小剂量~(60)Co_γ射线与雌性激素联合诱发SHE细胞恶性转化的实验研究

本实验应用金黄地鼠胚胎(SHE)细胞,研究了小剂量(60)~ Coγ射线与雌性激素(EP)联合诱发细胞恶性转化的作用。观察转化细胞的形态学及生物学特性,并在实验的基础上对小剂量电离辐射与雌性激素联合致癌的机制作初步探讨。 实验采用SHE原代培养细胞,接种于30ml培养瓶中,加入含10～15％新生牛血清的1640培养液,充10％CO_2空气,置37℃温箱培养。     

硅灰石对金仓鼠胚胎细胞转化作用的研究

硅灰石是一种新开发的天然矿物纤维,我国自八十年代开采以来,应用日益扩大。动物实验表明硅灰石具有致癌性,体外研究证明可引起中国仓鼠肺细胞(CHL)的染色体畸变和姐妹染色体交换。1987年,IARC(国际癌症研究所)将硅灰石列为潜在致癌物。迄今为止,对国产硅灰石的研究尚未见有报道,国外对硅灰石致癌性的研究也仅限于动物实验。本文采用金仓鼠胚胎细胞(SHE)体外转化方法研究国产硅灰石的致癌性并探讨其可能的作用机制。实验结果表明:     

兔抗hCG CP22抗血清体外抑制肿瘤细胞生长的研究

目的:探讨抗原抗体反应检验若干人肿瘤细胞分泌β-hCG情况,和抗hCGCP22抗血清体外抑制肿瘤的作用。方法:采用细胞免疫荧光染色测定5个肿瘤细胞株是否表达β-hCG,用CCK-8试剂盒检测CP22抗血清(AS CP22)和β-hCG羧基端37肽(CTP)抗血清(AS CTP)体外抑制肿瘤细胞生长的光密度。结果:以AS CP22为探针和AS CTP为阳性对照,体外培养的人胰腺癌BXPC-3、人卵巢癌HO-8910和人结肠癌Lovo细胞膜上都能观察到绿色荧光,提示肿瘤细胞均表达β-hCG亚单位,而人前列腺癌PC-3和Du-145细胞则未检测到绿色荧光;与正常兔血清(NS)比较,AS CP22和AS CTP均可显著的体外抑制BXPC-3和HO-8910细胞生长,P<0.001。AS CP22抑制BXPC-3和HO-8910肿瘤细胞的作用都强于AS CTP,P<0.05。结论:人胰腺癌BXPC-3、人卵巢癌HO-8910和人结肠癌Lovo细胞在体外培养的情况下均表达β-hCG亚单位,且它们的体外生长都能被兔抗hCG嵌合肽(CP22)抗血清体外抑制。     

端粒酶反义寡核苷酸对体外培养ACC-M细胞的影响

目的　研究端粒酶反义寡核苷酸 (AS ODN)对体外培养人涎腺高肺转移性腺样囊性癌 (ACC M)细胞的影响。方法　采用细胞形态学观察及PCR TRAP端粒酶活性检测法来观察其形态学和端粒酶活性的变化。结果　反义寡核苷酸在转染ACC M细胞后 72小时内 ,其形态学改变不明显 ,其端粒酶活性明显受到抑制 (P <0 .0 1)。结论　AS ODN可显著抑制ACC M的端粒酶活性 ,提示AS ODN可抑制ACC M细胞的生长 ,抑制效果可能与AS ODN的剂量、转染效率等因素有关。     

硅灰石和石棉诱发CHL细胞姊妹染色单体交换和染色体畸变

硅灰石和石棉纤维均属天然矿物纤维,由于矿物纤维的商业用途极为广泛,接触矿物纤维的职业和非职业人群不断扩大,因此,有关矿物纤维致突变和致癌性的问题近年愈发引起各国学者的关注。动物实验表明硅灰石具有致癌性,体外可引起金仓鼠胚胎细胞(SHE)转化。1987年,IARC(国际癌症研究所)将石棉列为肯定致癌物,硅灰石列为潜在致癌物。迄今对国产石棉致突变和致癌性的研究尚不充分,而对国产硅灰石则尚未见报道。本文研究了国产硅灰石和石棉诱发中国仓鼠肺细胞SCE和CA的作用并探讨其可能的作用机制。     

p53反义RNA对人肺癌细胞表型和顺铂敏感性的影响

目的 研究外源p53反义RNA对有p53基因248密码点突变的人肺癌细胞系恶性表型和顺铂敏感性的影响。方法 构建p53反义RNA真核细胞表达载体PEGFP－p53（AS),经酶切图证明反向联结质粒。Lipofectin介导转染有p53基因248密码点突变的人肺癌细胞系801D，经G418筛选获耐受克隆。稀释法建立单细胞克隆系，应用PCR检测外源基因，荧光显微镜检测细胞绿色荧光蛋白表达，p53单抗免疫组化染色检测p53突变蛋白表达，体外集落形成实验检测细胞生长，流式细胞仪检测细胞周期，MTT法检测细胞对顺铂药物敏感性。结果 酶切图证明了p53-cDNA反向联结于质粒，构建了PEGFP－p53(AS),并建立了转染单细胞克隆系PEGFP－p53(AS)-801D及空载细胞系PEGFP－801D。PCR检测外源p53基因和neo基因存在于转染细胞系，而荧光显微镜下发现其胞浆有绿荧光蛋白表达。免疫组化染色p53突变蛋白在801D细胞系为阳性，而PEGFP－p53(AS)-801D为阴性，证明外源反义p53在转染细胞稳定表达并封闭内源突变蛋白表达。与母系相比，PEGFP－p53(AS)-801D集落形成抑制率为61％（P＜0．01），流式细胞检测该细胞系G1期细胞数明显增中，出现G1期阻滞的表现。MTT检测PEGFP－p53(AS）－801D对顺铂比母系更为敏感。结论 有p53基因248密码点突变的801D细胞恶性增殖明显，对顺铂耐药，外源p53反义RNA可封闭突变蛋白表达，抑制细胞体外恶性增殖，增加对顺铂的药物敏感性。转染p53反义RNA可抑制p53突变的恶性表型或恢复野生型p53基因功能。     

过表达CKLF1基因对强直性脊柱炎滑膜成纤维细胞增殖及成骨转化影响的实验研究

目的探索趋化素样因子1 (chemokine-like factor1,CKLF1)对强直性脊柱炎(ankylosingspondyliti,AS)髋关节滑膜成纤维细胞增殖和成骨转化的影响。方法对照组和AS髋关节滑膜组织分别取自我科4例股骨颈骨折和3例重度AS拟行髋关节置换患者。滑膜组织经常规消化后获得单个细胞,并在倒置相差显微镜下进行观察和抗vimentin免疫荧光染色(immunofluorescence,IFC)检测。对上述髋关节滑膜组织及成纤维细胞分别行原位和体外培养,重组腺相关病毒(rAAV)-lacZ、rAAV-hCKLF1转染后21天收集标本。分别采用ELISA、IFC和荧光定量RT-PCR检测细胞增殖、致炎性细胞因子分泌、成骨分化的关键靶基因CKLF1及CCR4的表达。结果第3代正常和AS细胞抗vimentin IFC检测均为阳性,表明分离培养的细胞为成纤维细胞。rAAV-hCKLF1转染后21天,HE染色并计数单位面积下的细胞数、水溶性四氮唑法(WST-1)检测细胞增殖能力和Hoechst 33258检测细胞DNA含量均显示,CKLF1转染促进细胞增殖,且与无病毒转染组、lacZ组相比,差异有统计学意义(P=0.0000,P=0.0260,P=0.0020);正常和AS髋关节滑膜组织及成纤维细胞分泌的致炎性细胞因子(IL-6和TNF-α),均明显升高,且与无病毒转染组、lacZ组相比,差异有统计学意义(P=0.0060、P=0.0020);CKLF1尚能促进AS成纤维细胞表达特异性骨细胞外基质蛋白(OCN和OPN)表达;荧光定量RT-PCR与上述检测结果一致。结论过表达CKLF1促进AS髋关节滑膜成纤维细胞增殖和致炎性细胞因子分泌,增强成骨转化相关靶基因的转录,CKLF1可能在AS关节病理性骨化过程中发挥重要作用。     

AS2O3对多发性骨髓瘤细胞凋亡及其对自分泌VEGF的影响

目的研究三氧化二砷(AS2O3)对多发性骨髓瘤(MM)细胞株KM3凋亡及其对自分泌VEGF的影响。方法不同浓度AS2O3分别作用于KM3细胞24、48及72小时，用锥虫蓝拒染法检测细胞生长抑制率，经形态学(光镜，透射电镜)和DNA电泳观察KM3细胞凋亡；用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测培养液上清血管内皮生长因子(VEGF)的含量。结果AS2O3可抑制KM3细胞的生长，诱导KM3细胞凋亡；AS2O3对KM3细胞白分泌VEGF的抑制作用具有代偿机制，且与时间浓度有关。24小时时，随着AS2O3浓度的增加，VEGF分泌逐渐增强；48和72小时时，随着AS2O3浓度的增加，VEGF分泌则先上升后下降。结论AS2O3可诱导MM细胞凋亡，同时可抑制MM细胞自分泌VEGF。     

联合survivin反义寡核苷酸和基因重组融合蛋白对人膀胱癌细胞的抑制作用

 目的 用体外实验探讨联合应用survivin反义寡核苷酸、基因重组融合蛋白TP40是否对膀胱移行细胞癌T24细胞具有协同抑制作用。方法 实验分为对照组、错义寡核苷酸组（MS）、反义寡核苷酸组（AS）、TP40组和联合组（AS+TP40）。RT PCR和Western blot法检测各组细胞survivin的表达；MTT法检测各组细胞生长情况；流式细胞仪检测各组细胞凋亡率；体外成瘤实验检测各组细胞的体外锚定非依赖性生长能力。处理时间为3天。 结果 所合成AS(300nM)对survivin mRNA的表达具有明显抑制作用。分别从转录水平和表达水平证明了联合组下调survivin的能力最强。MTT法显示联合组用药后生长抑制更加明显（P＜0.0001）,第3天细胞存活率仅12.2%，凋亡率达到96.37％。在软琼脂糖体外成瘤实验中，TP40组和AS组的体外锚定非依赖性生长的能力大大降低，联合组（TP40+AS）细胞几乎没有形成克隆。结论 采用survivin反义寡核苷酸封闭survivin的表达，可以增强TP40对膀胱移行细胞癌T24细胞的生长抑制作用，呈现协同效应。     

核苷酸切除修复基因XPA反义RNA增强肺癌细胞对顺铂的敏感性

背景与目的：目前认为,肿瘤细胞自身核苷酸切除修复(nucleotide excision repair,NER)能力增强是肿瘤细胞产生耐药性最重要的机制之一。着色性干皮病A(xeroderma pigmentosun groupA,XPA)基因在核苷酸切除修复早期发挥核心作用。本研究拟探讨XPA基因表达与肺癌细胞株对顺铂敏感性的关系。方法：将XPA的反义RNA稳定转染人肺癌细胞株A549．用有限稀释法筛选阳性细胞克隆。分别用Northern blot和Western blot法检测阳性细胞克隆XPA mRNA和蛋白水平;MTT法检测肿瘤细胞对顺铂敏感性;宿主细胞再活化反应(host cell reactivation,HCR)检测肿瘤细胞DNA损伤修复能力。结果：筛选得到6个阳性克隆AS1～AS6,其中AS3～AS6细胞克隆的XPAmRNA和蛋白水平均明显降低。剂量依赖实验表明,顺铂对A549细胞与AS1～AS6细胞克隆的半数抑制浓度(IC50)分别为8．1、7．6、4．7、3．2、1．9、2．8、4．1~g／ml。统计学分析表明．与A549细胞相比,AS3～AS6细胞对顺铂的敏感性明显增强(F=9．75、9．14、7．39、8．91,P=0．005、0．006、0．012、0．006),而且XPA mRNA表达水平与细胞IC50值呈显著相关(r=0．927,P=0．003)。处理24、48、72h后,AS3～AS6细胞对顺铂的敏感性同样显著增强。HCR实验结果表明,AS3～AS6细胞的NER能力显著减弱,而且XPA mRNA表达水平与细胞NER能力呈显著相关(r=0．854、0．696、0．858;p=0．014、0．082、0．013)。结论：XPA反义RNA转染可明显降低肺癌细胞XPAmRNA水平,减弱细胞NER能力,继而使肺癌细胞对顺铂的敏感性增强。     

p53基因和血管生成抑制素基因共转染对胃癌SGC7901细胞凋亡的影响

目的:探讨血管生成抑制素(angiostatin,AS)基因和p53基因共转染人胃癌细胞株SG7901后对其凋亡的影响. 方法:分别将p53、AS基因以及p53联合AS基因转染SG7901细胞;采用RT-PCR法检测转染后SG7901细胞中目的基因的表达;通过细胞集落形成实验和MTT法观察不同转染对细胞的生长抑制作用;FCM法检测p53基因和AS基因对SGC7901凋亡的影响.结果:经p53或AS基因转染后,SG7901细胞的集落数量及大小均有不同程度的降低;且p53和AS基因具有协同作用,以共转染组降低最为明显,差异有统计学意义(P<0.05).MTT法检测结果表明,共转染组细胞的生长情况较其他2组单基因转染的细胞更为缓慢(P<0.05).共转染组凋亡率较AS基因单转染组、p53基因单转染组以及空载体转染组均高,差异有统计学意义(P<0.05).结论:p53和AS基因均能诱导胃癌细胞SG7901的凋亡,且两者具有协同作用.     

抗PML-RARα融合基因的反义核酸对APL病人白血病细胞作用的体外研究

为探讨AS治疗APL(急性早幼粒细胞白血病)的可能性,本文用AS对病人新鲜白血病细胞进行了体外研究.设计合成的4种寡核苷酸(Olig)为ATAS,FIAS,Sen,Ran.STAS,FUAS(分别与PML-RARα起始部位和融合部位互补)为反义核酸,Sen(与PML-RARα融合部位cDNA一致),Ran(随机序列)为对照组.以60μg/ml培养液的终浓度处理细胞,于不同时间收集细胞,进行动态观察.     

全反式维甲酸抑制反义N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V转染的SMMC7721肝癌细胞蛋白激酶B的表达

目的 探讨全反式维甲酸（ATRA）诱导反义N－乙酰氨基葡萄糖转移酶V转染的SMMC 7721肝癌细胞（简称AS－GnT-V/7721)凋亡机制。方法 用Hoechst染色检测ATRA诱导细胞凋亡情况，并应用Northern Blot和Western Blot检测ATRA诱导AS－GnT-V/7721细胞凋亡过程中bcl-2及蛋白激酶B(PKB)的表达。结果 Hoechst 33258染色结果显示ATRA处理AS－GnT-V/7721细胞24h后，细胞发生凋亡。Western Blot检测发现，ATRA处理AS－GnT-V/7721细胞不改变bcl-2的表达，但抑制PKB蛋白表达。ATRA处理AS－GnT-V/7721细胞24h后PKB蛋白即明显降低（约为原来的32%)，处理48h后PKB蛋白几乎检测不到。Northern blot检测发现，ATRA处理AS－GnT/V7721细胞12h,PKB mRNA即有所下降，24h时PKB mRNA约为原来的48％,处理48h,PKB mRNA减少至原来的15％。而ATRA处理对照细胞，bcl-2及PKB表达均不变。结论 ATRA诱导AS－GnT-V/7721细胞凋亡过程中PKB的表达下降，而bcl-2表达不变。提示，ATRA诱导AS－GnT-V/7721细胞凋亡可能是由于抑制PKB表达，而与bcl-2无关。     

乙酰肝素酶的外源性表达对大肠癌HT29细胞侵袭性的影响

背景与目的:乙酰肝素酶(heparanase,Hpa)基因表达与恶性肿瘤及肿瘤细胞的侵袭、转移和血管生成能力密切相关。本研究旨在通过增强肿瘤细胞中外源性Hpa基因的表达,探讨该基因对大肠癌细胞HT29转移侵袭能力的影响。方法:Hpa全长基因真核表达载体转染HT29细胞,MTT法检测转化细胞增殖能力,Boyden小室体外侵袭实验比较转染前后细胞侵袭能力的变化,通过转化细胞裸鼠异种接种成瘤和实体瘤回盲部原位种植转移模型建立,观察Hpa基因外源性表达对HT29细胞侵袭性的影响。结果:转染Hpa基因细胞HT29-Hpa较未转染细胞HT29和转染空载细胞HT29-KZ生长速度明显加快;Boyden小室体外侵袭实验显示,HT29-Hpa细胞穿膜数(45.5±0.5)较HT29细胞(29.3±0.1)和HT29-KZ细胞(30.1±0.2)增多,差异具有显著性(P<0.01)。转染细胞裸鼠皮下瘤生长速度明显加快,同期内HT29-Hpa细胞形成的皮下瘤(12mm×9mm×10mm)较HT29细胞皮下瘤(6mm×8mm×6mm)大,HT29-Hpa细胞皮下瘤回盲部原位种植致肝转移率(71.43%)较HT29细胞肝转移率(14.29%)增高,两者间有显著性差异(P<0.01)。结论:Hpa基因外源性的表达能促进肿瘤细胞的生长、侵袭和转移。     

反义核酸抑制靶基因表达对EB病毒转化细胞的生长控制研究

背景与目的：近年研究表明,EB病毒（Epstein-Barr virus,EBV)潜伏性膜蛋白基因（latent membrane protein gene,LMP)在鼻咽癌的发生和发展中起着重要作用。本研究着重构建体外基因反义转录系统,研究反义LMPmRNA对EBV转化细胞基因表达的抑制作用。方法：构建和制备反义核酸单链有效的体外转录系统;设计和建立反义原位示踪技术,以探测正、反义链配对互补聚合体的定位;通过对EBV转化细胞系（C1936和B95－8）的反义控制,测定细胞生长的抑制率,观测转化细胞凝集表型;通过对EBV－LMP基因表达的检测和MTT吸收活性的测试,测定转化细胞在基因转录下调之后的生存状态。结果：构建成制备反义RNA的SP6／T7双向启动子的体外基因转录系统。反义工程产物AsLMPmRNA通过胞饮作用掺入转化细胞后,经原位示踪显示,正－反义链聚合物的封闭位点主要在mRNA前体剪接加工成熟的后阶段;转化细胞增殖能力下降（生长抑制率85．5％）,细胞转化的凝集表型受抑制,MTT吸收值显著降低,显示被反义控制的C1936和B95－8细胞系的生长受到严重的抑制。应用反义原位示踪系统（antisense tracing system in situ,ATSIS)显示,AsLMPmRNA有特定靶点和抑制效应。结论：本实验所建成的体外反义转录系统所制备的RNA反义工程产物（AsLMPmRNA),有特定的选择靶点作用和高效的生物活性（特定基因LMP表达负调节）。这为反义控制转化细胞和开发反义基因工程药物提供了重要依据。     

逆转录病毒介导的CD/5-FC对胰腺癌细胞的杀伤作用

目的 :探讨大肠埃希菌胞嘧啶脱氨基酶 (CD) /5 -氟胞嘧啶 ( 5 FC)系统对胰腺癌细胞的体外生长抑制作用。方法 :将含CD基因的重组逆转录病毒载体导入胰腺癌细胞形成转化细胞系 ,对转化细胞进行体外药物敏感实验 ,包括 :1)转化细胞在前体药物 5 FC作用下的细胞生长抑制率 ;2 )MTT法检测旁观者效应。结果 :体外实验 5 FC的有效浓度 >2mmol/L时 ,就表现出杀伤作用 ,当 5 FC的有效浓度 >6mmol/L时 ,几乎未见细胞生长 ,PA3 17/CD与TD2混育比例在 90 %时 ,杀伤作用最大 ,相同药物浓度下 ,混育 96h杀伤作用明显高于 2 4h。结论 :CD/5 FC系统对胰腺癌细胞系细胞具有实验性基因治疗作用     

Bhas 42细胞转化试验高通量检测方法的建立及应用

目的: 建立Bhas 42细胞转化试验高通量检测方法,并应用于染料木黄酮(GEN)潜在致癌性的检测中。方法:建立Bhas 42细胞转化试验方法,比较细胞灶法和H2O2法对结果判定的影响。细胞灶法试验组在第21天直接固定染色。H2O2法试验组在细胞接种后第19天采用H2O2处理,染色并测定D(450)以确定细胞转化率。计算转化率以验证两种方法的相关性。并通过细胞生长试验选择适宜的GEN浓度进行细胞转化试验,H2O2法判定转化试验结果。结果:在细胞灶法中,启动试验3-甲基胆蒽(3-MCA)组、促癌试验佛波醇酯(TPA)组的转化灶个数分别与启动、促癌试验DMSO组相比明显升高(P2O2法中,启动试验3-MCA组、促癌试验TPA组的转化灶个数、D(450)分别与启动、促癌试验DMSO组相比均明显升高(PD(450)相对于阴性组有显著差异(P结论:成功建立了Bhas 42细胞转化试验的H2O2法并实现了高通量检测,该法进一步缩短了实验周期并提高了结果的客观性,适用于非遗传毒性致癌物的体外早期筛选。GEN在促癌试验中呈阳性,但在启动试验中呈阴性,提示其可能是非遗传毒性致癌物。     

扇贝提取物诱导Hela细胞凋亡的研究

目的探讨扇贝提取物对体外培养Hela细胞有无凋亡诱导作用。方法体外培养的Hela细胞经不同浓度的扇贝提取物处理24h,经Hoechst 33258(8g/L)染色进行形态学观察、琼脂糖凝胶电泳及流式细胞术(FCM)检测细胞。结果加扇贝提取物处理后,荧光显微镜下观察发现培养细胞中出现核固缩、凋亡小体,琼脂糖凝胶电泳可见DNA ladder条带,流式细胞仪检测有凋亡峰。结论扇贝提取物可诱导体外培养Hela细胞凋亡。     

不同亚型急性髓性白血病细胞转化为树突状细胞的研究

目的 :探讨利用一定组合的细胞因子 ,将不同亚型的急性髓性白血病 (acute m yeloidleukemia,AML)细胞在体外转化为树突状细胞 (dendritic cell,DC)。方法 :8例初发 AML 患者 (其中M1 1例、M2 a3例、M32例、M4 c1例、M51例 )的骨髓单个核细胞 (BMMNC) ,在含 GM- CSF、IL- 4和TNF-α的完全培养液中培养 14天 ,通过光镜及电镜下观察细胞形态、流式细胞仪测定细胞免疫表型和 MTT法混和淋巴细胞反应来鉴定 DC。结果 :6例患者的 BMMNC培养 14天后转化为 DC。 DC的免疫表型 CD1 a、CD83、CD86 、HL A- DR较培养前明显上调 (P<0 .0 5 )。 DC对同种异体 T淋巴细胞有较强的刺激作用 ,远高于对照 (P<0 .0 5 ) ,而且随 DC数量的增加刺激 T细胞增生的活性越强。2例患者(M2 a1例 ,M31例 )的 BMMNC未转化为 DC,免疫表型分析显示 CD83及 CDla的表达较低 ,但 CD86 及HL A- DR的表达明显增高。结论 :利用一定组合的细胞因子可以将 AML细胞在体外转化为形态、表型和功能符合 DC特征的细胞。某些 AML患者的原始细胞不能转化为 DC,与其亚型无关 ,原因有待进一步探讨     

人小细胞肺癌细胞株H446侧群细胞的生物学特征

背景与目的:肿瘤干细胞学说的提出为肿瘤治疗提供了新的靶点和方向,但肿瘤干细胞的分离纯化一直是个难题。本研究拟从人小细胞肺癌细胞株H446中分离并鉴定出具有干细胞特性的侧群(SP)细胞,研究其生物学特征,为肿瘤干细胞的分离纯化奠定基础。方法:采用荧光激活细胞分选(FACS)技术分选得到H446细胞中SP细胞和非侧群(NSP)细胞,并检测纯度。观察形成悬浮肿瘤细胞球的能力,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及荧光定量PCR检测这两种细胞亚群中CD133、ABCG2、NucleosteminmRNA水平。MTT法比较SP细胞、NSP细胞及未分选细胞体外增殖能力及耐药性差异,流式细胞仪检测体外分化能力,裸鼠成瘤实验检测体内成瘤能力。结果:荧光显微镜下H446细胞中Hoechst33342阴性细胞约为(5.1±0.2)%。流式细胞分选结果显示,H446中SP细胞比例为(6.3±0.1)%。SP细胞在无血清培养基中形成悬浮肿瘤细胞球的能力强于NSP细胞。CD133、ABCG2在SP细胞中的表达是NSP细胞的(21.60±0.26)倍、(7.10±0.14)倍,差异有统计学意义(P<0.01);Nucleostemi...