不同细胞类型对cbf α1调控DSPP基因转录的影响

观察核心结合因子α1（core binding factor α1,cbf α1）对不同细胞中牙本质涎磷蛋（dentin sialophosphopmtein,DSPP）基因转录调控的影响。方法：选择Hela和小鼠成牙本质细胞样细胞MDPC-23为实验细胞;DSPP基因上游2.6kb片段为启动子。采用瞬时转染、报告基因等方法观察在两种细胞中,cbfα1对DSPP基因启动子启动活性的影响。结果：在MDPC-23及Hela细胞中,pGL3-Enhancer-2.6K与pcDNA3-cbfα1共转染组荧光素酶的表达量均小于pGL3-Enhancer-2.6K与pcDNA3共转染组（P〈0.01）：在MDPC-23细胞中变化更为明显。结论：cbfα1对DSPP基因的转录调控作用受细胞类型的影响。     

DSPP基因启动子不同片段启动活性的对比分析

目的：对比分析牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein,DSPP）基因启动子不同片段的启动活性。方法：选择小鼠成牙本质细胞样细胞MDPC-23为实验细胞,利用含DSPP基因启动子不同片段的真核表达载体,采用报告基因方法观察DSPP基因启动子不同片段的启动活性。结果：在MDPC-23细胞中,DSPP基因启动子不同片段的真核表达载体均不同程度地表现了启动活性,其启动活性有差异（P〈0.01）。结论：DSPP基因启动子不同片段的启动活性有差异,其活性变化反映位于-95bp～54bp、-410bp～-195bp、-1243bp～-791bp、-1447bp～-1243bp、-3519bp～-2475bp区存在潜在的增强子;-195bp～-95bp、-670bp～-410bp、-2475bp～-1447bp区存在潜在的抑制子。进一步明确了DSPP基因启动子的结构,为今后研究DSPP基因的特异性表达奠定基础。     

Smad3对小鼠牙本质涎磷蛋白启动子片段的调控

目的：在小鼠成牙本质细胞系MDPC-23中分析DSPP启动子活性,了解TGF-1的信号分子Smad3对小鼠牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein,DSPP）基因启动子片段的调控作用。方法：瞬时转染和报告基因检测。结果：TGF-β1可以下调pGL3LUC-Pdspp-410～-176bp和pGL3LUC-Pdspp-410～＋54bp的活性,Smad3可以加强这种下调作用;它们对pGL3LUC-Pdspp-195～＋54bp的调控作用不明显。结论：TGF-β1可以通过Smad3信号通路对DSPP启动子进行调控;在DSPP启动子-410～-176bp之间,存在着其它的启动元件,促使其启动活性。在DSPP启动子-195～＋54bp区域内,存在DSPP抑制子元件,发挥负调节作用,导致启动活性下降或丧失。     

Cbfαl对小鼠牙本质涎磷蛋白基因启动子转录调控作用的研究

目的研究Cbfαl对牙本质涎磷蛋白基因启动子转录活性的影响。方法确定Cbfa1瞬时转染的最高表达时间点后,将含牙本质涎磷蛋白基因上游启动子的真核表达载体与PCMV5-Cbfαl共转染MDPC-23细胞,分析Cbfαl对牙本质涎磷蛋白基因启动子的转录调控作用。结果MDPC-23细胞转染PCMV5-Cbfαl后,Cbfαl在48h时表达量最高。Cbfa1表达对各段启动子都有激活作用。结论Cbfαl对牙本质涎磷蛋白基因启动子有转录激活的调控作用。     

TGF-β1/Smad3信号途径对牙本质涎磷蛋白基因表达的调控

目的：研究小鼠成牙本质细胞系MDPC-23中TGF-β1及其信号分子Smad3对小鼠牙本质涎磷蛋白（dentinsialophosphoprotein，DSPP）基因表达中的调控作用。方法：PCR法制备DSPP引物、构建带有DSPP启动子片段的萤火虫荧光素酶基因报告载体，通过瞬时转染入MDPC-23细胞后，检测报告基因活性。结果：在TGF-β1的作用下，Smad3可以发生转位表达，由细胞浆转入细胞核内。同时，过表达野生型Smad3可以显著增强TGF-β1对DSPP启动子活性的下调作用。结论：TGF-β1可以通过Smad3信号通路对DSPP启动子进行调控；在DSPP启动子-2525-＋54bp之间，存在TGF-β1／Smad3信号途径的结合位点，从而发挥对DSPP基因的调控作用。     

MDPG-23细胞内Smad信号途径在转化生长因子β1调控Smad7基因转录中的作用

目的研究成牙本质细胞系MDPC-23内Smad信号途径在转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)调控Smad7基因转录调控中的作用,从基因转录水平探讨成牙本质细胞内TGF-β调控Smad7基因表达的分子机制.方法培养MDPC-23细胞,通过瞬时共转染和报告基因检测方法观察Smad蛋白分子对Smad7启动子活性的影响,实验数据采用单因素方差分析.结果当Smad7启动子(-408 bp至+112bp)荧光素酶活性载体表达在MDPC-23细胞时,其基础启动子活性被TGF-β1显著诱导增加,而骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)对其活性无明显影响.单独过表达Smad1、2、4、5对Smad7启动子活性无明显影响.Smad3过表达显著增强Smad7启动子活性,而Smad3与Smad4共转染进一步增强了Smad3的作用.过表达Smad3突变型载体或Smad3反义cDNA(AS-Smad3)均显著抑制TGF-β1对Smad7启动子活性的诱导作用.结论在成牙本质细胞系MDPC-23内,TGF-β通过Smad3与Smad4协同调控Smad7基因转录.     

MDPC-23细胞内Smad信号途径在转化生长因子β1调控Smad7基因转录中的作用

目的：研究成牙本质细胞系MDPC-23内Smad信号途径在转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)调控Smad7基因转录调控中的作用，从基因转录水平探讨成牙本质细胞内TGF-β调控Smad7基因表达的分子机制。方法：培养MDPC-23细胞，通过瞬时共转染和报告基因检测方法观察Smad蛋白分子对Smad7启动子活性的影响，实验数据采用单因素方差分析。结果：当Smad7启动子(-408bp至 112bp)荧光素酶活性载体表达在MDPC-23细胞时，其基础启动子活性被TGF-β1显著诱导增加，而骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)对其活性无明显影响。单独过表达Smad1、2、4、5对Smad7启动子活性无明显影响。Smad3过表达显著增强Smad7启动子活性，而Smad3与Smad4共转染进一步增强了Smad3的作用。过表达Smad3突变型载体或Smad3反义cDNA(AS-Smad3)均显著抑制TGF-β1对Smad7启动子活性的诱导作用。结论：在成牙本质细胞系MDPC-23内，TGF-β通过Smad3与Smad4协同调控Smad7基因转录。     

Cbfa1在Smad3调控牙本质涎磷蛋白基因转录过程中的作用

目的：研究转录因子核心结合因子a1（Cbfa1）在Smad3分子调控牙本质涎磷蛋白（DSPP）基因表达中的作用。方法：培养MDPC-23细胞,通过瞬时共转染和报告基因检测方法观察Cbfa1对TGF-β1调控目的基因dspp转录的影响。结果：Cbfa1可以抑制DSPP启动子的活性,TGF-β1可以降低Cbfa1对DSPP的抑制作用,当Cbfa1与Smad3共同作用于DSPP启动子时,对DSPP转录活性的抑制作用更强。Cbfa1的两个亚型Osf2和PEBP2αA在DSPP转录调控过程中可能发挥的功能不完全一致。结论：转录因子Cbfa1可以与Smad3共同作用,调控DSPP基因启动子的转录表达。     

转录因子c-Jun和c-Fos在牙本质涎磷蛋白基因表达中的作用

目的 研究成牙本质细胞内转录因子c-Jun和c-Fos在牙本质涎磷蛋白（DSPP）基因转录调控中的作用, 探索成牙本质细胞内DSPP基因表达的调控机制。方法 细胞免疫组化观察MDPC-23细胞内c-Jun和c-Fos蛋白分子的表达。瞬时转染和报告基因检测c-Jun和c-Fos在DSPP基因转录中的作用。结果 MDPC-23细胞表达c-Jun和c-Fos蛋白,c-Jun和c-Fos主要分布在MDPC-23细胞胞核。c-Jun或c-Fos过表达均显著抑制DSPP基因启动子活性。结论 证实成牙本质细胞内转录因子c-Jun和c-Fos参与下调DSPP基因表达。     

小鼠牙本质涎磷蛋白5′端非编码区启动子报告基因载体的构建和分析

目的：克隆小鼠牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphopmtein，DSPP)基因启动子，构建含DSPP启动子不同片段的报告基因载体，在小鼠成牙本质细胞系MDPC-23中分析各种载体中DSPP启动子活性：方法：PCR、报告基因载体构建、瞬时转染和报告基因检测。结果：PCR获得DSPP启动子的3个不同片段，将它们克隆到萤火虫荧光素酶报告基因载体pG13-Enhancer，构建出3种含DSPP启动子不同片段的报告基因载体，将这些报告基因载体瞬时转染至MDPC-23细胞，载体中的启动子具有不同的活性。结论：成功构建了含小鼠DSPP启动子片段的报告基因载体，为以后研究DSPP基因表达调控的分子机制提供了实验工具。     

小鼠牙本质涎磷蛋白启动子报告基因载体的构建和启动子活性分析

目的：克隆小鼠牙本质涎磷蛋自（dentin sialophosphopmtein,DSPP)基因启动子，构建含DSPP启动子不同片段的报告基因载体，在小鼠成牙本质细胞系MDPC-23中分析各种载体中DSPP启动子活性。方法：细胞基因组提取，PCR，瞬时转染和报告基因检测。结果：从MDPC-23细胞基因组中克隆出长为1.5kbp的DSPP启动子，将启动子酶切成不同的片断，克隆到虫工业基础光素酶报告基因载体pC1.3-Enhancer,构建出4种含DSPP启动子不同片段的报告基因载体，将这些报告基因载体瞬时转染至MDPC-23细胞，载体中的启动子具有不同的活性。结论：成功构建了含小鼠DSPP启动子片段的报告基因载体，为以后研究DSPP基因表达调控的分子机制提供了实验工具。     

Smad7在成牙本质细胞系MDPC-23内转化生长因子β信号转导中的作用

目的研究Smad7在成牙本质细胞系MDPC-23内转化生长因子(transforming growth factor-β1, TGF-β)信号转导的作用.方法培养MDPC-23细胞,免疫组化法观察TGF-β1对MDPC-23细胞内Smad7分子定位改变.通过瞬时共转染和报告基因检测方法观察Smad7分子对TGF-β1调控目的基因转录的影响.结果MDPC-23细胞表达Smad7蛋白,主要定位于细胞胞浆,在转化生长因子β1刺激30 min后,Smad7从胞核向胞浆转位聚集.TGF-β1显著诱导p3TP-Lux基础启动子活性.过表达Smad7完全抑制TGF-β1对p3TP-Lux启动子活性的诱导,而过表达Smad7反义cDNA载体则显著促进了TGF-β1对p3TP-Lux启动子活性的诱导.结论在成牙本质细胞系MDPC-23内,Smad7可能作为一种抑制性Smad分子在拮抗TGF-β1信号转导过程中发挥重要的作用.     

MDPC-23细胞内核心结合因子A1增强Smad3调控牙本质涎磷蛋白基因的表达

目的 :研究转录因子核心结合因子A1(CBFA1)在Smad分子调控牙本质涎磷蛋白 (DSPP)基因表达中的作用。方法 :细胞培养 ,基因转染和报告基因检测。结果 :转化生长因子 β1(TGF β1)抑制DSPP基因启动子活性的表达。Smad3过表达显著增强了TGF β1对DSPP基因表达的转录抑制。单独过表达CBFA1对DSPP基因启动子活性无明显影响。但是 ,CBFA1与Smad3共转染显著增强Smad3对DSPP基因启动子的抑制作用 ,在TGF β1存在时 ,其作用进一步增强。结论 :在成牙本质细胞系MDPC 2 3内 ,CBFA1可能作为一种转录因子协同调控Smad3对DSPP基因转录的调控。     

小鼠牙本质涎磷蛋白基因上游启动子的克隆和序列测定

目的　克隆并测定小鼠牙本质涎磷蛋白(DSPP)基因上游启动子的序列。方法　提取成年Balb/c鼠基因 组DNA,设计引物,通过聚合酶链反应(PCR)得到小鼠牙本质涎磷蛋白基因上游启动子的序列。再将目的片段定向 连入T载体,酶切鉴定并测序。结果　将小鼠牙本质涎磷蛋白基因上游启动子序列分3段克隆,分别得到997 bp、 1 004 bp及674 bp大小的目的片段。连入载体后,酶切结果测定重组质粒成功。其测序结果与小鼠基因组染色体 位置5q21处的相应序列99%一致。结论　成功克隆到牙本质涎磷蛋白基因上游启动子的序列,为进一步研究 DSPP基因的转录调控机制奠定了基础。     

Smads蛋白在成牙本质细胞系MDPC-23中的表达及功能

目的研究Smads蛋白在成牙本质细胞系MDPC-23作为转化生长因子(TGF)β信号分子的作用。方法常规条件下培养MDPC-23细胞,在TGF-β1刺激培养1h后,观察细胞内Smad分子的定位变化。将Smads真核表达载体分别与报告基因载体p3TP-Lux瞬时共转染至MDPC-23,在TGF-β1刺激培养24h后,裂解细胞,用双荧光素酶报告基因检测系统检测细胞裂解液中的荧光素酶活性。结果MDPC-23细胞表达Smad2和Smad3蛋白分子,主要定位于细胞质,在TGF-β1刺激1h后,Smad2和Smad3从胞质向胞核转位聚集。TGF-β1可诱导p3TP-Lux基础启动子活性,约增加13倍。过表达野生型Smad3蛋白可促进TGF-β1对p3TP-Lux启动子活性的诱导,但是过表达Smad3突变体抑制TGF-β1对p3TP-Lux启动子活性的诱导。和Smad3作用相比,过表达Smad2野生型或突变型蛋白对TGF-β1诱导p3TP-Lux启动子活性无明显影响。结论在成牙本质细胞系MDPC-23内,Smad信号途径存在并参与介导TGF-β1诱导的转录调控。     

核心结合因子α1对人牙本质基质蛋白1基因转录活性的作用

目的:观察核心结合因子α1(core binding factor α1, Cbfα1)对人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells, HDPSCs)牙本质基质蛋白1(dentin matrix protein 1,DMP1)基因转录活性的影响.方法: 将pCMV-Osf2瞬时转染至体外矿化诱导的HDPSCs中,检测转染后不同时间Cbfα1蛋白的表达变化.将不同长度的DMP1基因启动子片段重组报告基因载体与pCMV-Osf2分别共转染至细胞中,报告基因检测系统检测荧光素酶活性.结果: 诱导后的HDPSCs中少量表达Cbfα1,在瞬时转染Cbfα1后,蛋白主要表达于细胞胞质中,并且在转染48 h后表达量达到最高值;Cbfα1可明显增强6 个不同长度的DMP1基因启动子片段重组报告基因载体的荧光素酶活性,以pGL3-P-505～+86启动子活性增强最为明显(P<0.05).计算机分析结果发现,DMP1基因启动子-505～+86 bp区存在Cbfα1的结合位点.结论: Cbfα1可上调人DMP1基因转录活性,是HDPSCs向成牙本质细胞方向分化重要的调节因子之一,DMP1基因启动子序列-199～-185 bp区可能是Cbfα1结合位点.     

人牙本质基质蛋白1基因启动子在不同细胞中的活性比较和分析

目的观察并比较不同长度的人牙本质基质蛋白1(Dmp1)基因上游启动子片段在人牙髓干细胞(HDPSC)、成骨细胞(OC)和子宫颈癌上皮细胞株Hela中的启动子活性,为进一步研究Dmp1基因在矿化组织中的特异性转录调控特点和作用机制奠定基础。方法以获得正确序列的2 195 bp Dmp1基因上游启动子重组T载体为模板,通过 PCR方法获得不同长度的Dmp1基因上游启动子片段,将其构建至报告基因载体pGL3-Basic中,瞬时转染至HDP- SC、OC和Hela细胞,荧光素酶检测这些细胞中启动子活性并进行分析。结果成功地获得了6段不同长度的Dmp1 启动子目的片段。酶切鉴定表明不同长度启动子报告基因载体构建成功,不同片段的Dmp1启动子在不同细胞中活性不同,在HDPSC和OC中活性较强,而在Hela细胞中活性最低。在-505--193 bp区和-935--505 bp区可能分别存在HDPSC和OC较为特异的转录调控作用区域点,该区可能包含Dmp1表达的基础调控元件。结论成功克隆了不同长度的Dmp1上游启动子的序列,不同启动子片段在牙髓干细胞和成骨细胞等矿化性细胞中活性较强,并初步确定了Dmp1启动子在矿化性细胞中的基本启动子区域,而在非矿化性细胞Hela细胞中活性较低。     

RNA干涉法观察成纤维细胞生长因子18对成牙本质样细胞涎磷蛋白表达的影响

目的：通过RNA干涉的方法研究成纤维细胞生长因子18（Fibroblast Growth Factor18．FGF18）对成牙本质样细胞中牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein，DSPP）表达的影响。方法：RNA干涉质粒pH1-siFGF18瞬时转染成牙本质样细胞MDPC-23，RT-PCR检测FGF18和DSPP的表达，观察FGF18低表达对DSPP表达的影响。结果：瞬时转染RNA干涉质粒后，MDPC-23细胞内FGF18表达明显减少，与此同时DSPP的表达量也明显减少。结论：FGF18可以调控DSPP的表达，影响成牙本质细胞的分化。     

Smad3在转化生长因子β1调控人牙本质基质蛋白1基因表达中的作用

目的：观察Smad3在转化生长因子β1（TGF-β1）调控人牙本质基质蛋白1（DMP1）转录表达中的作用并对DMP1基因启动子上的结合位点进行初步定位。方法：将Smad3瞬时转染至具有矿化活性的人牙髓干细胞（HDPSC）中,观察Smad3蛋白表达和转位情况,并检测在有无TGF-β1的刺激下细胞中pGL3-P-193～＋86和pGL3-P-505～＋86启动子活性的变化。pGL3-P-505～＋86与Smad3共转染至细胞中,10ng/ml TGF-β1刺激2h后,提取细胞核蛋白,EMSA法检测DMP1基因启动子-505～-193bp区存在的Smad3结合位点。结果：HDPSC中瞬时转染Smad3后,其主要表达于细胞胞浆中,随着TGF-β1刺激不同时间后,Smad3在细胞中的表达出现从胞浆到胞核的转位。Smad3可明显加强TGF-β1下调pGL3-P-193～＋86和pGL3-P-505～＋86启动子活性的作用,在DMP1基因启动子-505～-193bp区至少有一个Smad3结合区域为-209～-201bp区的GTCTAGTCA序列。结论：Smad3是TGF-β1信号通路的下游作用分子,可介导TGF-β1下调D...     

c-Jun、c-Fos对人牙本质基质蛋白1基因转录调控作用的研究

目的观察c-Jun和c-Fos对人牙髓干细胞（human dental pulp stem cells,HDPSCs）牙本质基质蛋白1（dentin matrix protein 1,DMP1）基因转录活性的影响。方法将pRSV-c-Jun和pRSV-c-Fos瞬时转染至HDPSCs中,检测转染后不同时间c-Jun、c-Fos蛋白的表达变化。将重组报告基因载体pGL3-P-505～＋86与pRSV-c-Jun、pRSV-c-Fos分别共转染至细胞中,报告基因检测系统检测荧光素酶活性变化。结果瞬时转染c-Jun、c-Fos后,蛋白主要表达于HDPSCs细胞胞浆中,并且在转染48h后表达量均达到最高值;c-Jun和c-Fos能够降低pGL3-P-505～＋86的荧光素酶活性,c-Jun降低DMP1启动子区-505～＋86bp片段的荧光素酶活性更为显著（P〈0.05）。结论 c-Jun和c-Fos可降低人DMP1基因转录活性,是HDPSCs向成牙本质细胞方向分化重要的调节因子,DMP1基因启动子序列-110～-100bp区可能是c-Jun、c-Fos有效作用位点。