王芳  陈智  伍雅婷  熊燕 《现代预防医学》2018,(21):3968-3971
目的 探讨在食源性疾病病例监测中,多重PCR方法用于沙门氏菌的血清型分型的适用性。方法 利用多重PCR方法对113株分离自食源性疾病病例的沙门氏菌进行血清分型,得到菌株可能血清型。同时,菌株血清型经Luminex xMAP()沙门氏菌血清分型法及传统的血清玻片凝集方法最终确定。比较可能血清型与菌株确定血清型间的符合程度,探讨多重PCR方法用于沙门氏菌血清分型的适用性。结果 在113株菌株中共检出23个沙门血清型。多重PCR方法可准确推测其中11个血清型,涵盖了113株中的94株(83.2%)。结论 多重PCR方法为食源性疾病监测中的沙门氏菌血清分型提供了简便快速、价格低廉的辅助方式,利于在基层公共卫生实验室推广。  相似文献   

9.
目的建立快速、准确、特异的检测细菌16S rRNA基因的实时荧光PCR法。方法根据Taq Man探针技术实时荧光PCR反应原理结合细菌16S rRNA基因序列,在高保守区域设计通用引物和特异性探针,对10种标准菌株及15种临床培养分离菌株进行PCR检测,优化反应体系,评价该方法的特异性、灵敏度、重复性,并对187份标本采用培养法和实时荧光PCR法进行检测比较。结果 10种标准株和15种临床培养株采用通用引物检测全阳性,9株革兰阳性菌株通过革兰阳性探针检测全阳性,16株革兰阴性菌株通过革兰阴性探针检测也全阳性。187例临床标本经实时荧光PCR检测阳性率为16.22%(30/185),培养法检出率为9.73%(18/185),2种方法革兰菌分型结果一致,细菌检出率前者明显高于后者,差异有统计学意义(P0.05)。结论多探针实时荧光PCR法检测细菌16S rRNA具有敏感性高、特异性强、方便快捷等特点,可在细菌感染性疾病中给临床医生提供更全面的病原学资料,早期指导抗生素的应用。  相似文献   

10.
基于Taqman探针双重实时荧光PCR检测单增李斯特菌   总被引:1,自引:0,他引:1  
目的:建立双重荧光PCR对单增李斯特菌(LMO)特异性检测同时检测其毒力基因的方法。方法:根据LMO溶血素基因hlyA和內华素基因InlA的保守序列分别设计特异性引物和Taqman探针,优化多重荧光PCR反应体系,进行特异性、敏感性试验。结果:用建立的方法检测LMO标准菌株和24株分离株均出现hlyA和InlA扩增曲线,而沙门菌等其他菌株未见扩增曲线;敏感性试验结果方法的敏感性达到2.5×102 cfu/ml。结论:本研究建立的LMO实时荧光PCR检测方法特异性好、灵敏度高,是快速检测LMO及其毒力基因的有效手段,可用于食品中LMO检测。  相似文献   

11.
A two-step real-time SYBR Green I multiplex polymerase chain reaction (PCR) assay with melting curve analysis was developed for rapid detection of 19 Salmonella serotypes frequently encountered in humans, animals, and animal-associated meat products within the European Union. The first-step single-tube reaction (Multiplex PCR I), consisting of five primer pairs, classified an initial test panel of eight Salmonella serotypes into five groups on the basis of characteristic amplicon melting temperatures produced by each strain. Following designation into groups, two subsequent triplex reactions (Multiplex PCR II-G1 and II-G3) allowed for further identification of five Salmonella serotypes by their melting peak temperatures. Primers for serotype differentiation were designed to target the genes encoding either phase 1 and 2 flagellar antigens fliC and fljB or unique serotype-specific loci. In addition, the assay simultaneously screened for the presence of the ampicilin-amoxicillin, chloramphenicol-florfenicol, streptomycin-spectinomycin, sulfanomides, and tetracycline (ACSSuT)-type multidrug resistance pattern, indicated by the floR gene, and for the Salmonella virulence plasmid encoded by the svp operon in Salmonella serotype Typhimurium. The established multiplex assays were successfully tested on 97 isolates, comprising 37 distinct Salmonella serotypes and 12 non-Salmonella strains. The two-step assay correctly detected 19 of 37 Salmonella serotypes and all non-Salmonella strains produced negative results. Of the 19 serotypes detected in the assays, 7 serotypes, including Salmonella serotypes Ohio, Goldcoast, Livingstone, Kedougou, Enteritidis, Kentucky, ACSSuT-type Salmonella serotype Typhimurium DT104 and DT104b, as well as non-ACSSuT-type Salmonella serotype Typhimurium strains, were definitively identified. The developed multiplex real-time SYBR Green I PCR assay represents a more rapid and reliable method for identification of large numbers of Salmonella serotypes prevalent throughout the European Union than assays using phenotypic serotyping methods.  相似文献   

12.
Yan L  Wang X  Guo Y  Pei X  Yu D 《卫生研究》2011,40(3):348-51, 354
目的比较增菌-PCR法与传统方法检测禽肉中沙门菌的敏感性、特异性和时效性。方法以沙门菌invA基因为基础,选择特异性引物,采用30株沙门氏菌和18株非沙门菌建立并验证PCR法的特异性。选用肠炎沙门菌CMCC50041,参照GB4789.4—2010进行人工染菌实验,染菌量分别为每25g样本1、10、102、103、104、105和106 CFU。分别在增菌0、4、8、12和18h取1ml培养液,提取DNA进行PCR检测,并同时划线接种选择性平板,用传统方法进行分离鉴定,比较两种方法检测的敏感性和特异性。采集16份市售整鸡样本,用这两种方法进行检测,进一步比较两者的阳性检出率。结果 30株沙门菌都检出阳性,而非沙门菌都检测为阴性,说明本研究建立的PCR法特异性好。人工染菌的样本在增菌12h后,PCR法检出限可达每25g禽肉样本1CFU,传统方法检出限为每25g禽肉样本10CFU。增菌-PCR法整个流程只需要1天,比传统方法需时提前4~6天。16份市售样本,增菌-PCR法的阳性率为43.75%(7/16),高于传统方法31.25%(5/16)。结论增菌-PCR法具有快速简便、敏感特异等优点,较传统方法大大缩短了检出时限,提高了沙门菌的检出率。  相似文献   

13.
目的优化沙门菌REP-PCR分子分型技术,并在沙门菌耐药菌株分型研究中应用,为构建沙门菌同源性追踪体系提供数据。方法以肠炎沙门菌510041基因组DNA为模板,根据参考文献确定REP引物,PCR扩增其基因组中靶序列。对反应体系模板量、Mg2+浓度和引物浓度的优化,采用对优化项目设置梯度,其它条件不变的方法进行。以优化的REP-PCR法分析24株沙门菌流行耐药株REP-PCR指纹图谱。根据指纹图谱条带对菌株进行分型,并将分型结果与菌株耐药谱分型结果作比较。结果PCR反应体系DNA模板量100ng/25μl,Mg2+浓度2.0mmol/L,上下游引物浓度各0.4μmol/L时,指纹图谱条带最清晰、明亮;不同血清群和血清型沙门菌株间REP-PCR指纹图谱差异较大,可在0.5kb到2.5kb范围内出现2至6条条带;24株沙门菌流行耐药株用该法可分为15型,根据耐药谱可分为7型。结论建立了优化的沙门菌REP-PCR分子分型技术;REP-PCR指纹图谱分型比耐药谱分型更加敏感。  相似文献   

14.
目的利用荧光定量PCR技术,建立食品中沙门菌污染的快速敏感特异的检测方法。方法以沙门菌的fimY基因作为靶序列,设计一对引物和探针,以沙门菌菌株提取核酸DNA作为模板,优化引物和探针的浓度比和Mg^2+浓度,以沙门菌和10种相关细菌考核检测体系的灵敏性、稳定性和特异性,并初步应用于样品的检测。结果本研究建立的反应体系在引物和探针的浓度为0.8μmol/L,1.0μmol/L,Mg^2+浓度为3mmol/L时,具有良好的特异性和敏感性。在10株相关菌株的检测中,除沙门菌出现很好的阳性外,其余菌株均为阴性。在纯菌条件下,定量检测低限33cfu/ml。稳定性分析表明:同一样品重复检测3次Ct值的变异系数均小于5%。检测样品结果显示实时PCR方法较传统方法敏感、快捷、简便。结论该方法特异性强,稳定性高,操作简便快捷,适应食品微生物检验发展需要,具有较大的推广及应用价值。  相似文献   

15.
目的优化沙门菌基因间共有重复序列-PCR(ERIC-PCR)分子分型方法,分析沙门菌标准菌株及流行分离株基因组DNA ERIC-PCR指纹图谱。方法提取鼠伤寒沙门菌基因组DNA作为模板,根据ERIC核心片段设计引物,运用ERIC-PCR技术扩增沙门菌基因组中的靶序列,PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后用凝胶成像分析仪对图谱进行观察分析。反应体系中模板量、Mg2+浓度、引物浓度和退火温度的优化实验则采用对优化项目设置梯度、其它条件不变的方法进行。以优化好的ERIC-PCR方法对16株沙门菌及1株大肠杆菌进行分析。结果在总体积为25μl的反应体系中,选择DNA模板量为100ng/25μl,Mg2+浓度为2.0mmol/L,引物ERIC1R、ERIC2浓度分别为0.4μmol/L,退火温度为52℃时,扩增产物的电泳图谱条带最清晰完整。不同血清群、型和来源的沙门菌株间基因组DNA ERIC-PCR指纹图谱带型差异较大,可在250~5000bp范围内出现3~13条条带,并在250bp处出现一条特征条带。结论优化了沙门菌ERIC-PCR的重要反应条件。ERIC-PCR法能区分不同来源的沙门菌,可用于沙门菌病的流行病学调查和同源性追踪,弥补传统分型方法的不足。  相似文献   

16.
多重实时PCR快速同时检测沙门菌和志贺菌   总被引:4,自引:0,他引:4       下载免费PDF全文
目的 建立改良分子信标,多重实时PCR同时检测沙门菌和志贺菌的快速方法,应用于食源性致病菌的快速诊断。方法 根据GenBank公布的沙门菌侵袭性基因invA和ssaR基因,分别设计一对引物和改良分子信标探针,用同色荧光标记,用于同体系检测沙门菌。志贺菌根据ipaH基因的保守序列,设计引物和改良分子信标探针,加入沙门菌检测体系中,建立三重实时PCR一改良分子信标检测体系,应用于同时对沙门菌、志贺菌食物中毒的快速诊断和门诊肠道致病菌的检测。结果 改良分子信标一多重实时PCR反应体系DNA灵敏度为69~93fg/μl。菌液灵敏度为32~64CFU/ml或1~2CFu/PCR反应体系,无交叉反应。该反应体系同时检测134株沙门菌和67株志贺菌,均出现特异的荧光信号,两种细菌检测互不干扰。对细菌性食物中毒样本等共1100份同时进行沙门菌和志贺菌检测,569份沙门菌实时PCR阳性,其中551份沙门菌培养阳性;42份志贺菌实时PCR阳性,其中41份志贺菌培养阳性。从样品处理到检测结果仅需时间2h至1d。结论 改良分子信标-多重实时PCR检测体系快速、灵敏度高,特异性强,可用于沙门菌和志贺菌食物中毒的快速诊断,伤寒、痢疾等肠道传染病的初筛及预防医学门诊的健康人群体检,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段。  相似文献   

17.
环介导等温扩增(LAMP)技术检测沙门菌属方法的建立   总被引:3,自引:1,他引:3  
建立一种检测沙门菌属快速敏感的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法。针对沙门菌属侵袭蛋白(invA)基因序列的六个区域设计四条LAMP引物,65℃保温约60min,完成对沙门菌属的扩增,扩增产物经电泳和酶切鉴定。利用LAMP和普通PCR方法同时检测4株沙门菌和9株非沙门菌(对照组)来验证LAMP方法的特异性;将肠炎沙门菌菌液做一系列10倍稀释后用LAMP和PCR方法进行检测来比较两者敏感性。4株沙门菌扩增出LAMP特征性梯状条带,9株非沙门菌没有出现LAMP扩增,LAMP产物的特异性通过限制性内切酶得到了证实;LAMP检测沙门菌属的特异性与普通PCR相同,但其敏感性比普通PCR高10倍,LAMP检测沙门菌属的检测下限为10cfu/ml,PCR检测下限为100cfu/ml。LAMP检测速度相比PCR更快速,在60min内即可完成扩增反应。建立了一个快速、特异、敏感的沙门菌属LAMP检测方法。  相似文献   

18.
目的 了解贵州省动物性食品中沙门菌的耐药和分子型别特征及二者相关性,为我省食源性沙门菌感染及防控提供科学依据。方法 对贵州省9个市(州)2017—2021年市售动物性食品中分离的146株沙门菌进行血清学分型,采用微量肉汤稀释法测定菌株对15种抗生素的耐药性,脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis, PFGE)和多位点序列分型(multi-locus sequence typing, MLST)对菌株进行分子分型。结果 146株沙门菌分出27种血清型,以鼠伤寒(31/146,21.2%)、德尔卑(26/146,17.8%)、肠炎沙门菌(16/146,11.0%)为优势血清型。146株菌耐药率为79.5%(116/146),多重耐药率达60.3%(88/146),共有72种耐药谱。对氨苄西林、四环素耐药率分别达61%、64.4%。129株菌经PFGE共分出52个聚类76种带型,相似度在53.5%~100%,146株菌经MLST共检出29种ST型,以ST40(26/146,17.8%)、ST34(17/146,11.6%)、ST11(16/146、1...  相似文献   

19.
目的:建立沙门菌实时荧光PCR的快速检测方法,探讨其可行性和应用价值。方法:根据沙门菌的特异性DNA作为靶序列,以沙门菌菌株提取核酸DNA作为模板进行荧光检测。结果:本研究在7种相关菌株的检测中,除沙门菌出现很好的阳性外,其余菌株均为阴性;在纯菌条件下,定量检测低限为30 cfu/ml;同一样品检测3次Ct值的变异系数均小于5%;对模拟标本与分离培养对比,二者符合率为100%。结论:该方法的建立,不仅为食源性沙门菌污染及食物中毒的快速检测提供依据,而且还可直接用于临床粪便标本的检测。  相似文献   

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