体外培养成人脂肪间充质干细胞生物学特性及诱导分化为心肌细胞的研究

目的通过分离、培养脂肪间充质干细胞观察其生物学特性及诱导分化为心肌细胞,为心肌再生提供良好的干细胞来源。方法胶原酶消化分离成人脂肪来源的间充质干细胞并进行传代培养,倒置相差显微镜观察细胞形态,流式细胞仪测定CD29、CD31、CD34、CD44及细胞周期,MTT绘制细胞生长曲线。用第3代细胞进行诱导分化,观察不同浓度5-氮杂胞苷(5-Aza,1,3,5,10,15,20μmol/L)及不同作用时间(12,24,48,72h)诱导其向心肌细胞分化的差别,采用最佳浓度10μmol/L,最佳作用时间24h进行实验,分别在第7,14,21,28天用免疫细胞荧光染色鉴定心肌细胞α-横纹肌、肌球蛋白重链(MHC)、心肌肌钙蛋白I(cTnI)表达,第14天反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测心肌发育相关基因NKX2.5的表达。结果倒置相差显微镜下观察原代细胞,可见细胞呈梭型、核圆形或椭圆形,偶见双核。传代细胞核原代细胞形态相似,排列有了一定的方向性。流式细胞仪检测结果显示,第1、3、5代细胞均高表达CD29和CD44;而CD31始终表达很弱,可认为呈阴性表达;CD34在第1、3代细胞弱表达,在第5代细胞表达逐渐减弱为阴性。细胞生长曲线显示前3d处于细胞潜伏状态,第4天进入对数生长期,第10天达到顶峰。细胞周期检测结果显示G1期细胞为85.93%,S期为7.24%,G2期为6.83%。10μmol/L5-Aza诱导后7d进行免疫细胞荧光染色,未见有α-横纹肌、MHC、cTnI表达。14d少量细胞α-横纹肌和MHC阳性表达,cTnI阴性表达。21d表达α-横纹肌和MHC的细胞数量增多,并可见少量cTnI阳性表达。28dα-横纹肌、MHC、cTnT阳性表达数目均增多,RT-PCR结果显示NKX2.5呈阳性表达。结论成人脂肪中可以分离出脂肪间充质干细胞并且可以在体外培养传代,经过5-Aza的诱导可以向心肌细胞分化,为干细胞移植治疗和组织工程学种子细胞提供了更多的选择。     

黄芪甲苷对体外培养神经干细胞分化作用的研究

目的观察黄芪甲苷对体外培养神经干细胞分化作用的影响。方法利用无血清培养技术在体外对新生Wistar大鼠海马区与神经干细胞进行培养,观察相同接种密度条件下,不同浓度黄芪甲苷（20mg／L,40ms／L,80mg／L）对神经干细胞分化作用的影响,采用免疫细胞化学法鉴定神经干细胞及其分化后细胞。结果从新生大鼠海马区分离出的神经干细胞经鉴定呈nestin阳性,且加入黄芪甲苷组所表达的神经干细胞和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞较对照组明显增多（17．60±2．85vs15．65±2．29;24．10±3．13VS21．95±2．37;P〈0．05）。结论黄芪甲苷对体外培养大鼠海马区神经干细胞的分化有促进作用。     

牡荆苷对骨髓间充质干细胞成脂分化的影响简

目的 探讨牡荆苷对大鼠骨髓间充质干细胞成脂分化的影响.方法 采用细胞的增殖检测（MTT）法检测骨髓间充质干细胞生存率,油红O染色检测细胞成脂分化,实时荧光定量PCR检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）和CCAAT增强子结合蛋白α（C/EBPα） mRNA表达.结果 牡荆苷浓度在1～50 μmol/L范围内对骨髓间充质干细胞生存率无显著影响;牡荆苷可抑制骨髓间充质干细胞成脂分化及PPARγ和C/EBPαmRNA表达.结论 牡荆苷可抑制骨髓间充质干细胞成脂分化,其作用机制可能与抑制PPARγ和C/EBPα基因表达有关.     

成人骨髓间充质干细胞体外向视网膜细胞的诱导分化

目的研究取材于成人骨髓的间充质干细胞在一定诱导条件下向视网膜神经细胞的分化。方法成人骨髓经密度梯度离心得到的细胞,根据其高黏附特性体外培养获得间充质干细胞。利用流式细胞仪分析其细胞表型,在体外诱导使其向视网膜神经细胞分化并用免疫荧光法进行鉴定。结果从骨髓中分离培养的细胞具有成纤维细胞样形态,贴壁生长,表型相对均一,表面标志为CD90、CD44、CD147阳性;而CD34、CD38、CD45、CD14、HLA-DR阴性。体外诱导后可以得到表达nestin(神经干细胞标志物)、GFAP(神经胶质细胞标志物)和Rhodopsin(视网膜光感受器细胞标志物)阳性的细胞。结论从人骨髓中分离培养得到的间充质干细胞具有向视网膜神经细胞分化的潜能。     

促大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的研究

目的探讨成年大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的体外培养和向神经元样细胞分化的方法。方法通过梯度分离获得成年大鼠MSCs,在细胞因子和氧化剂作用下对其诱导分化为神经元样细胞,免疫细胞化学方法检测神经元特异性烯醇化酶（NSE）、神经丝蛋白（NF）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和神经巢蛋白（Nestin）的表达情况,流式细胞仪检测分析诱导率。结果BMSCs被转化神经元样细胞并表达Nestin。应用碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、叔丁基对羟基茴香醚（BHA）所获得的神经元样细胞诱导率高（49.7%）。结论bFGF、BHA能促进大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞。     

人骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的研究

目的：研究人骨髓间充质干细胞（hMSCs）在体外分离纯化、培养扩增和向心肌样细胞诱导分化的条件。方法：体外分离培养hMSCs,纯化传代至第三、四代,加入不同浓度5-氮杂胞苷（5-Aza）进行不同时间的孵育,用MTT测定细胞的生长活性,确定最佳的浓度和孵育时间。4周后行电镜,免疫组化染色及逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测。结果：诱导后细胞呈心肌样细胞改变,电镜下可见肌丝形成,免疫组化显示部分细胞胞浆α-横纹肌肌动蛋白（α-sarcomeric actin）、肌钙蛋白-T（troponin-T）阳性。RT-PCR检测显示心肌特异转录因子GATA-4、Nkx2.5有表达。结论：hMSCs是骨髓来源的具有多向分化潜能的干细胞,在5-Aza的诱导下可向心肌样细胞分化,可成为心肌损伤移植治疗的理想细胞材料。     

脐带血血清培养体系扩增脐带间充质干细胞及其生物学特征的实验研究

目的:通过观察以人脐带血血清为主体的培养体系对脐带间充质干细胞(Mesncllymal stem Ce]ls,MSCs)体外培养扩增的影响,探讨人脐带血血清替代动物血清用于培养临床组织工程用干细胞的可行性.建立从足月脐带分离间充质干细胞和体外传代培养技术,并对其生物学特性进行研究.方法:采用双酶法分离脐带间充质干细胞.并通过传代进行纯化和扩增培养.绘制生长曲线:用流式细胞仪检测脐带表面抗原及细胞周期.结果:成功建立了以人脐带血血清为主体的培养体系的脐带间充质干细胞培养扩增的方法:流式细胞仪检测结果显示,贴壁细胞均表CD44、CD29,低表达CD106,不表达追血细胞表型CD14、CD34、CD45和内皮细胞表型CD31,也不表达HLADR:细胞倍增时间为30h,细胞周期分析表明,G0-G1期和+C2+M期所占比例分别为78.84%和11.16%.结论:应用灭活脐带血清培养体系可成功扩增人脐带间充质干细胞.培养的细胞具有阃充质干细胞的基本特性.为建立间充质干细胞库和临床应用提供了理论依据.     

骨髓间质干细胞向心肌样细胞分化的研究

目的：诱导骨髓间质干细胞（BMSCs）向心肌样细胞分化，为 BMSCs 心肌再生移植治疗提供基础。方法取第5代的 BMSCs，5-氮杂胞苷诱导24 h，显微镜下进行形态学观察，3周后通过 RT - PCR 检测心肌蛋白 desmin 和αMHC 的表达。结果 BMSCs 经5-氮杂胞苷诱导后，细胞形态发生变化，出现肌管结构，RT - PC R 检测结蛋白（desmin ）和αMHC 的表达阳性。结论在体外成功诱导 BMSCs 分化成为心肌样细胞。     

脐血间充质干细胞向神经细胞诱导分化的研究进展

脐血间充质干细胞是从胎儿脐带血中分离出的一种成体干细胞,具有分化为神经细胞的潜能,可用于多种神经系统疾病的治疗。如何有效诱导脐血间充质干细胞向神经细胞分化一直是干细胞领域的研究热点,具有很高的研究价值,该文将对脐血间充质干细胞向神经细胞定向分化的诱导方法作一综述。     

人脐带间充质干细胞的生物学特性及向神经样细胞分化的研究

目的探究人脐带间充质干细胞具有的生物学特性,并对其向神经样细胞的分化进行研究。方法检测人脐带间充质干细胞细胞表面的标记;以β巯基乙醇与丹参诱导其向神经细胞分化,并为分化细胞与未分化细胞进行免疫细胞化学鉴定。此外,半定量RT-PCR检测细胞神经相关基因表达。结果分离自人脐带的贴壁细胞在体外可以生长成类似成纤维细胞的形态,在未分化状态下可以维持稳定增殖形态,且体外增殖远超10代,这类细胞表面标记CD105、CD59、CD44、CD29有较高的表达,而造血细胞的表面标记CD117、CD45、CD34、CD33、CD28、CD14则无表达或低表达,而与其相同表达的还有移植免疫排斥相关的表面标记,如CD86、CD80、CD40。经诱导分化的细胞表达神经元标记β-Ⅲ类神经微管和神经微丝、神经干细胞标记巢蛋白、神经胶质细胞标记的胶质纤维酸性蛋白。经过RT-PCR检测可知,经丹参诱导后的间充质干细胞表达神经干细胞的相关基因Neatin,而诱导前后间充质干细胞全部表达神经细胞基因Pleiotrophin并且在诱导后表达增强。结论人脐带间充质干细胞具有易于培养扩增的生物学特性,其表达间充质干细胞的表面标记,低或不表达造血细胞、与移植排斥有关的细胞标记。同时,其可以分化为神经样细胞并表达神经细胞的基因与相关标记,这种细胞可以作为肝细胞的一个来源,用于中枢神经系统细胞的移植。     

人脐血源性间充质干细胞的体外培养及生物学鉴定

目的 建立体外培养、扩增人脐带血间充质干细胞(MSCs)的方法．初步鉴定其生物学特性。方法 无菌条件下取正常足月剖宫产的脐带血,用淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞．以偏酸性的Mesencult^TM作为培养基进行培养和纯化获得贴壁细咆层,测定MSCs的生长曲线．用流式细胞技术分析细胞的表面抗原。结果 来源于脐血的单个核细胞存体外用合适的培养基培养,细胞贴壁后出现破骨样及间充质样的细胞。间充质细胞为成纤维样的细胞形态,并表达MSCs相关的抗原CD29、CD44、CD105。但不表达CD34、CD45、CD106和HLA-DR。这与源于骨髓的MSCs一致。结论 脐带血中含有的MSCs可在体外培养、扩增,能够为实验和临床的应用提供一种新的间充质干细胞来源。     

Morphostructural analysis of human follicular stem cells on highly porous bone hydroxyapatite scaffold

In this study we investigated the in vitro behaviour, morphostructure and extracellular matrix synthesis of human dental follicular stem cells (hDFSCs) isolated from human dental bud, which resulted to be positive for mesenchymal markers (CD29, CD90, CD146 and CD166) by FACS analysis. Cells were analysed by light and electronic microscopy to evaluate their biological response either at week 1, that is before differentiation, or at weeks 3-6, when they had been cultured in osteogenic medium onto a highly porous natural scaffold material (Bio-Oss). Microscopy analysis of primary culture cells showed they had a mesenchymal stem cell-like morphostructure, spindle shaped, similar to the culture of mesenchymal stem cells derived from adult bone marrow. Also, after osteogenic differentiation, these analyses indicate typical osteoblast morphostructure and reveale a tri-dimensional organization of the cells and deposition of extracellular matrix (ECM) in close contact with biomaterial. This approach would allow to personalize the scaffold for bone tissue engineering in order to accelerate the process of osteogenesis.     

不同培养基对人脐带间充质干细胞生物学特性的影响

目的观察不同培养基对人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）生物学特性的影响,优化培养方法。方法采用贴壁法从正常足月胎儿脐带中分离出间充质干细胞,细胞贴壁后利用DMEM/F12,Mesen PRORSTM Medium这两种培养体系进行体外扩增,绘制生长曲线,流式细胞仪检测其表面标志。结果从人脐带中分离出的间充质干细胞为梭形,呈平行排列生长或漩涡状生长;细胞表达CD29、CD44,不表达CD34、CD45和HLA-DR。结论加入Mesen PRORSTM Medium培养的细胞增殖速度快,更适合于脐带间充质干细胞的体外扩增。     

黄芪甲苷对脂肪源性干细胞体外生物学行为的影响

目的探讨黄芪甲苷(Astragaloside IV,Ast)对体外培养人脂肪源性间充质干细胞(human adipose-derived mesen-chymal stem cells,hADSCs)生物学行为的影响。方法应用CCK8和PCNA法检测不同浓度和时间Ast孵育对hADSCs增殖情况的影响,选取出Ast最适干预条件并对hADSCs进行培养,观察药物干预后细胞形态、表面标志物、成骨及成脂分化潜能。结果 CCK8和PCNA结果均显示,Ast 20 mg.L-1干预48 h后细胞增殖最为明显,进一步选取Ast20 mg.L-1干预hADSCs 48 h,与对照组相比,两组细胞CD29、CD44、CD105的阳性率均为96%-99%;两组细胞成骨诱导与成脂诱导结果也无差异。结论 Ast可促进ADSCs增殖,以20 mg.L-1、孵育48 h为最适干预条件,且该条件干预后并不影响hADSCs细胞形态,表面标志物水平及多向分化能力。     

骨髓间充质干细胞移植对大鼠脊髓损伤后再修复作用的研究

目的探讨间充质干细胞（MSCS）移植对大鼠脊髓损伤后脑源性神经营养因子（BDNF）表达的影响。方法选取SD大鼠4只作骨髓间充质细胞的分离与培养，提取MSCS；制做脊髓横断损伤模型，细胞移植组24只，PBS（磷酸盐缓冲液）液组24只，空白对照组12只。于脊髓损伤后第7天，无菌条件下，细胞移植组以微量注射器缓慢注入含MSCS的培养液5μl，磷酸盐缓冲液组5μl，对照组未加任何干预因素。分别于术后7d、14d、28d麻醉下行心脏灌流固定取T10节段脊髓，细胞移植组与磷酸盐缓冲组取出损伤节段的脊髓，空白对照组于同一节段取出相应脊髓。应用免疫组化法观察MSCS移植后大鼠脊髓损伤区BDNF的表达变化。结果脑源性神经营养因子在正常大鼠脊髓组织中有一定表达，间充质干细胞移植术后7d、14d及28d，细胞移植组脑源性神经营养因子均高水平表达，与缓冲液组相比较差别明显，具有统计学意义。结论间充质干细胞在移植后通过上调脑源性神经营养因子的表达从而促进轴突的再生，可能是治疗脊髓损伤的重要机制。     

人脐血间充质干/祖细胞诱导为神经样细胞的实验研究

目的探讨人脐血间充质干细胞用于神经细胞再生的可行性与人脐血间充质干/祖细胞最佳的诱导培养条件。寻找一种合适的细胞来源进行移植以代替受损的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞来修复神经损伤。方法将脐血单个核细胞置于低血清(2%)达氏修正依氏培养基中培养,生成贴壁细胞层,依传代方法,用相同培养条件进行扩增,扩增后的贴壁细胞置入细胞培养液(加入新生大鼠神经细胞分离培养上清液)中,并添加表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)进行诱导分化。采用流式细胞术、免疫组织化学法分别检测被诱导的神经样细胞的表面标志及细胞特异性标志、结构,并进行分析。结果脐血间充质干/祖细胞克隆在脐血单个核细胞中出现频率为0.5×10-6,在传20代时,可有效扩增1.5×106倍,诱导后,70%的脐血间充质干/祖细胞分化为神经样细胞。结论采用上述扩增与诱导条件,脐血间充质干/祖细胞可得到有效扩增,并可高效向神经样细胞分化,从而证实脐血是一种细胞替代治疗前景光明的细胞来源。     

转HOXB4基因人骨髓MSC促进脐血CD34~+细胞体外扩增

目的 研究转HOXB4基因的人骨髓间充质干细胞(MSC)对脐血CD34~+细胞体外扩增的支持作用.方法 用病毒载体质粒转染包装细胞293T,收获病毒上清(VCM)感染MSC后,用潮霉素筛选获得转HOXB4的MSC(MSC-HOX).分别将MSC(对照组)与MSC-HOX细胞(实验组)作为CD34~+细胞体外扩增的饲养层细胞,结合细胞因子Fh3/Flk3配体(FL)、促血小板生成素(TPO)、干细胞因子(SCF)和粒细胞-集落生长因子(G-CSF)体外扩增脐血CD34~+细胞10 d,收集所有脐血细胞,检测细胞总数、CD34~+细胞总数,集落细胞形成单位(CFU)数.结果 生产重组逆转录病毒可有效将HOXB4基因转入靶细胞内并表达.脐血CD34~+细胞经体外扩增10 d后,细胞总数和CFU数两组间差异无统计学意义(P>0.05),脐血CD34~+细胞总数和比例高于对照组(P<0.05).结论 转HOXB4基因的人骨髓MSC在脐血CD34~+细胞体外扩增中,可保持CD34~+细胞未分化状态,有潜在的应用价值.     

人脐血CD34^ 内皮祖细胞的体外分化

目的：研究人脐血CD34^ 细胞群体中内皮祖细胞在体外分化为内皮细胞的过程中,干细胞标志以及内皮细胞表型随时间的变化。方法：将免疫磁珠细胞分选法（MACS）得到的CD34^ 细胞体外培养于纤连蛋白和无纤连蛋白处理的培养皿中,以免疫细胞化学鉴定贴壁细胞的内皮标志Flk-1和vWF,并以流式细胞仪分析其干细胞标志AC133。结果：贴壁细胞的内皮标志Flk-1和vWF是逐步出现的,d3时有27.0%贴壁细胞表达Flk-1,vWF不表达,d7时已100%表达vWF和Flk-1,纤连蛋白促进贴壁细胞内皮标志Flk-1和vWF的表达,d3时的表达百分率分别为34.0%和47.0%,d7时Flk-1和vWF的表达均为100%,在培养过程中,AC133阳性细胞的比例迅速下降,但纤连蛋白对AC133的表达无显著影响。结论：在内皮祖细胞分化的过程中,干细胞标志迅速消失,向内皮细胞分化,内皮细胞的表型是逐步出现的,纤连蛋白促进内皮祖细胞的分化。     

脐血干细胞治疗1型糖尿病3例

研究证实,干细胞具有趋向分化作用,可分化为胰岛B细胞,在治疗T1DM中是一种安全、有效的治疗手段。目的脐血间充质干细胞治疗T1DM,观察其疗效和安全性。方法3例T1DM患者,年龄分别16岁、20岁、28岁。体质量指数分别是22．3、21．5、21．6。在患者及家属知情同意的情况下于我院介入室行为介入术,脐血间充质干细胞静脉注入胰背动脉。术后随访其临床症状及各项指标的变化,进行综合分析。结果3例患者胰岛素需要量较前下降30％～50％,胰岛功能较前明显改善,糖化血红蛋白从9．85％～13．26％下降到6．7％～7．8％,糖尿病酮症随访期间未发生。结论脐血间充质干细胞作为干细胞的一种是治疗T1DM的新途径,在临床应用中显示出其特有的效应。