构建Loa22基因去信号肽片段原核重组表达载体

目的：构建赖型钩端螺旋体OmpA膜蛋白Loa22基因去信号肽片段的原核表达载体，并对其进行克隆表达。方法：实验于2004—12／2005—12在四川大学华西医学中心感染免疫研究室完成。以赖型钩端螺旋体017株基因组DNA为模板，PCR扩增Loa22基因去信号肽片段，亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1，经双酶切、PCR鉴定，筛选出阳性重组质粒克隆。经DNA测序正确后，转化大肠杆菌，利用IPTG进行诱导表达，通过SDS—PAGE鉴定表达产物。结果：PCR获得长516bp的片段。Loa22基因去信号肽片段与pGEX-4T-1的重组质粒构建成功。重组质粒经IPTG诱导后能在大肠杆菌中表达Mr45000的融合蛋白。结论：制备了Loa22基因去信号肽片段原核重组表达载体，为钩体新型疫苗的研究奠定基础。     

金黄色葡萄球菌肠毒素B的基因克隆及原核表达

目的 构建金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)基因的原核表达克隆,并在大肠杆菌中表达.方法 从金黄色葡萄球菌中提出DNA,PCR扩增出肠毒素B(SEB)成熟肽前体蛋白基因,将其插入到质粒pGEX-4T-2编码谷胱甘肤转移酶(GST)的多克隆位点(MCS),构建原核表达克隆(PGEX-4T-2/SEB).重组质粒经酶切、测序鉴定后转化大肠杆菌,IPTG诱导表达目的 蛋白.SDS-PAGE电泳分析蛋白图谱.Western blot鉴定表达蛋白.结果 经酶切和测序分析,表明成功构建了pGEX-4T-2/SEB原核表达克隆.经IVTG诱导,转化的大肠杆菌表达出相对分子质量(Mr)为55×103Daltons的融合蛋白,且该蛋白能与抗SEB抗体发生特异性结合反应.结论 金黄色葡萄球菌肠毒素B(SES)基因原核表达克隆的成功构建,并在大肠杆菌中高效表达,为进一步研究肠毒素B(SEB)的生物学功能和-临床应用奠定了基础.     

犬黑皮质素受体3原核表达载体的构建与表达

背景:近年黑皮质素受体家族在体内能量平衡中的作用越来越受到重视.黑皮质素受体3基因突变是引起体质量增加的重要因素之一,但是目前对黑皮质素受体3的深入研究很少,且未见在蛋白水平上检测其表达的单克隆抗体.目的:构建犬黑皮质素受体3基因编码区的原核表达载体并在大肠杆菌中诱导表达.方法:以Beagle犬基因组DNA为模板,设计特异性引物,经PCR技术扩增目的片段后,克隆到pMD18-T载体上,双酶切鉴定以后将目的基因亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1上,转化到E.coli DH5α,筛选阳性克隆,DNA测序检测插入序列的正确性.将测序正确的重组表达质粒pGEX-4T-1-cMC3R转化到E.coli BL21内,经IPTG诱导后,利用Western blot检测犬黑皮质素受体3融合蛋白的表达.结果及结论:成功构建重组表达质粒pGEX-4T-1-cMC3R,经DNA测序证实插入序列与Genebank上公布的序列一致.此重组体经诱导后能在E. coli BL21内表达犬黑皮质素受体3融合蛋白,为进一步获取犬黑皮质素受体3的单克隆抗体奠定物质基础,也为研究大黑皮质素受体3蛋白的结构和生理功能提供帮助.     

骨形态发生蛋白诱导基因克隆和表达的实验研究

目的:用基因工程技术在大肠杆菌中表达骨形态发生蛋白诱导基因(BMP-2-inducedgene3kbgene,BIG-3)所编码的蛋白。方法:依据Genbank中BIG-3的基因序列设计并合成引物,从新生小鼠颅骨组织中提取总RNA,通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)得到BIG-3全长编码序列。将所得到的基因片段克隆至原核表达载体pGEX-4T-2的多克隆位点获得pGEX-4T-2-BIG-3重组表达载体,经测序证实后转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,挑选阳性克隆,经诱导表达后SDS-PAGE鉴定。结果:克隆得到BIG-3全长编码序列并在大肠杆菌中表达了GST-BIG-3融合蛋白,融合蛋白约占菌体总蛋白的45.3%。结论:通过RT-PCR从新生小鼠颅骨中克隆到BIG-3基因并在大肠杆菌中获得GST-BIG-3融合蛋白的高水平诱导表达。     

GRIM-19及其截断体原核表达载体的构建及表达与纯化

目的构建GRIM-19及其截断体原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达并纯化融合蛋白。方法用RT-PCR法从HeLa细胞中扩增出带BamHⅠ、XhoⅠ酶切位点的GRIM-19及其截断体基因片段,将GRIM-19及其截断体基因片段克隆到pGEX-4T-3原核表达载体上,在大肠杆菌中诱导表达GST-GRIM-19及其截断体融合蛋白,用Glutathione Sepharose 4B纯化,纯化后蛋白经Western-blot鉴定。结果 pGEX-4T-3-GRIM-19及其截断体原核表达载体构建正确,并在大肠杆菌中成功诱导表达,IPTG诱导以浓度0.5mM,时间2h为宜,且通过Glutathione Sepharose4B成功纯化到融合蛋白。结论成功构建GRIM-19及其截断体原核表达载体,诱导表达并纯化GST-GRIM-19及其截断体融合蛋白。     

SPACR原核表达载体的构建和表达

目的构建Sialoprotein associated with cones and rods（SPACR）原核表达载体并高效表达。方法根据基因文库中SPACR基因的cDNA序列设计引物,采用PCR方法扩增SPACR cDNA片段,并克隆进原核表达载体pGEX-6P-1中,转化于大肠杆菌BL21,测序鉴定后,用IPTG诱导表达出目的蛋白,经谷胱甘肽琼脂糖柱柱层析纯化,收获表达产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western blot鉴定。结果 PCR后扩增得到的目的片段,经酶切鉴定及DNA序列测定,证实重组载体pGEX-6P-1-SPACR构建正确,表达蛋白分子量约为分别为21.2、22.6、36.2及20.8kDa。结论在大肠杆菌中获得了SPACR片段的高效表达,为研究其蛋白功能奠定了基础。     

人B型钠尿肽原核表达载体的构建、表达及蛋白纯化

目的构建人B型钠尿肽(Human B-type Natriurtic Peptide,BNP)原核表达载体并诱导其表达、纯化及鉴定。方法根据已报道的人BNP基因序列,采用RT-PCR技术从人心肌组织中获得B型钠尿肽cDNA序列。将所得的PCR产物插入克隆载体pGEM-T-easy中,得重组质粒,经酶切、PCR及测序鉴定正确后,将酶切目的片段插入原核表达载体pGEX-6P-1中并转化大肠杆菌E.coliBL21,通过IPTG诱导表达出带有GST-BNP的融合蛋白。经Glutathione Sepharose4B亲和层析纯化融合蛋白。结果序列分析表明,人B型钠尿肽基因活性肽编码区含有96bp,编码32个氨基酸,与GenBank(NM002521)中已报道的BNP核苷酸序列一致。经IPTG诱导表达、SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析显示,表达的融合蛋白占菌体蛋白总量的30%,相对分子质量约为29KD,并与商品化的人BNP单抗呈特异性反应。经Glu-tathione Sepharose4B纯化获得SDS-PAGE电泳下单一条带。结论获得了人GST-BNP蛋白,为制备BNP检测试剂奠定了基础。     

大鼠脑源性神经营养因子的克隆及原核重组表达载体的构建

目的:构建重组表达载体pGEX-脑源性神经营养因子(BDNF),探讨其原核表达BDNF的可行性。方法:大鼠BDNF进行密码子优化,人工合成BDNF的全基因序列,经回收、纯化、酶切后连接到pGEX原核表达载体中,将重组质粒pGEX-BDNF转化大肠杆菌BL21细胞中,筛选阳性克隆,经IPTG诱导表达后,利用ELISA方法鉴定其表达的活性。结果:PCR鉴定及测序显示BDNF序列完全正确,BDNF基因的克隆和表达载体构建成功,IPTG诱导表达目的蛋白经ELISA检测,其表达的目的蛋白具有一定的活性。结论:经密码子优化后经人工合成得到BDNF基因片段并成功构建pGEX-BDNF重组表达载体,具有一定的生物活性。     

间日疟原虫乳酸脱氢酶GST融合表达载体的构建及表达

目的构建间日疟原虫乳酸脱氢酶（PvLDH）融合表达载体,并表达PvLDH的GST融合蛋白。方法将PvLDH基因片段克隆到表达载体pGEX-4T-1中,构建PvLDH/pGEX-4T-1融合表达载体,IPTG诱导表达目的基因,SDS-PAGE电泳分析表达产物,Western blot检测其抗原性。结果成功构建了PvLDH/pGEX-4T-1融合表达系统,在大肠杆菌BL21中以包涵体形式高效表达,表达产物能与恶性疟原虫和间日疟原虫感染患者血清反应,而不与正常人血清反应。结论间日疟原虫LDH蛋白在大肠杆菌中获得高效表达,表达产物具有良好的抗原性。     

骨形态发生蛋白诱导基因克隆和表达的实验研究

目的：用基因工程技术在大肠杆菌中表达骨形态发生蛋白诱导基因（BMF-2-induced gene 3 kb gene，BIG-3)所编码的蛋白。方法：依据Genbank中BIG-3的基因序列设计并合成引物，从新生小鼠颅骨组织中提取总RNA，通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)得到BIG-3全长编码序列。将所得到的基因片段克隆至原核表达载体pGEX-4T-2的多克隆位点获得pGEX-4T-2-BIG-3重组表达载体，经测序证实后转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，挑选阳性克隆，经诱导表达后SDS-PAGE鉴定。结果：克隆得到BIG-3全长编码序列并在大肠杆菌中表达了GST-BIG-3融合蛋白，融合蛋白约占菌体总蛋白的45．3％。结论：通过RT-PCR从新生小鼠颅骨中克隆到BIG-3基因并在大肠杆菌中获得GST-BIG-3融合蛋白的高水平诱导表达。     

刚地弓形虫RH株主要表面抗原1的基因克隆及原核表达

目的 从刚地弓形虫RH株基因组DNA中扩增出其主要表面抗原1(SAG1)全长的基因编码序列，构建重组原核表达载体并在大肠埃希菌中进行表达，为进一步研制弓形虫病免疫诊断试剂盒打下基础。方法 根据弓形虫RH株主要表面抗原SAG1的cDNA序列设计一对引物，利用聚合酶链反应(PCR)技术从RH株弓形虫基因组中扩增出SAGl的全长基因，将其克隆到载体pGEX-4T-3中，并通过基因测序加以证实；重新设计引物将其亚克隆至原核表达载体pET-32c中，在大肠埃希菌中经IPTG诱导表达。结果 从刚地弓形虫RH株基因组中成功扩增到1030bp的全长SAG1基因，该基因在原核系统中经诱导表达出一分子量约37000大小的融合蛋白，表达产物以包涵体的形式存在。结论 SAG1是弓形虫主要的表面抗原，原核表达的sAG1融合蛋白在弓形虫病的免疫诊断中具有明显的潜在应用价值。     

结核分枝杆菌Rv1884c和Rv0867c基因的克隆表达及其促生长作用的研究

目的 构建结核分枝杆菌Rv1884c和Rv0867c基因的原核表达质粒,获得结核分枝杆菌Rvl884c和Rv0867c基因的表达蛋白,并初步研究其促生长作用.方法 制备结核分枝杆菌基因组DNA,采用PCR技术扩增目的 基因片段;将2个片段分别克隆入克隆载体pGEx-4T-1和pUC19,再分别克隆入原核表达载体pGEX-4T-1和pPRO-EXHT,经序列测定证实正确后,再经异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导表达GST标记的Rv1884c融合蛋白和His标记的Rv0867c融合蛋白;用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白的相对分子质量大小及表达形式.结果 成功扩增出了结核分枝杆菌Rv1884c和Rv0867c基因,构建了具有正确基因序列的质粒载体pGEX-4T-1-Rv1884c和pPRO-EXHT-Rv0867c,转化人大肠杆菌DH5α中经诱导产生高水平的表达产物.经SDS分析,在相对分子质量为45 000和80 000处出现新生蛋白带,凝胶薄层扫描检测表达量分别约占菌体蛋白的18.3%和23.7%.用GSTrap FF亲和层析柱和Ni2+-NTA纯化柱进行蛋白纯化,并研究这两种蛋白对藤黄微球菌、BCG和结核分枝杆菌H37Rv的促生长作用.结论 成功克隆了结核分枝杆菌Rv1884c和Rv0867c基因并得到了其大肠杆菌表达产物,为进一步研究Rv1884c和Rv0867c基因蛋白的活性及其功能,以及研究结核分枝杆菌快速促生长作用奠定了基础.     

哺乳动物极性蛋白mInscuteable-C末端肽段/GST融合蛋白的原核表达与纯化

目的:构建哺乳动物极性蛋白mInscuteable C末端257～532位氨基酸结构域与谷胱甘肽巯基转移酶(GST)的融合蛋白GST-mInsc 257～532的原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化该融合蛋白。方法:将已经构建好的mInsc 257～532位氨基酸序列克隆至原核表达载体pGEX-4T中,构建重组的质粒pGEX-4T/mInsc 257～532;将重组质粒转化感受态细菌BL21,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达GST蛋白;经谷胱甘肽-琼脂糖球珠分离纯化;产物经SDS-PAGE电泳及Western Blot鉴定。结果:获得高表达及纯化的pGEX-4T/mInsc 257～532融合蛋白。结论:成功构建重组pGEX-4T/mInsc 257～532原核表达载体;诱导表达pGEX-4T/mInsc 257～532融合蛋白并纯化。     

小鼠OC-STAMP蛋白表达、纯化、抗体制备及鉴定

目的 OC-STAMP蛋白是一种功能尚不明确的六次跨膜蛋白,通过制备多克隆抗体来为进一步研究其功能奠定基础.方法 采用PCR技术扩增出目的基因,将其克隆到pGEX-4T-1原核表达载体中.经IPTG诱导后,重组质粒pGEX-4T-1/OC-STAMP表达含重组谷胱甘肽转移酶（GST）的融合蛋白GST-OC-STAMP.GST-OC-STAMP融合蛋白经纯化后免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体.此后应用ELISA及Western blot方法鉴定该抗体.结果 pGEX-4T-1/OC-STAMP重组质粒构建成功,并通过原核表达获得达到免疫要求的融合蛋白.免疫所得抗体血清经间接ELISA法、Western blot检测,确定获得了高效价的小鼠OC-STAMP多克隆抗体.结论 成功制备了小鼠OC-STAMP抗体,为进一步研究基因功能奠定了基础.     

金黄色葡萄球菌肠毒素B基因在大肠杆菌中的克隆及表达

目的扩增金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)基因,构建其原核表达载体,并进行诱导、表达,为其应用研究奠定基础。方法根据GenBank中SEB的基因序列,设计一对分别含BamHⅠ、XhoⅠ酶切位点的特异性引物,以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板进行PCR扩增后,经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切,并与做相应酶切的pET-28α(+)连接,转化大肠杆菌BL21,提取质粒进行双酶切鉴定及测序,用IPTG诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE和Western blot印迹鉴定表达产物。结果成功扩增出SEB基因,基因大小为801bp,重组PET-28α(+)-SEB双酶切鉴定可见目的片段,测序结果显示SEB在正确读框中,序列比对分析显示其与相关报道核苷酸序列一致性达99%。经IPTG诱导后,pET-28α(+)-SEB/BL21在相应的相对分子质量(35×103)可见融合蛋白以包涵体形式表达,免疫印迹在相应分子量检测到目的蛋白。结论克隆了SEB基因,并成功在大肠杆菌BL21中以包涵体形式表达,为肠毒素B应用研究奠定了基础。     

自身抗原OGDC-E2融合蛋白的克隆表达与鉴定

目的 基因工程重组表达2-氧戊二酸脱氢酶复合体E2（OGDC-E2）融合蛋白。方法 用PCR方法扩增得到OGDC-E2的基因片段，插入表达载体pET28a（＋），构建重组表达载体pET28a（＋）-OGDC-E2，测序正确后在大肠杆菌BL21（DE3）中表达。结果 获得OGDC-E2融合蛋白，经SDS-PAGE分析，相对分子质量与预期大小一致；经免疫学鉴定，重组抗原片段具有抗线粒体抗体二亚型（AMA-M2）的免疫原性。结论 基因重组表达的融合蛋白将有利于原发性胆汁性肝硬化（PBC）的实验诊断。     

乙型肝炎病毒核心抗原在大肠杆菌中的构建及表达

目的用基因工程的方法获得乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)编码区的基因片段,构建重组质粒并在大肠杆菌中表达抗原蛋白。方法用PCR法扩增HBcAg基因片段,构建含有HBcAg基因的克隆质粒及表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)plys中以IPTG诱导重组蛋白的表达,并用Western blot对重组蛋白进行检测。结果重组HBcAg在大肠杆菌中得到表达,Western blot检测显示在预期位置出现特异性条带。结论成功构建HBcAg原核表达系统并获得重组HBcAg,为该重组蛋白的相关功能研究奠定了基础。     

小鼠次级淋巴组织趋化因子的原核表达及纯化

背景：次级淋巴组织趋化因子（secondary lymphoid-tissue chemokine,SLC/CCL21）是近年来发现的,具有免疫调节作用及抗肿瘤活性。目的：构建小鼠次级淋巴组织趋化因子原核表达载体,并在大肠杆菌中高效表达重组蛋白。方法：取C57BL/6小鼠淋巴结细胞,体外用Poly（I：C）刺激后提取RNA并反转录,以此cDNA为模板,通过PCR技术扩增出CCL21成熟蛋白编码序列。克隆入原核表达载体pBEn-SBP-SET1a,构建融合表达载体pBEn-CCL21。将表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3）,经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导后TRICINE-SDS-PAGE电泳分析和鉴定重组蛋白的表达。CCL21融合蛋白经链霉亲和柱层析纯化。结果与结论：实验成功构建了CCL21基因的原核表达载体pBEn-CCL21,并获得相应的融合蛋白。结果显示CCL21可在大肠杆菌中高效表达,经链霉亲和柱层析纯化即可获得CCL21重组目的蛋白。