幽门螺杆菌上皮接触诱导基因iceA1的克隆及序列特征

目的:克隆和分析镇江地区来源于不同疾病的(胃癌、溃疡和胃炎)幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)的表皮接触诱导基因iceA1.方法:从胃十二指肠疾病患者胃黏膜组织中分离培养获得H.pylori,PCR扩增检测iceA1基因,并克隆至pMD18-T载体上,进行测序和序列分析.结果:克隆和测序了镇江地区来源于不同疾病的(胃癌、溃疡和胃炎)共12株H.pylori的i c e A1基因片段,并与标准菌株60190比对,结果显示镇江地区的H.pylori的iceA1基因中存在着3处框内缺失突变热点(780del6、809del5、914del7),这些缺失突变在溃疡和胃炎中均存在,但是胃癌株只存在809del5.对缺失片段周围的序列进行分析,这些缺失序列的两端基本都与同向重复序列相连,这可能与复制过程中滑动错配的小片段缺失模型有关.结论:iceA1序列的变异性有可能作为分析H.pylori群体遗传学的有用工具.     

幽门螺杆菌vacA基因毒性相关片段的克隆及序列分析

目的 vacA基因编码的蛋白是幽门螺杆菌的一个重要毒力因子,通过空泡化作用损伤上皮细胞.vacA基因与Hp感染者的临床发病有着密切的关系,vacA的基因型决定毒素蛋白体外表达水平的高低.我们从幽门螺杆菌88022菌株中扩增出vacA基因毒性相关片段,进行序列测定和序列比较分析,为Hp的临床检测奠定基础.方法以该菌株总DNA为模板,紧随vacA基因序列s区保守区域的引物(位于316bp～335bp和1198bp～1218bp)扩增vacA基因的一个903bp片段,编码的氨基酸为34～334位,用BamHⅠ和Pst Ⅰ双酶切后克隆入pGEM-3Zf(-)质粒载体,以双脱氧法双向测定目的片段的序列,拼接出该片段的全序列,并与已知的Hp vacA基因序列作比较.结果所得序列与Hp国际标准株CCUG17874(GeneBank gi619248)和NCTC11638(GeneBank gi 495469)的vacA基因序列完全一致,氨基酸序列分析和所报道的结果一致.结论构建了Hp vacA基因毒性相关片段的重组克隆,为以后的进一步研究奠定了基础.     

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位编码基因的克隆与序列分析

目的 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亚单位的编码基因(ureB)的克隆和序列分析，为H．pylori基因工程疫苗的研究奠定基础。方法应用PCR方法获得国内分离H．pylori菌株MEI，HP27和国际标准参考株H．pylori的ureB基因，通过定向克隆的方法分别插入克隆载体pNEB193中，用质粒酶切电泳和特异PCR方法鉴定重组质粒。克隆基因经测序后进行核苷酸和氨基酸的同源性比较。结果 重组质粒经双酶切后得到1．71kb的ureB基因片段，特异PCR可扩增出ureB基因片段，证实H．pylori ureB基因的重组克隆质粒构建成功。经测序，国内分离H．pylori MEL-HP27的ureB基因全长1710bp( Genbank收录号：AY295085)，编码由569个氨基酸残基组成的肽链，ureB基因序列与GenBank公布的H．pylori相应基因同源性高达96．08％～98．30％，氨基酸序列同源性在98．77％．99．82％之间。结论 成功克隆了MEL-HP27菌株的ureB基因，其核苷酸序列与国际参考株NCTC11637的同源性为97．67％。     

幽门螺杆菌尿素通道蛋白基因Urel的真核载体构建、表达及抗原性研究

目的构建含人幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H．pylori）尿素通道蛋白编码基因（UreI）的真核表达的重组载体,并在COS-7细胞中表达,为核酸疫苗的开发奠定基础。方法以原核表达质粒pET32a（＋）／UreI为模板,扩增UreI编码基因片段,将目的基因与同样进行酶切、纯化的载体pEGFPN1进行连接,而后转化并筛选含有目的基因的重组载体pEG—FP—N1／UreI,并在COS-7细胞中表达,以荧光蛋白和Westernblot法检测其表达产物。结果经酶切、测序证实插入的基因片段为H．pyloriUreI蛋白编码基因;荧光显微镜下和Westernblot法等检测显示,该重组质粒能够在COS-7细胞中表达目的蛋白,同时能够被H．pylori阳性患者血清所识别。结论成功地构建了真核重组载体pEGFP—N1／UreI,并在COS-7细胞中表达。     

幽门螺杆菌尿素通道蛋白基因UreI的真核载体构建、表达及抗原性研究

目的构建含人幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)尿素通道蛋白编码基因(UreI)的真核表达的重组载体,并在COS-7细胞中表达,为核酸疫苗的开发奠定基础。方法以原核表达质粒pET32a(+)/UreI为模板,扩增UreI编码基因片段,将目的基因与同样进行酶切、纯化的载体pEGFP-N1进行连接,而后转化并筛选含有目的基因的重组载体pEG-FP-N1/UreI,并在COS-7细胞中表达,以荧光蛋白和Western blot法检测其表达产物。结果经酶切、测序证实插入的基因片段为H.pyloriUreI蛋白编码基因;荧光显微镜下和Western blot法等检测显示,该重组质粒能够在COS-7细胞中表达目的蛋白,同时能够被H.pylori阳性患者血清所识别。结论成功地构建了真核重组载体pEGFP-N1/UreI,并在COS-7细胞中表达。     

幽门螺杆菌尿素酶B基因的克隆、表达及免疫原性研究

目的应用基因工程方法构建表达幽门螺杆菌尿素酶Ｂ亚单位（ＵｒｅＢ）的菌株．方法用ＰＣＲ方法从幽门螺杆菌染色体ＤＮＡ上扩增出ＵｒｅＢ基因片段,将其克隆至ｐＳＫ（＋）质粒上,然后插入原核表达载体ｐＥＴ２２ｂ（＋）中,在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中表达．结果经测序ＵｒｅＢ片段有１７０７ｂｐ组成,为编码５６９个氨基酸残基的多肽．ＳＤＳＰＡＧＥ和免疫印迹分析检测发现,ＵｒｅＢ基因表达的蛋白质分子质量为６５０００Ｕ,并证实该重组蛋白质可以被幽门螺杆菌感染阳性患者的血清所识别,同时将其免疫小鼠可刺激机体产生抗该重组蛋白质的抗体．结论重组的ＵｒｅＢ可以作为一种有效的蛋白质疫苗用于幽门螺杆菌感染的预防和治疗．     

幽门螺杆菌尿素酶B基因的克隆与重组基因的表达

目的：获得大量纯化的尿素酶Ｂ蛋白,为下一步的幽门螺杆菌疫苗研制作准备。方法：采用ＰＣＲ方法克隆尿素酶Ｂ基因,利用基因工程技术进行基因重组,构建表达工程菌。结果：通过对载体、培养条件的优化选择,实现了尿素酶Ｂ编码基因在大肠杆菌中的高效表达。结论：克隆到的尿素酶Ｂ编码基因和表达的蛋白,其氨基酸序列与文献报道一致。     

幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位编码基因的克隆与序列分析

目的 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)热休克蛋白A亚单位的编码基因(hspA)克隆和序列分析，为H.pyiori基因工程疫苗的研究奠定基础。方法 应用PCR方法获得国内分离H.pylori菌株MEI，HP27和国际标准参考株H.pylori的hspA基因，通过定向克隆的方法分别插入克隆载体pNEB193中，用质粒酶切电泳和特异PCR方法鉴定重组质粒。克隆基因经测序后进行核苷酸和氨基酸的同源性比较。结果 重组质粒经双酶切后得到0．35kb的hspA基因片段，特异PCR可扩增出hspA基因片段，证实H.pylori hspA基因的重组克隆质粒构建成功。经测序，国内分离HpMEL-HP27的hspA基因全长357bp(Genbank收录号：AY295084)，编码由118个氨基酸残基组成的肽链，hspA基因序列与GenBank公布的H.pylorl相应基因同源性高达95．20％～97．48％，氨基酸序列同源性在95．76％～97．46％之间。结论 克隆了H．pylori菌株MEL-HP27的hspA基因，其核酸序列与国际参考株NCTC11637同源性为97．48％。     

幽门螺杆菌NCTC 11637 cagT基因的克隆及序列分析

目的:克隆幽门螺杆菌(H pylori)NCTC 11637 cag T(HP0532)的编码基因,并分析其核苷酸序列.方法:应用PCR技术从H pylori基因组DNA中扩增cag T编码基因片段,克隆至pGEM-T载体后,再将其定向插入pQE30载体中,双酶切鉴定筛选阳性克隆,并进行序列分析.结果:NCTC 11637 cag T基因全长843 bp(GenBank登录号为EF114758),编码280个氨基酸,与GenBank公布的其他H pylori菌株基因序列的核苷酸同源性为97%-99%.结论:成功克隆了cag T基因,为进一步研究其生物学功能奠定了基础.     

幽门螺杆菌OipA、HopX、HopW基因的检测及序列分析

目的:检测幽门螺杆菌(H pylori)标准菌株NCTC11637及临床菌株外膜蛋白的三种基因(OipA、HopX、HopW及比较NCTC11637中三种基因与国际标准菌株(26695和J99)的同源性,为Hpylori疫苗的筛选提供实验依据.方法:运用PCR方法检测标准菌株NCTC 11637及27例临床菌株中的三种基因,并对其进行测序.运用GenBank比较与国际标准菌株(26695和J99)的同源性.结果:在标准菌株NCTC11637中检测到三种基因.在27例临床菌株中,有10例检测到OipA基因.在23例中检测到HopX基因,在27例中均检测到HopW基因.NCTC11637中OipA基因与26695和J99的核苷酸序列同源性分别为95.38%、94.60%,均低于两株国际标准菌株的同源性95.50%.HopX基因的同源性分别为94.90%和95.15%,同样低于两株国际标准菌株的同源性96.49%.HopW基因与26695和J99的同源性分别为97.38%、94.90%,两株标准菌株的同源性为95.20%.结论:在标准菌株NCTC11637和临床菌株中检测到三种基因.H pylori HopW基因核苷酸序列具有一定的保守性.     

幽门螺杆菌ureI核酸疫苗免疫活性的初步研究

目的 观察幽门螺杆菌ureI核酸疫苗诱导C57BL/6小鼠产生体液免疫应答及细胞免疫应答水平.方法 重组质粒pcDNA3.1(+)/ureI、空质粒pcDNA3.1(+)及PBS分别肌注免疫C57BL/6小鼠.ELISA法检测小鼠血清中特异性IgG抗体水平以及脾淋巴细胞培养上清中IL-4和IFN-γ含量,MTT比色法检测脾淋巴细胞增殖反应,PCR和免疫荧光组化法检测ureI基因和蛋白表达.结果 pcDNA3.1(+)/ureI能够诱导小鼠产生特异性IgG抗体,该组小鼠脾淋巴细胞经UreI重组蛋白刺激后,其刺激指数和培养上清中IL-4、IFN-γ含量明显升高; ureI基因可在小鼠肌细胞中有效表达.结论 pcDNA3.1(+)/ureI核酸疫苗能刺激C57BL/6小鼠产生较强的体液免疫应答和细胞免疫应答,为进一步研究该疫苗的免疫保护作用奠定了基础.     

Cloning and sequence analysis of gene oipA encoding an outer membrane protein of human Helicobacter pylori

AIM: To construct a recombinant E. coli strain that would highly express the proinflammatory outer membrane protein of human Helicobacter pylori (H pylori). METHODS: The oipA DNA was amplified by PCR, inserted into pET-32a, and transformed into Top10 E. coli strain. This recombinant plasmid of Top10 was sent out for nucleotide sequence analysis. Finally this sequence AF479754 was compared with HP0638 and JHP0581. RESULTS: The sequence of the aim gene was obtained. It had 924 base pairs. The identity was 95.32% against HP0638, 95.02% against JHP0581, which was higher than the identity between HP0638 and JHP0581. CONCLUSION: Although the aim gene was obtained, but it was different from the published sequence of GenBank. It is not clear what makes this difference. Maybe it is because different strain was used or because there were some variations. So more researches are required to prove it.     

幽门螺杆菌耐药基因检测的研究现状

抗生素的广泛应用使幽门螺杆菌(H pylor1)对抗生素的耐药性和耐药率逐渐增加,目前对幽门螺杆菌耐药的检测方法重点在对克拉霉素和甲硝唑两种抗生素耐药的检测.其检测方法主要是基于聚合酶链式反应为基础的分子生物学技术,其对克拉霉素发展前景广阔的是聚合酶链式反应.限制性片段长度多态性分析技术和实时定量聚合酶链式反应结合解链曲线分析技术,可对活检组织和粪便两种样本进行检测,同时可以对多种抗生素进行耐药检测:其对甲硝唑耐药的检测主要是免疫印迹法和聚合酶链式反应.限制性片段长度多态性分析技术,有望发展成检测H pylori耐药的常规项目.     

幽门螺杆菌抗体检测分析

目的 对昆明地区感染幽门螺杆菌(H.pylori)人群检测血清CasA、VacA、Ure、Hsp60、RdxA五种IgG抗体,了解其与消化性溃疡、慢性胃炎的关系.方法 抽静脉血3 mL离心取血清,用H.pylori抗体芯片检测CagA、VacA、Ure、Hsp60、RdxA五种IgG抗体.结果 ①CagA抗体总阳性率为79.7%,十二指肠球部溃疡(DU)、慢性胃炎(CG)、胃溃疡(GU)的CagA抗体阳性率分别为88.0%、60.9%、83.3%,DU的CagA抗体检出率明显高于CG(P=0.008),而DU与GU(P=0.744)、CG与GU(P=0.633)之间的差异无统计学意义;②VacA抗体总阳性率为20.3%,DU、CG、GU的VacA抗体阳性率分别为14.0%、30.4%、33.3%.三者之间的差异无统计学意义(P=0.12);③Ure抗体总阳性率为97.5%,DU、CG、GU的Ure抗体阳性率分别为98%、95.7%、100%,三者之间的差异无统计学意义(P=0.534);④Hsp60抗体总阳性率为6.25%,DU、CG、GU的Hsp60抗体阳性率分别为4.0%、13.0%、0%,三者之间的差异无统计学意义(P=0.317);⑤RdxA抗体总阳性率为17.5%,DU、CG、GU的RdxA阳性率分别为14.0%、30.4%、0%,三者之间的差异无统计学意义(P=0.179).结论 昆明地区H.pylori感染人群CagA抗体阳性率为79.7%,与DU的关系更加密切;CasA、VacA抗体不能单独作为H.pylori感染阳性的标志物;Hsp60抗体水平对于H.priori感染的检测价值不大;RdxA抗体水平不能标志甲硝唑耐药的水平;而Ure抗体阳性率高达97.5%,可作为H.priori感染阳性的标志物,我们认为检测H.pylori血清抗体用于H.pylori感染的流行病学调查,应该以Ure抗体为主,辅以CagA抗体和VacA抗体.