用最低检出限评价大肠埃希菌O157:H7的检测方法及应用研究

目的用最低检出限评价大肠埃希菌O157:H7的三种检测方法,在突发公共卫生事件及食源性致病菌流行病学调查中,将大肠埃希菌O157:H7的检测方法有机组合,提高检测的速度、灵敏度。方法将标准菌株10倍稀释,制备模拟样品,用大肠埃希菌O157:H7的三种方法进行检测,比较不同检测方法的最低检出限。结果标准菌株10倍稀释改良CHROMagar O157显色琼脂平板分离法、免疫磁珠分离法、实时荧光PCR法检测法的最低检出限分别为103、100、102cfu/ml;模拟样品中增菌前改良CHROMagar O157显色琼脂平板分离法、免疫磁珠分离法、实时荧光PCR法检测法的最低检出限分别为105、101、104cfu/ml,增菌培养后改良CHROMagar O157显色琼脂平板分离法、免疫磁珠分离法、实时荧光PCR法检测法的最低检出限分别为102、100、100cfu/ml。结论免疫磁珠分离法在增菌前和增菌培养后的检出限为最低,增菌培养后实时荧光PCR法的检出限也达到了最低,适用于食物中毒及食源性疾病的快速诊断。用改良CHROMagar O157显色琼脂平板分离法进行检测,易造成漏检。将免疫磁珠分离法、实时荧光PCR法有机组合,可以大大提高检测的速度,灵敏度,并且可获得菌株。     

郯城县O157大肠杆菌动物宿主带菌情况调查

[目的]了解郯城县O157大肠杆菌动物宿主带菌情况。[方法]标本直接接种mEC肉汤增菌液,先用免疫金标法筛选,后用免疫磁珠富集分离山梨醇麦康凯、麦康凯琼脂平板,点种CHROMagar O157显色琼脂平板,纯化菌进行生化反应、血清学等检测。[结果]入户采集牛、驴、羊、猪、鸡等新鲜粪便275份,共检出4株O157：H7,6株O157：H-,2株O157：H38,1株O157：H19,1株O157：H45,共计14株。[结论]2000年调查的动物粪便带菌率为5.09%。     

郯城县2000～2001年0157大肠杆菌动物宿主带菌情况调查

目的：了解郯城县O157大肠杆菌动物宿主带菌情况。方法：标本直接接种mEC肉汤增菌液，先用免疫金标法筛选，后用免疫磁珠富集分离山梨醇麦康凯、麦康凯琼脂平板，点种CHROMagar O157显色琼脂平板，纯化菌进行生化反应、血清学等检测。结果：入户采集牛、驴、羊、猪、鸡等新鲜粪便，2000年共采集275份，检出4株O157：H7，6株O157：H-，2株O157：H38，1株O157：H19，1株O157：H45，共计14株（5．09％）；2001年共采集629份，检出4株O157：H7，1株O157：H-，1株O157：H8，共计6株（0．95％）。结论：2000～2001年调查的动物宿主带菌率为2．21％。2001年调查的动物粪便带菌率比2000年明显下降（X^2=13．29，P〈0．01）。     

郯城县2000~2001年O157大肠杆菌动物宿主带菌情况调查

目的:了解郯城县O157大肠杆菌动物宿主带菌情况。方法:标本直接接种mEC肉汤增菌液,先用免疫金标法筛选,后用免疫磁珠富集分离山梨醇麦康凯、麦康凯琼脂平板,点种CHROM agar O157显色琼脂平板,纯化菌进行生化反应、血清学等检测。结果:入户采集牛、驴、羊、猪、鸡等新鲜粪便,2000年共采集275份,检出4株O157∶H7,6株O157∶H-,2株O157∶H38,1株O157∶H19,1株O157∶H45,共计14株(5.09%);2001年共采集629份,检出4株O157∶H7,1株O157∶H-,1株O157∶H8,共计6株(0.95%)。结论:2000~2001年调查的动物宿主带菌率为2.21%。2001年调查的动物粪便带菌率比2000年明显下降(2χ=13.29,P<0.01)。     

大肠杆菌O157:H7的分离鉴定及应用复合PCR法同时检测其三个毒力因子

[目的]对驻滇部队感染性腹泻患者、猪和污水进行大肠杆菌O157：H7(E O157：H7)的分离鉴定。[方法]用O157免疫磁珠富集后，接种S-MAC琼脂平板培养，用MUG试验初筛，VlATEK32全自动微生物鉴定仪鉴定，应用复合PCR法同时检测其三个毒力因子。[结果]从腹泻患者和猪中检出E coli O157：H7，该菌具有三个毒办因子。[结论]云南战区部队存在E coli O157：H7感染。复合PCR法的建立，为腹泻研究领域的病原学监测和流行病学调查提供了新手段。     

大肠杆菌O_(157)∶H_7的分离鉴定及应用复合PCR法同时检测其三个毒力因子

〔目的〕对驻滇部队感染性腹泻患者、猪和污水进行大肠杆菌O157∶H7(EO157∶H7)的分离鉴定。〔方法〕用O157免疫磁珠富集后 ,接种S -MAC琼脂平板培养 ,用MUG试验初筛 ,VIATEK3 2 全自动微生物鉴定仪鉴定 ,应用复合PCR法同时检测其三个毒力因子。〔结果〕从腹泻患者和猪中检出EcoliO157∶H7,该菌具有三个毒办因子。〔结论〕云南战区部队存在EcoliO157∶H7感染。复合PCR法的建立 ,为腹泻研究领域的病原学监测和流行病学调查提供了新手段     

云南战区部队首次检出O157:H7大肠杆菌

[目的]了解EHEC O157：H7在云南战区部队腹泻患者和战区猪、牛和污水中的存在情况。[方法]在SMAC琼脂平板上分离，快速MUG试验初筛，用VITEK32自动微生物生化分析仪鉴定，复合PCR扩增法检测毒素基因。[结果]从人、猪、牛中分别检出EHEC O157：H7和EHECO157：H^-，其中O157：H7检出三个毒力基因。[结论]云南战区至少存在两种不同类型的EHEC O157，要警惕和预防此菌的感染。     

福建省食品污染物监测O157:H7大肠杆菌的调查与分析

目的对福建省食品中O157H7大肠杆菌进行分离调查,并对分离菌株的O157抗原编码基因(rfbnO157)和H7抗原编码基因(flicH7)以及毒力基因(志贺毒素基因stx、粘附抹平因子基因eaeA、溶血素基因hlyA)进行检测.方法按照<全国食品污染物检测相关实验室操作手册(食源性致病菌部分)>的要求,用EC肉汤增菌,快诊金卡筛选,接种CHROMagar O157显色平板,血清和生化系列证实.结果1 380件食品中分离到O157H7大肠杆菌4株,分别为福州的生猪肉和水产品蚶中各1株、尤溪的冻鸡肉2株,检出率0.29%.结论福建省食品中存在O157H7大肠杆菌的污染,虽检出率较低,这可能与福建不是O157H7大肠杆菌的流行地区有关,但监测是一项长期的工作,防患于未然,同时福建省也将O157H7大肠杆菌列入了食品安全预警系统的一部分.     

广东省食品中O157:H7大肠杆菌分离株的生化特征、毒力因子与耐药性的探讨

目的:了解广东省食品中O157:H7大肠杆菌分离株中生化特征、毒力因子的携带与耐药情况。方法:采用免疫磁珠富集法进行O157:H7大肠杆菌分离,对O157:H7大肠杆菌分离株进行生化、噬菌体、血清学鉴定后,应用PCR技术检测其毒力因子,应用纸片法(K-B法)进行药敏试验。结果:从277份样品中分离出2株O157:H7大肠杆菌,总检出率为0.72%;对这2株O157:H7大肠杆菌分离株进行PCR毒力因子的测定,其中1株为携带eaeA、H ly和SLT2毒力因子的强毒株,而另1株分离株未检出毒力因子。药敏试验结果显示,这两个O157:H7大肠杆菌分离株对青霉素类、四环素类、磺胺类、喹诺酮类、大环内酯类5大类的部分抗生素有多重耐药性。结论:广东省食品中存在O157:H7大肠杆菌强毒株的污染。O157:H7大肠杆菌多重耐药株的出现,提示应关注我国畜牧养殖业抗生素的使用情况。     

郑州市2005年肠出血性大肠杆菌O157∶H7感染状况调查

目的：了解郑州市肠出血性大肠杆菌O157∶H7在腹泻病人中的检出情况和宿主动物带菌及毒力基因情况.方法：对采集的宿主动物和腹泻病人粪便及食品应用免疫磁珠富集分离法进行大肠杆菌O157∶H7分离和鉴定.结果：郑州市内共发现3例肠出血性大肠杆菌O157∶H7感染病例,首次从腹泻病人中检出产毒O157∶H7菌株,采集5种以上动物粪便标本共计475份,从牛粪（247份）中分离到16株O157∶H7,检出率为6.48%,从羊粪（33份）中分离到3株O157∶H7,检出率为9.10%,并检出3株产毒O157∶H7菌株.采集5类市售食品共146份,未分离到O157∶H7.结论：郑州市存在发生肠出血性大肠杆菌O157∶H7感染暴发或流行的潜在危险.     

大肠埃希菌O157:H7的实时荧光PCR检测方法研究

目的建立一种敏感、特异、快速的大肠埃希菌O157:H7的检测方法,应用于突发公共卫生事件及食源性致病菌流行病学调查的检测。方法根据GenBank大肠埃希菌O157:H7rfbE基因序列,设计引物和TaqMan探针,对实时荧光PCR反应条件进行优化,建立实时荧光PCR检测大肠埃希菌O157:H7的反应体系,并对该法的特异性、敏感性和重复性进行评价。结果大肠埃希菌O157:H7菌株的检测结果均为阳性,而所有其它菌株检测结果均为阴性;该方法检测的灵敏度可达1×102cfu/ml。模拟污染的猪肉、羊肉、鸡肉、生食蔬菜样品,均可检出1×104cfu/ml的细菌。从细菌核酸提取至完成检测约需3 h。结论建立的实时荧光PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强、快速等优点,可用于大肠埃希菌O157:H7食物中毒的快速诊断和食品微生物检测,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段。     

熔解曲线分析方法甄别肠出血性大肠杆菌O157:H7

目的:采用熔解曲线分析技术,建立一种快速、简便、准确地甄别肠出血性大肠杆菌O157:H7方法。方法:选取肠出血性大肠杆菌O157:H7编码脂多糖基因(rfbE)和编码鞭毛抗原基因(fliC)作为检测靶基因,建立荧光PCR反应体系。结果:通过多种标准菌株试验,结果显示所建立的熔解曲线分析法可特异性地甄别肠出血性大肠杆菌O157:H7;纯培养的灵敏度达到2.8×101cfu/ml;检测108例临床样本,其中18例肠出血性大肠杆菌O157:H7阳性,3例为肠出血性大肠杆菌O157:非H7阳性,与常规培养方法的符合率达到100%。结论:本方法可简便、准确地甄别肠出血性大肠杆菌O157:H7,结果可靠,通过进一步增加反应体系中引物的数量可同时对肠出血性大肠杆菌其他血清型进行鉴定。     

大肠杆菌O157胶体金免疫层析快速筛查方法的建立

目的建立一种大肠杆菌O157的胶体金免疫层析快速筛查方法。方法利用胶体金免疫层析技术,采用双抗体夹心法检测大肠杆菌O157,对该法进行敏感性、特异性和食品样品的适用性分析。结果该法能在15分钟内完成检测,检测不同的肠杆菌科细菌(非O157型大肠杆菌、沙门菌、志贺菌、变形杆菌、柠檬酸杆菌、肠杆菌、沙雷菌、耶尔森菌)、葡萄球菌、李斯特菌、气单胞菌、弧菌等共24种30株常见细菌,未发现有交叉反应,显示该法特异性良好。检测大肠杆菌O157的最低检出浓度为1×105cfu/ml。方法适用于奶粉、面粉、淀粉、咖啡粉、饼干、蛋糕、果冻、燕窝和果汁等食品样品的检测。结论新建立的大肠杆菌O157胶体金免疫层析试验简便、快速,特异性和灵敏度较好,适用于现场样品的快速筛查。     

大肠杆菌O157多克隆抗体及食品中双抗ELISA测定方法的研究

本研究获得了抗肠出血性大肠杆菌O157:H7的多克隆抗体 ,建立了一种适宜食品样品检测的双抗ELISA检测方法。该方法对纯培养菌液检出限为 10 3 ～ 10 4 cfu ml;只对O157菌株有特异性反应 ,对非O157菌株无交叉反应 ;经过增菌 ,鸡肉与牛奶染菌样品中的大肠杆菌O157的检出限均为 0 1cfu g(cfu ml)。     

大肠杆菌O_(157)∶H_7实时荧光PCR快速检测方法的建立

[目的]利用特异性荧光探针为特点的TaqM an荧光定量PCR技术,建立大肠杆菌O157∶H7污染的快速敏感特异的检测方法。[方法]以大肠杆菌O157∶H7的rfbE基因作为靶序列,设计一对引物和探针,以大肠杆菌O157∶H7菌株提取核酸DNA作为模板,优化引物和探针的浓度比和Mg2+浓度,以大肠杆菌O157∶H7和10种相关细菌考核检测体系的灵敏性、稳定性和特异性。[结果]建立的反应体系在引物和探针的浓度为0.6μmoL/L、0.8μmoL/L,Mg2+浓度为4mmoL/L时,具有良好的特异性和敏感性。在10株相关菌株的检测中,除大肠杆菌O157∶H7出现很好的阳性外,其余菌株均为阴性。在纯菌条件下,定量检测低限为17 cfu/mL。同一样品重复检测3次C t值的变异系数均小于5%。[结论]该方法特异性强,稳定性高,操作简便快捷,适应食品微生物检验发展需要,具有较大的推广及应用价值。     

大肠杆菌O157∶H7双重荧光PCR方法的建立与应用

摘要:目的　建立快速检测食品中大肠杆菌O157︰H7的双重荧光PCR 方法。方法　针对大肠杆菌O157︰H7菌体抗原O和鞭毛抗原H的特异性基因rfbE（O157）和fliC（H7）筛选设计引物和探针,优化反应条件,建立可特异性检测大肠杆菌O157︰H7的双重荧光PCR方法,并对该法的特异性、敏感性和重复性进行评价,对模拟样品和实际样品进行初步验证。结果　利用建立的方法对2株大肠杆菌O157︰H7及12株非大肠杆菌O157︰H7进行检测,O157︰H7菌株检测结果均为rfbE和fliC阳性,非O157︰H7菌株检测结果均为阴性,rfbE和fliC基因的特异性均为100%;2基因的检测灵敏度可达1.16×102 CFU/ml;批内、批间变异系数均小于3.5％;模拟样品立即检测,2个基因的最低检出限（2.7×102 CFU/ml）和细菌纯培养时接近;实际样品检测结果与我国检验检疫行业标准（SN/T 0973-2010）的检测结果一致。结论　建立的荧光定量PCR 方法特异性及重复性好,灵敏度高,可快速准确鉴定大肠杆菌O157︰H7菌株。     

PCR和毛细管电泳技术检测沙门氏菌等5种病原菌的方法研究

目的采用多重PCR技术检测结合毛细管电泳成像技术建立快速检测沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O157的方法。方法根据沙门氏菌hilA基因、志贺氏菌ipaH基因、副溶血性弧菌TDH基因、金黄色葡萄球菌的pSa-442 Sau3AI fragment基因及大肠杆菌O157的rfbE基因设计异性特PCR引物,被检样品经4 h振荡培养后金属浴裂解制备DNA模板,使用全自动毛细管电泳核酸检测系统分析PCR扩增产物。结果在580 bp、423bp、257 bp、245 bp和194 bp处分别出现预期的特异性DNA条带,且无非特异扩增条带出现。敏感性试验显示在模拟标本中的检测灵敏度,沙门氏菌为101-2cfu/ml、志贺氏菌为101cfu/ml、副溶血性弧菌为102cfu/ml、金黄色葡萄球菌为102cfu/ml、大肠杆菌O157为101cfu/ml。结论该方法操作方便、特异性和灵敏度高、分辨率高,可同时完成5种病原菌的检测,在公共卫生突发事件中具有实用价值。     

食品样品中大肠杆菌O157:H7复合PCR检测方法的研究

根据大肠杆菌O15 7:H7特异性基因fliC ,rfbE ,SLTI与SLTII设计四对引物 ,建立了复合PCR方法 ,扩增产物长度分别为为 5 6 0bp ,6 78bp ,2 10bp与 4 84bp。该方法可以一步检测出O15 7与H7特异性抗原基因 ,并可同时检测该菌产生SLT毒素的类型 ,与 71株试验菌株的基因型完全配合 ,是一种特异、高效的检测方法。该方法适用于牛奶样品中大肠杆菌O15 7:H7的检测 ,经过增菌步骤检测限可达 0 1cfu ml     

沙门菌、志贺菌和大肠杆菌O157∶H7的多重PCR快速检测体系的初步探讨

目的建立能在12小时内同时快速检测沙门菌、志贺菌和大肠杆菌O157∶H7的多重PCR体系。方法碱性蛋白胨水(BPW)非选择性增菌6h;100℃10min制备DNA模板;根据大肠杆菌O157∶H7的uidA基因、志贺菌的ipaH基因及沙门菌的invA基因序列设计各菌引物,进行PCR扩增及电泳检测。同时优化反应体系,测定体系灵敏度和特异性。结果该多重PCR体系能在12h内同时检测3种目的菌;灵敏度为10～30cfuml;通过对23株目的菌和15株非目的菌检测,提示该体系特异性高。结论初步探讨出能在12h内快速、灵敏、特异地同时测定沙门菌、志贺菌和大肠杆菌O157∶H7的多重PCR体系。