全反式维甲酸诱导白血病细胞分化对brd7基因表达的影响

为了探讨brd7基因与白血病细胞分化的关系及其在白血病细胞分化中的作用,本研究采用全反式维甲酸(ATRA)诱导HL-60和K562细胞系分化,通过Wright-Giema染色在显微镜下观察细胞形态学变化,应用流式细胞术分析细胞分化抗原CD11b的表达,以鉴定细胞分化程度,并在此基础上通过Western blot检测brd7基因在诱导分化前和细胞分化过程中蛋白表达水平的变化。结果发现,ATRA具有抑制HL-60细胞生长的作用,并可诱导HL-60细胞向粒系分化,在ATRA诱导细胞分化过程中HL-60细胞表面CD11b的表达水平逐渐上调,BRD7蛋白表达随着HL-60细胞的分化而增加;ATRA对K562细胞无诱导分化作用,brd7的表达也无明显变化。结论:随着HL-60细胞的分化,brd7基因表达上调,其机制有待进一步阐明。     

RNA特异性干扰bcr-abl融合基因联合p27基因克隆对K562细胞的影响

本研究旨在探讨RNA干扰抑制慢性髓系白血病bcr-abl融合基因表达,以及RNAi和p27基因克隆联合作用对K562细胞的细胞增殖、细胞周期及凋亡等的调控作用。以细胞系K562为研究对象,合成并转染针对K562细胞bcr-abl融合基因融合位点的21nt siRNA,应用Northern blot法检测bcr-abl融合基因的表达,Western blot法检测BCR-ABL蛋白及凋亡相关蛋白BCL-xL的表达;同时应用RT-PCR扩增p27基因,构建P27-pcDNA3.1载体,转染p27基因入缺失p27基因的K562细胞,经筛选得到G418抗性的K562细胞株;经Western blot证实有P27蛋白表达后,联合应用RNA干扰及p27基因克隆,通过MTT法及流式细胞仪等检测联合作用后对K562细胞的细胞增殖、细胞周期及凋亡等的调控作用。结果表明,RNA干扰组K562细胞bcr-abl融合基因的表达水平明显下降,转染24小时时有18.4%的K562细胞发生凋亡,细胞凋亡相关蛋白BCL-xL的表达水平下调,出现明显的G1期阻滞;表达外源性P27蛋白的P27-pcDNA3.1-K562细胞株生长速度明显慢于对照K562细胞株。流式细胞仪检测显示,G0/G1期细胞增多,S期细胞明显减少;RNA干扰与p27基因克隆联合作用于K562细胞后,凋亡细胞比例明显上升(33.4%)。MTT法显示,细胞存活率较单纯p27-K562细胞组及RNA干扰-K562细胞组均明显下降(p0.01和p0.05)。结论:特异性siRNA分子可以抑制bcr-abl融合基因的表达,诱导K562细胞分化或凋亡。RNA干扰联合p27基因克隆对抑制K562细胞增殖及促凋亡方面具有协同作用。     

靶向CD74基因RNA干扰慢病毒稳定感染人胰腺癌细胞株的建立与鉴定

目的构建靶向CD74基因的小发夹RNA慢病毒载体,感染胰腺癌Capan-2细胞株,筛选并建立稳定细胞株。方法应用q RT-PCR法检测不同胰腺癌细胞株间CD74的m RNA表达情况;根据Gene Bank提供的CD74 c DNA序列,设计3条靶向CD74的si RNA序列,构建重组干扰质粒p SUPERretro-puro-CD74-si RNA;将重组干扰质粒转染Capan-2细胞,经过q RT-PCR和Western blot法筛选出最佳干扰效果质粒;慢病毒包装质粒并感染Capan-2细胞株,利用嘌呤霉素筛选,建立稳定低表达CD74细胞株;应用q RT-PCR和Western blot法检测CD74基因m RNA和蛋白的表达抑制率。结果 Capan-2细胞株的CD74 m RNA平均ΔCt值为102.9±6.4,在各胰腺癌细胞株中表达水平最高(P<0.05);携带干扰效果最高si RNA的慢病毒感染Capan-2细胞,建立了稳定低表达CD74基因的Capan-2细胞株,CD74基因m RNA抑制率61%,蛋白抑制率90%。结论成功筛选出靶向CD74的sh RNA最佳干扰质粒,构建了CD74-RNAi慢病毒载体,并稳定感染建立了低表达CD74基因的Capan-2细胞株。     

TRAIL分子胞外区基因工程蛋白的制备与鉴定

目的 制备人TRAIL配体胞外区基因工程蛋白。方法 应用RT-PCR技术从激活的人外周血淋巴细胞总RNA中扩增TRAIL配体胞外区cDNA，克隆入PCR^21载体，测序验证后用基因重组法构建了TRAIL配体胞外区和组氨酸盒的原核表达质粒pQE-hTRAIL。将重组质粒转人大肠杆菌M15中表达，经1mmol／L IPTG在37℃条件下诱导4h，亲和层析柱纯化。用SDS—PAGE电泳和Western blot鉴定表达产物。结果 所表达融合蛋白为人TRAIL配体胞外区分子，分子量30kD。表达量约为2mg／ml。结论 人TRAIL配体胞外区在大肠杆菌中得到良好表达，为深入研究TRAIL配体分子在肿瘤与自身免疫病中的可能应用提供了材料。     

Rheb过表达在白血病细胞株HL-60和K562中的作用

mTOR信号通路是细胞内重要的生命活动枢纽,它通过抑制细胞凋亡,促进细胞增殖来调控细胞生命活动。Rheb可以激活mTOR信号通路,进而参与多种肿瘤的发生发展。本研究以髓系白血病细胞株为研究对象,探讨Rheb在HL-60和K562中的作用及相关机制。本研究利用逆转录病毒技术使髓系白血病细胞株HL-60和K562过表达Rheb;利用Western blot和Real-Time PCR分别检测HL-60和K562细胞中Rheb的蛋白表达水平及mRNA表达水平;利用CCK-8法检测细胞活力;利用Annexin V-PE和7-AAD双染检测细胞凋亡。结果表明:成功构建了Rheb过表达的HL-60和K562细胞株,并发现Rheb过表达可以促进细胞生长;进一步研究发现,Rheb过表达加快细胞进入G2/M期(P<0.01),但不影响细胞凋亡。结论:Rheb通过加快细胞周期进程促进HL-60和K562细胞增殖。     

甲异靛对K562和HL-60细胞Wnt信号通路的影响

本研究探讨甲异靛对K562细胞和HL-60细胞Wnt信号通路的影响。采用RT-PCR和Western blot方法分别检测甲异靛处理的K562和HL-60细胞中GSK-3β及其下游相关基因及蛋白的表达水平。结果表明:甲异靛可使HL-60细胞中β-catenin和c-myc基因表达下降,但对K562细胞的这两种基因表达无明显影响;甲异靛略能增加HL-60细胞中GSK-3β蛋白表达,但明显降低K562细胞和HL-60细胞中p-GSK-3β和c-MYC蛋白表达水平;甲异靛对K562细胞中β-catenin表达没有明显影响,但能使HL-60细胞中β-catenin表达下降。结论甲异靛可抑制K562细胞和HL-60细胞中Wnt信号通路的传导,降低癌基因和相关蛋白的表达,从而发挥治疗白血病的作用。     

曲古菌素A诱导急性髓系白血病细胞表达共刺激分子CD80和CD86的研究(英文)

目的:研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古菌素A(TSA)诱导急性髓系白血病细胞表达共刺激分子CD80和CD86。方法:应用流式细胞仪检测TSA诱导急性髓系白血病患者单核细胞、HL-60细胞和K562细胞表达共刺激分子CD80、CD86及细胞活力;应用RT-PCR分析CD80和CD86 mRNA表达情况;在75 Gy照射TSA诱导的HL-60细胞和K562细胞后,应用CCK-8检测共刺激分子表达提高后HL-60细胞和K562细胞对健康人单核细胞的增殖作用。结果:TSA上调HL-60细胞表达CD86,也可上调急性髓系白血病患者单核细胞表达CD86,但TSA不能上调K562细胞表达CD86,TSA诱导HL-60细胞和K562细胞后,提高表达CD86的HL-60细胞对健康人单核细胞有增殖作用,而K562细胞无此作用。结论:TSA诱导HL-60细胞和急性髓系白血病患者单核细胞表达共刺激分子CD86,促进健康人单核细胞的增殖作用。     

bcl-2小干扰RNA对HL-60/VCR细胞耐药性逆转的研究

为了探讨以bcl-2基因作为靶分子进行白血病多药耐药基因治疗的可行性,构建bcl-2基因的小干扰RNA载体并将其转导入HL-60/VCR细胞,在G418筛选后应用Western blot进行鉴定;MTT法检测细胞转染前后生长速度和药物敏感性的变化;Western blot检测细胞转染前后凋亡相关蛋白Bax和耐药相关蛋白ZNRD1的表达变化.结果表明：成功构建了bcl-2的小干扰RNA载体并转染HL-60/VCR;经蛋白质水平检测证实成功建立了bcl-2低表达的白血病细胞模型;转染后的细胞对长春新碱和阿霉素的敏感性增强,且低表达耐药相关蛋白ZNRD1.结论：bcl-2小干扰RNA真核表达载体能在一定程度上逆转白血病细胞的耐药性.     

敲除BMAL1基因促进HL-60细胞凋亡并抑制增殖

目的:运用CRISPR/Cas9技术敲除节律基因BMAL1的HL-60细胞系,探讨BMAL1分子在人急性髓系白血病中的生物学功能。方法:针对BMAL1基因设计2条sg RNA,构建含有sg RNA的PX459敲除载体;应用T7核酸内切酶I检测设计的sg RNA活性;应用打靶载体瞬时转染HL-60细胞构建BMAL1敲除细胞系,应用Western blot检测BMAL1蛋白的表达,应用流式细胞仪检测敲除细胞系的凋亡水平,应用CCK-8试剂盒检测敲除细胞系的增殖能力。结果:成功构建了针对BMAL1的PX459-sg RNA载体;并筛选得到了活性较高的打靶载体。Western blot实验在敲除细胞中未检测到BMAL1蛋白的表达。进一步实验发现,BMAL1敲除的HL-60细胞凋亡水平明显升高,细胞增殖能力明显减弱。结论:利用CRISPR/Cas9技术成功构建了BMAL1基因敲除的HL-60细胞系,并发现BMAL1敲除可以促进HL-60细胞的凋亡,抑制肿瘤细胞的增殖,初步揭示了BMAL1生物节律基因在急性髓系白血病中的生物学作用。     

葡萄糖神经酰胺合酶与白血病细胞耐药的关系

本研究旨在观察葡萄糖神经酰胺合酶（glucosylceramide synthase，GCS）基因及其蛋白在人白血病细胞的表达及其与肿瘤多药耐药的关系。首先以β—actin基因为内参照物，采用RT—PCR方法分析了53例耐药／非耐药白血病患者外周血标本，并对药物敏感的HL-60细胞株和对阿霉素耐药的HL-60／ADR细胞株中GCS基因的表达水平进行检测，同时与多药耐药基因（mdr1）的表达进行比较。继而采用Western blot法分析HL-60细胞株及HL-60／ADR细胞株中GCS蛋白及P-gP蛋白的表达情况。结果表明：白血病患者耐药组临床标本中的GCS基因扩增条带光密度相对比值明显高于非耐药组（P〈0．05），且GCS基因扩增条带光密度值显著增强时往往伴有mdr1基因的高表达，两者呈正相关（P〈0．01、r=0．6）。HL-60／ADR细胞株GCSmRNA及蛋白均过度表达，且明显高于HL-60细胞株，与此同时，HL-60／ADR细胞株的mdr1mRNA和P-gP的表达亦显著增高。结论：GCS可能在白血病多药耐药中起着重要作用。     

CD44及CD44v6在胚胎各器官中的表达及意义

目的通过免疫组化染色观察CD44和CD44v6在胚胎各脏器中的表达,了解这两种表面标志物在不同器官中的表达情况。方法用免疫组化PV-9000二步法（非生物素）检测CD44和CD44v6在6例胚胎各器官的表达情况。CD44用已知阳性的淋巴结作阳性对照;CD44v6用已知阳性的扁桃体作阳性对照。两者均用PBS代替一抗作阴性对照。结果 CD44主要表达于间叶组织中,如食管、胃及肠管的深肌层,心脏中的部分小血管、神经束以及各器官中的纤维组织,肝和脾内的造血细胞也有表达,但不表达于骨、肾、睾丸、心肌和肝细胞。另外,在少数上皮组织中也见有表达,如食管黏膜和气管黏膜上皮的基底层细胞及气管腺上皮。CD44v6的表达仅见于食管上皮基底层细胞中,其它各器官均未见表达。结论通过免疫组化法观察CD44和CD44v6在胚胎发育过程中的表达情况,为成体干细胞特性的研究提供了良好直观的依据和有用的线索。     

食管癌细胞P-糖蛋白与CD44表达的相关性研究

目的了解食管癌细胞P -糖蛋白 (P-gp)表达与粘附分子 (CD44)表达水平的相关性及其临床意义。方法用流式细胞术 (FCM)检测了70例食管癌手术标本中癌细胞和食管切缘正常黏膜细胞P - gp和CD44表达水平 ,并进行临床病理分析。结果70例食管癌标本P -gp表达阳性细胞<25 %有27例 (38.6% ) ,在25%～40%有11例 (15.7 % ) ,在41 %～60 %有14例 (20 % ) ,>60 %有18例 (25.7% )。肿瘤直径>4cm食管癌中 ,25例P - gp 阳性组与19例P - gp 阴性组的CD44表达比较 ,差异有显著性意义 (P<0.05) ,高 -中分化食管癌患者中 ,22例P -gp阳性组与17例P-gp阴性组的CD44表达比较 ,差异有显著性意义 (P<0.05) ,有淋巴结转移的食管癌患者中 ,27例P - gp 阳性组与11例P - gp阴性组的CD44表达比较 ,差异有显著性意义(P<0.05)。P -gp和CD44表达双阳性组 ,临床III-IV期比例明显高于非双阳性组 ,差异有显著性意义 (P<0.05)。结论食管癌细胞P - gp阳性和CD44高表达与食管癌进展和转移密切相关 ,双阳性病人预后可能较差。     

CD24与CD44v6在宫颈癌中的表达及意义

目的研究宫颈癌中CD24和CD44v6的表达及意义,探讨宫颈癌的发病机制及检测和治疗的新途径。方法采用免疫组化Elevision法检测正常宫颈、宫颈上皮内瘤变和宫颈癌中CD24和CD44v6的表达情况。结果 CD24在正常宫颈、宫颈上皮内瘤变、宫颈癌组织中的阳性表达率分别为0.00%、45.00%和87.50%,三者差别有统计学意义（P〈0.05）。CD24与宫颈癌的病理分级、临床分期及淋巴结转移均不相关（P〉0.05）。CD44v6在正常宫颈、宫颈上皮内瘤变、宫颈癌组织中的阳性表达率分别为0.00%、35.00%和76.25%,三者差别有统计学意义（P〈0.05）。CD44v6与宫颈癌的病理分级、淋巴结转移相关,与临床分期不相关（P〉0.05）。CD24与CD44v6在宫颈癌中无相关性（P〉0.05）。结论 CD24、CD44v6与宫颈癌的发生、发展密切相关。CD44v6与宫颈癌的病理分级、淋巴结转移的相关性,提示其可能在宫颈癌的进展及转移方面起着一定的作用。     

CD24与CD44v6在宫颈癌中的表达及意义

目的研究宫颈癌中CD24和CD44v6的表达及意义,探讨宫颈癌的发病机制及检测和治疗的新途径。方法采用免疫组化Elevision法检测正常宫颈、宫颈上皮内瘤变和宫颈癌中CD24和CD44v6的表达情况。结果 CD24在正常宫颈、宫颈上皮内瘤变、宫颈癌组织中的阳性表达率分别为0.00%、45.00%和87.50%,三者差别有统计学意义(P<0.05)。CD24与宫颈癌的病理分级、临床分期及淋巴结转移均不相关(P>0.05)。CD44v6在正常宫颈、宫颈上皮内瘤变、宫颈癌组织中的阳性表达率分别为0.00%、35.00%和76.25%,三者差别有统计学意义(P<0.05)。CD44v6与宫颈癌的病理分级、淋巴结转移相关,与临床分期不相关(P>0.05)。CD24与CD44v6在宫颈癌中无相关性(P>0.05)。结论 CD24、CD44v6与宫颈癌的发生、发展密切相关。CD44v6与宫颈癌的病理分级、淋巴结转移的相关性,提示其可能在宫颈癌的进展及转移方面起着一定的作用。     

癌前食管与食管鳞状细胞癌表达CD44及CD44v6的差异

目的通过免疫组化研究CD44及CD44v6在癌前食管及食管鳞状细胞癌中的表达情况,探讨其与食管鳞状细胞癌的关系及临床意义。方法收集潮州市中心医院病理科存档的食管病例蜡块（所有病例术前均未接受放、化疗）。采用免疫组化PV-9000二步法（非生物素）检测癌前食管63例,食管鳞状细胞癌140例。SPSSl6．0统计软件分析实验结果。对于各组之间表达情况的数据统计采用多独立样本非参数检验：Kruskal．WallisH检验;各组中两两比较采用两独立样本非参数检验：Kruskal—WallisH检验的方法进行比较。结果CD44及CD44v6在正常的鳞状上皮,只表达于上皮基底层3～5层细胞,随着上皮的增生,表达的细胞层数逐渐增加,在非典型增生的上皮则主要表达于有异型的上皮,而原位癌则几乎表达于上皮的全层。CD44及CD44v6在各种食管癌前病变组织与食管鳞状细胞癌中的表达均存在差异（均P〈0．01）,其中从正常食管组织及伴上皮增生但无细胞异型的食管组织至食管鳞状细胞癌之间,其表达强度逐渐增强,而从非典型增生及原位癌至食管鳞状细胞癌之间的表达强度逐渐减弱。结论CD44及CD44v6在癌前食管及食管鳞状细胞癌中的表达差异,提示它们可能与食管鳞状细胞癌的发生及发展有关,为食管癌干细胞的进一步研究提供线索。     

CD44 in cancer

CD44 is a multistructural and multifunctional cell surface molecule involved in cell proliferation, cell differentiation, cell migration, angiogenesis, presentation of cytokines, chemokines, and growth factors to the corresponding receptors, and docking of proteases at the cell membrane, as well as in signaling for cell survival. All these biological properties are essential to the physiological activities of normal cells, but they are also associated with the pathologic activities of cancer cells. Experiments in animals have shown that targeting of CD44 by antibodies, antisense,and CD44-soluble proteins markedly reduces the malignant activities of various neoplasms, stressing the therapeutic potential of anti-CD44 agents. Furthermore, because alternative splicing and posttranslational modifications generate many different CD44 sequences, including, perhaps, tumor-specific sequences, the production of anti-CD44 tumor-specific agents may be a realistic therapeutic approach. However, in many cancers (renal cancer and non-Hodgkin's lymphomas are exceptions), a high level of CD44 expression is not always associated with an unfavorable outcome. On the contrary, in some neoplams CD44 upregulation is associated with a favorable outcome. Even worse, in many cases different research grows analyzing the same neoplastic disease reached contradictory conclusions regarding the correlation between CD44 expression and disease prognosis, possibly due to differences in methodology. These problems must be resolved before applying anti-CD44 therapy to human cancers.     

CD44及CD44v6在不同分化程度食管癌中的表达水平

目的通过免疫组化研究CD44及其变异体CD44v6在食管癌中的表达情况,探讨其与食管癌的关系及临床意义。方法收集潮州市中心医院病理科存档的食管癌蜡块（所有病例术前均未接受过放、化疗）。采用免疫组化PV-9000二步法（非生物素）检测食管癌中CD44的表达共145例,CD44v6共146例。SPSSl6．0统计软件分析实验结果。对于各组之间表达情况的数据统计采用多独立样本非参数检验：Kruskal．WallisH检验;各组中两两比较采用两独立样本非参数检验：Kruskal．WaUisH检验的方法进行比较。结果CD44及CD44v6在5例小细胞癌中均不表达O％,在鳞状细胞癌中的阳性表达率分别为90．71％（127／140）和82．27％（116／141）。其中高分化鳞状细胞癌组分别为100％（10／10）及88．89％（8／9）,中分化组分别为98．21％（55／56）及94．74％（54／57）,而低分化组则分别为83．78％（62／74）及72％（54／75）。CD44及CD44v6在鳞状细胞癌与小细胞癌之间的表达情况均有显著差异（均P〈0．01）,在高分化组与中分化组间的表达差别无统计学意义（P〉0．05）,高分化组与低分化组及中分化组与低分化组间差别均有统计学意义（均P〈0．05）,分化越好,CD44及CD44v6的表达越强。结论CD44及CD44v6在食管癌中的表达与肿瘤的组织学分型及鳞状细胞癌的分化程度有关,提示它们可以作为食管癌组织学分型的一个辅助标记物及预后预测因子之一。另外,鉴于CD44及CD44v6在食管癌中的高表达率,提示其可能为食管癌干细胞的标志物。     

CD44和EPCR mRNA在乳腺癌组织中的表达及其临床意义

目的探讨肿瘤干细胞标记物CD44和EPCR在乳腺癌组织中的相关性及其与乳腺癌临床病理特征的关系。 方法选取2015年1月至4月在北京大学深圳医院行乳腺癌切除术的46例女性患者,用实时荧光定量RT-PCR（qRT-PCR）检测非特殊型浸润性乳腺癌及其配对癌旁正常乳腺组织中CD44及EPCR的mRNA表达水平,分析其与临床病理特征的关系,并探讨两者的相关性。 结果（1）荧光定量RT-PCR结果显示CD44 mRNA在乳腺癌组织中的表达明显高于癌旁正常乳腺组织,差异具有统计学意义（t=2.486,P=0.017）,在ER阳性乳腺癌明显低于ER阴性组、在正常乳腺样型的三阴型乳腺癌明显高于非正常乳腺样型的三阴型组,差异具有统计学意义（t=-2.332,P=0.024;t=-4.209,P<0.01）,但与患者年龄、肿瘤大小、组织学分级、淋巴结转移及临床分期无关（P>0.05）;（2）EPCR mRNA在乳腺癌组织中的表达明显高于癌旁正常乳腺组织,差异具有统计学意义（t=4.028,P<0.01）,与乳腺癌的肿瘤大小（t=2.998,P<0.01）、组织学分级（t=4.082,P<0.01）、淋巴结转移（t=2.152,P=0.037）、临床分期（t=-2.378,P=0.022）、ER（t=-5.585,P<0.01）,PR（t=-3.896,P<0.01）及增殖指数Ki67（t=2.197,P=0.033）相关,差异具有统计学意义。但与患者的年龄及HER2无关（P>0.05）,在三阴型（尤其是基底样型）乳腺癌及Luminal B型乳腺癌中的相对表达水平也明显高于非三阴型组及非Luminal B型组,差异具有统计学意义（t=9.163,P<0.01;t=3.653,P=0.003）;（3）在乳腺癌中,CD44及EPCR mRNA的表达呈显著正相关（r_s=0.540,P<0.01）。 结论乳腺癌干细胞标志物CD44及EPCR在乳腺癌组织中均明显表达上调,2者具有正相关,但EPCR与更多的临床病理特征相关,提示EPCR可更好地预测乳腺癌的淋巴结转移及较高临床分期等不良预后,并推测CD44及EPCR可能所标记为2种不同表型的乳腺癌干细胞。     

E—cad、CD44v6在肺癌中的表达及意义

目的研究E-cad、CD44v6在肺癌中的表达,探讨其与肺癌临床病理特征、淋巴结转移的关系.方法利用免疫组化S-P法检测65例肺癌、13例支气管黏膜不典型增生和8例正常肺组织的E-cad、CD44v6蛋白表达.结果肺癌组织的E-cad阳性率(46.2%)显著低于支气管黏膜不典型增生(84.5%)和正常肺组织(100%)(P＜0.05,P＜0.01);肺癌阳性率与淋巴结转移、临床分期呈负相关(P＜0.01,P＜0.05).在肺癌的阳性率(83.1%)显著高于不典型增生(38.5%)和正常肺组织(25%)(P＜0.01);CD44v6阳性表达与肺癌淋巴结转移、临床分期、病理分级呈正相关(P＜0.05).肺癌组织的E-cad阴性与CD44v6阳性表达有显著的相关性(P＜0.01).结论肺癌组织中的E-cad失表达、CD44v6高表达与肺癌的发生发展、淋巴结转移及预后有一定关系.