纳洛酮对离体人脑神经元缺氧损伤谷氨酸释放的影响

目的建立原代培养人脑神经元缺氧模型,探讨纳洛酮对神经元缺氧损伤中谷氨酸释放的影响.方法应用无血清原代培养人胚胎大脑神经细胞,经神经微丝染色证实可获得富含神经元的混合培养细胞.将神经元细胞随机分为对照组、缺氧组和给药组(纳洛酮终浓度分别为0.25、5、10 μg/ml).对照组为正常培养,缺氧组和给药组细胞进行缺氧结合无糖处理(氧糖剥夺)l h并继续复氧培养24h.于复氧24 h后观察细胞形态学变化,测定细胞外液乳酸脱氢酶(LDH)浓度,应用四甲基偶氮唑蓝法(MTT)观察细胞存活率,应用高效液相色谱法测定细胞外液谷氨酸浓度.结果缺氧组细胞外液LDH、谷氨酸浓度显著高于对照组(P＜0.01),MTT法测得光密度(OD)值则显著低于对照组(P＜0.01);应用纳洛酮后,随药物浓度增加,各组细胞外液谷氨酸浓度与缺氧组比较呈现逐渐降低趋势(P＜0.05,P＜0.01),MTT法测得OD值呈现逐渐升高趋势(P＜0.01),至纳洛酮10μg/ml时恢复至对照组水平(P＞0.05).结论纳洛酮可以减少缺氧神经元的谷氨酸释放,减轻兴奋性神经毒性,对神经元缺氧损伤具有保护作用.     

纳洛酮对大鼠神经元细胞的保护作用

纳络酮应用研究对脓毒血症(sepsis)器官保护作用少有涉及。临床中常见纳络酮对多脏器功能障碍患者的中枢神经系统功能有保护作用，机理尚不清楚。该研究建立了脂多糖对神经元细胞毒性的实验模型，观察纳洛酮对神经元细胞损害的保护作用。虽为实验研究，选题源于临床，对纳络酮应用于神经细胞保护有一定的指导意义。     

纳洛酮对离体人脑神经元缺氧损伤干细胞因子和受体表达的影响

目的 通过检测神经元细胞内干细胞因子(SCF)及其受体c-kit(c-kitR)mRNA表达量的变化探讨纳洛酮对人胚胎大脑神经元缺氧损伤的影响.方法 应用无血清方法原代培养人胚胎大脑神经元,于第10天对神经元进行缺氧结合无糖处理.将24孔培养板细胞随机分为4组:对照组(按照正常培养条件同期培养)、单纯缺氧组(缺氧无糖处理0.5h)、纳洛酮0.5组(纳洛酮0.5μg/ml+缺氧无糖处理0.5 h)、纳洛酮10组(纳洛酮10μg/ml+缺氧无糖处理0.5 h).分别于复氧24 h后测定细胞外液乳酸脱氢酶(LDH)浓度,并应用四甲基偶氮唑盐法(MTT)测定细胞存活情况.将25 ml培养瓶按上述方法分组,分别于缺氧前、缺氧后即刻、复氧3、6、12和24 h提取细胞内总RNA,应用逆转录聚合酶链反应扩增后,检测SCF和c-kitR mRNA表达量的变化.结果 单纯缺氧组细胞MTT值显著低于对照组(P<0.01),纳洛酮0.5组MTT值显著低于对照组,与单纯缺氧组比较差异无显著性,络洛酮10组MTT升高至对照组水平(P>0.05);单纯缺氧组细胞外液LDH浓度显著高于对照组(P<0.05),纳洛酮0.5组与对照组和单纯缺氧组比较差异均无显著性(P>0.05),络洛酮10组细胞外液LDH浓度降至对照组水平(P>0.05);缺氧后即刻,可见SCF/c-kitR mRNA表达量显著升高(P<0.01),其中SCF表达量在24 h内呈双峰分布;给予不同浓度纳洛酮后,随药物浓度的增加,各组表达量峰值降低,并且延迟出现,与对照组比较差异具有显著性(P<0.01).结论 SCF/c-kitR mRNA 在神经元缺氧后早期即表达增高.纳洛酮可以减轻细胞损伤,并可调节SCF/c-kitR的表达.纳洛酮对细胞损伤的保护作用可能涉及对某些细胞因子表达的调控.     

白藜芦醇对缺氧诱导神经元凋亡的影响

目的:探讨白藜芦醇(resveratrol,RES)对缺氧(hypoxia)诱导神经元凋亡的影响。方法:原代培养小鼠皮层神经元,置于2%O2,5%CO2和93%N2,37℃培养箱中培养12 h建立缺氧模型,采用DCFH-DA和显微荧光成像系统检测神经元活性氧(Reactive oxygen species,ROS)含量;碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)和Hoechst 33342染色检测神经元凋亡。结果:RES预处理60 min后再缺氧12 h,ROS含量和神经元凋亡率均显著低于缺氧组(P<0.01,N=3),且使用1 mM活性氧清除剂(N-acetyl-L-cysteine,NAC)也降低缺氧诱导的神经元凋亡率(P<0.01,N=6)。结论:RES抑制缺氧诱导皮层神经元凋亡,此作用可能与RES抑制缺氧所致神经元ROS增多有关。     

培养不同时间大鼠皮质在缺糖缺氧损伤中神经元凋亡的观察

目的 观察培养不同时间的大鼠脑皮质神经元对缺糖缺氧的敏感程度,探讨培养时间在皮质神经元损伤中的作用.方法 首先分离孕18天胎鼠的皮质神经元,分为对照组和实验组.实验组于培养6天、8天、12天时分别进行缺糖缺氧(OGD)2h,然后培养24h;采用DAPI染色,荧光显微镜下观察细胞的形态变化.对照组除不进行OGD的损伤外,其他条件与实验组一致.结果 培养12天较培养8天的皮质神经元细胞凋亡率增高,差异有统计学意义(P＜0.05);培养6天的皮质神经元的细胞凋亡率与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 不同培养时间的皮质神经元对OGD损伤反应不同;未成熟的皮质神经元对OGD不敏感,具有耐受性;成熟的皮质神经元随成熟程度的增加,对OGD敏感性增强.     

SYK调控缺氧/缺糖损伤诱导的大脑皮质神经元凋亡及其机制

目的 探讨抑制脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase,SYK)对缺氧/缺糖损伤诱导的大脑皮质神经元的凋亡的影响及相关机制.方法 分离培养10只SD怀孕大鼠(190 ～230 g,胎龄16d)胎鼠的大脑皮质神经元细胞并用MAP2免疫荧光法进行鉴定.建立缺氧/缺糖损伤的体外模型,caspase-3荧光检测试剂盒检测caspase-3活性,Annexin-V FITC/PI法检测细胞凋亡,qRT-PCR检测SYK和凋亡相关的原癌基因Fra-1 mRNA的表达,Western Blot检测SYK、Bcl-2和Fra-1蛋白的表达.Control组:无转染处理的缺氧/缺糖损伤的神经元;SYK siRNA组:转染SYK siRNA的缺氧/缺糖损伤的神经元;SYK-Fra-1 siRNA组:同时转染SYK siRNA和Fra-1 siRNA的缺氧/缺糖损伤的神经元;non-specific siRNA组:转染non-specific siRNA的氧/缺糖损伤的神经元.结果 MAP2免疫荧光鉴定为神经元细胞.缺氧/缺糖损伤诱导神经元SYK表达(P＜0.01),RNA干扰抑制SYK表达后caspase-3活性(P＜0.05)和细胞凋亡(P＜0.01)均显著降低,但是Fra-1 mRNA (P ＜0.01)和蛋白(P＜0.05)表达量明显上升.用RNA干扰技术同时抑制SYK和Fra-1后,caspase-3活性(P＜0.01)显著上升但Bcl-2蛋白表达(P＜0.01)显著降低.结论 Fra-1介导了SYK对缺氧/缺糖损伤诱导的神经元凋亡的调节,为脑卒中所致的神经元缺血性损伤的治疗提供了新的靶点.     

小鼠皮层神经元缺氧损伤的模型制备及其实验观察

目的 :建立皮层神经元缺氧损伤的模型 ,为抗缺氧研究提供可靠的实验方法。方法 :采用形态学观察和 MTT比色分析比较了不同密度、不同缺氧时间对培养神经元形态及活性的影响 ;同时观察了银杏内酯、人参皂甙预处理对神经元缺氧损伤的保护作用。结果 :( 1)在进行原代皮层神经元培养时 ,细胞接种的密度以 1.6× 10 6～ 2 .0× 10 6个细胞 /ml为好。( 2 )随着缺氧时间延长 ,神经元活性降低 ,细胞死亡率增加。 ( 3 )银杏内酯和人参皂甙预处理均能使缺氧 8h的神经元比单纯缺氧对照组活性明显升高。结论 :实验结果稳定 ,重复性好 ,是离体抗缺氧研究的一种较理想的实验方法     

枸杞多糖对神经元缺氧损伤的保护作用

【目的】观察枸杞多糖对神经元缺氧损伤的保护作用。【方法】建立原代培养神经元缺氧损伤模型,通过形态学观察以及细胞存活率、乳酸脱氢酶（LDH）释放量、细胞内SOD活性及MDA含量的测定,研究枸杞多糖对神经元缺氧损伤的保护作用。【结果】枸杞多糖能明显改善缺氧损伤神经元的形态改变,提高细胞存活率,减少细胞内LDH的漏出,并可显著提高细胞内SOD活性,减少脂质过氧化产物MDA的产生。【结论】枸杞多糖对神经元缺氧损伤具有明显的保护作用。     

磷酸酶PTEN在新生大鼠缺氧缺血性脑损伤神经元凋亡中的作用

目的 观察新生大鼠缺氧缺血性脑损伤 （hypoxic-ischemic brain damage, HIBD)时,大脑皮层第10号染色体上磷酸酶及张力蛋白同源缺失的基因（PTEN）蛋白、磷酸化（p）-PTEN蛋白、促凋亡蛋白Bim mRNA及蛋白表达变化,探讨抑制PTEN活性对新生大鼠缺氧缺血（HI）神经元凋亡的保护作用机制。 方法 将128只10日龄SD大鼠随机分为4组:缺氧缺血组、假手术组、PTEN脂质磷酸酶抑制剂双过氧化钒 (bisperoxovanadium, bpv)干预组和生理盐水溶剂组。缺氧缺血组在乙醚麻醉下行右侧颈总动脉结扎,氮氧混合气 （92% N2、8% O2）中缺氧2.5 h;假手术组不结扎颈总动脉,不作缺氧处理。bpv干预组和溶剂对照组予腹腔内注射bpv和生理盐水,30 min后做缺氧缺血处理。各组分别于建模后0.5 h及24 h处死动物取大脑皮层,应用Western blot检测PTEN、p-PTEN及Bim的蛋白含量。实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）定量检测Bim mRNA表达水平,应用TUNEL染色法检测凋亡细胞。 结果 缺氧缺血组于HI后0.5 h 及24 h,PTEN蛋白无明显变化,p-PTEN蛋白表达降低。HI后0.5 h,Bim mRNA及蛋白表达增加,与假手术组比较差异有统计学意义 (P<0.05),HI后24 h,Bim mRNA及蛋白恢复至基线水平。bpv干预组PTEN蛋白无明显变化,p-PTEN蛋白表达增加,Bim mRNA及蛋白表达降低,与生理盐水组和缺氧缺血组相比,差异有统计学意义 (P<0.05)。bpv干预组于HI后24 h,TUNEL染色阳性细胞数较生理盐水组和缺氧缺血组减少,凋亡指数降低,差异有统计学意义 (P<0.05)。结论 新生大鼠缺氧缺血性脑损伤时,PTEN发生去磷酸化,活性增高,抑制PTEN活性可下调前凋亡蛋白Bim mRNA及蛋白表达,减少神经细胞凋亡。     

纳络酮和CPP对大鼠急性脊髓损伤的保护作用

目的：评价阿片受体拮抗剂纳络酮（ＮＬＸ）和兴奋性氨基酸受体拮抗剂３－（２－羧基哌嗪－４－基）丙基－１－磷酸（ＣＰＰ）在脊髓损伤后的治疗效果。方法：以７．５ｇ重物从１０ｃｍ高处落下致伤大鼠Ｔ１０脊髓，伤后６０ｍｉｎ开始治疗，从鞘内给予ＮＬＸ１０ｍｇ／ｋｇ、ＣＰＰ１００ｍｇ／ｋｇ、甲基强的松龙（ＭＰ）３０ｍｇ／ｋｇ。结果：ＮＬＸ、ＣＰＰ、ＭＰ均显著促进了脊髓损伤后的神经功能恢复，减少组织损害，ＮＬＸ、ＣＰＰ和ＭＰ之间无显著差别，但较三者合用的效果为差。结论：脊髓损伤后的继发性损伤是多水平、多因素的综合作用，ＮＬＸ、ＣＰＰ与ＭＰ联合应用治疗急性脊髓损伤较之单一用药更有效。     

纳络酮对脑创伤致急性肺损伤中对内皮素的影响

目的　研究纳络酮治疗脑创伤致急性肺损伤大鼠中对内皮素的影响 .方法　成年 Wistar大鼠随机分为对照组 (n= 10 )、脑创伤组 (n=4 0 )和纳络酮治疗组 (n=10 ) .采用Feeney脑创伤模型 ,观察脑创伤后大鼠不同时间点肺组织的病理改变 ,放免法测定血浆和肺组织 ET- 1含量变化及应用纳络酮对其的影响 .结果　脑创伤大鼠出现程度不同的急性肺损伤的病理改变 ,尤以伤后 6 h为重 .血浆和肺组织 ET- 1含量明显增高 (2 0 1.7± 6 3.7vs 2 1.8± 1.9,P<0 .0 1;190 .2± 6 5 .6 vs 17.5± 0 .8,P<0 .0 1) ,伤后 6 h达峰值 ,72 h仍持续性升高 .治疗组肺组织病理改变明显减轻 ,血浆和肺组织ET- 1尽管于伤后 72 h仍高于对照组 (30 .4± 3.1vs2 1.8±1.9,P<0 .0 1;2 5 .6± 1.8vs17.5± 0 .8,P<0 .0 1) ,但明显低于创伤组 (30 .4± 3.1vs 96 .4± 18.8,P<0 .0 1;2 5 .6± 1.8vs 6 0 .4± 19.0 ,P<0 .0 1) .结论　脑创伤可致程度不同的急性肺损伤 ,ET- 1可能在其发病过程中起重要作用 ,纳络酮对急性肺损伤有一定的治疗作用 .     

大鼠创伤性脑损伤后Numbl的表达变化

目的：观察大鼠创伤性脑损伤后Numbl的表达变化及其与脑损伤的关系。方法：构建大鼠创伤性脑损伤模型,收集蛋白并做冰冻切片,采用Western Blot及免疫组化分析Numbl的表达变化及分布,免疫荧光双标分析Numbl的细胞定位。结果：大鼠创伤性脑损伤后Numbl的表达降低,其主要分布在损伤区域的皮质中,免疫荧光显示Numbl主要定位于皮质的神经元中。结论：Numbl在大鼠创伤性脑损伤后表达减少,其主要定位于损伤区域的神经元中,有可能参与损伤诱导的神经元的凋亡及再生。     

中等剂量纳洛酮治疗急性中、重型颅脑损伤的随机双盲临床试验研究

目的 :观察中等剂量纳洛酮治疗急性中、重型颅脑损伤的疗效和安全性。方法 :按照随机双盲前瞻性的临床试验计划 ,完成本临床试验计划要求的有效病例共 4 0例 ,其中纳洛酮组 2 0例 ,安慰剂组 2 0例。比较纳洛酮和生理盐水安慰剂的疗效差异。受试患者均接受为期 10d的随机分组治疗和至少 1个月的随访。分析对比患者治疗前后的病情和一些重要辅助检查指标的变化趋势 ,并记录随访 1个月结束时患者神经功能恢复情况和生活质量状况 ,全部试验结束后进行揭盲并对结果进行统计学分析。结果 :纳洛酮组患者GCS评分 (伤后第 10d)和血压、心律和呼吸异常改善率明显优于安慰剂组 ;纳洛酮组死亡率为 0 % ,安慰剂组为 5 %。随访第 1个月结束时 ,纳洛酮组的GOS评分和语言功能评分均明显优于安慰剂组。试验过程中发现 1例表现出一般药物难以控制的躁动 ,可能与纳洛酮的应用有关。结论 :急性颅脑损伤患者伤后早期 ,应用中等剂量纳洛酮可以明显改善颅脑损伤后的血压心律呼吸异常 ,降低颅脑损伤的死亡率 ,并有助于早期意识恢复和康复期的神经功能恢复。中等剂量的静脉滴注纳洛酮比较安全     

西比灵对神经元损伤的保护作用

目的：探讨西比灵对神经元损伤的保护作用机制。 方法：采用H2O2建立离体培养大鼠皮层神经细胞损伤模型,利用八木法(TBA法)测定丙二醛（MDA）、二苯胺法测DNA断裂率,同时观察乳酸脱氢酶（LDH）泄漏率的变化、西比灵对上述指标的影响及其在体外与自由基的相互作用。 结果：与H2O2损伤组比较,西比灵可明显降低H2O2对神经元的过氧化损伤作用,LDH泄漏率、DNA断裂率明显降低(P<0.01,P<0.05),MDA含量明显下降(P<0.01),而且随着西比灵浓度的提高羟自由基清除率明显升高。 结论：西比灵不但可防止Ca²⁺过量跨膜进入细胞内,而且对神经元过氧化损伤具有明显保护作用。     

脑电双频指数评价2种剂量纳洛酮在重度颅脑损伤患者中的治疗价值

目的:观察2种不同剂量纳洛酮对重度颅脑损伤患者的脑电双频指数（BIS）的影响,探讨2种不同剂量纳洛酮的临床疗效,以及用BIS评估重度颅脑损伤预后的可行性。方法:收集55例成人重度颅脑损伤患者,按照入院先后时间顺序随机分为对照组（18例）,小剂量纳洛酮组（A组,18例）和大剂量纳洛酮组（B组,19例）,对照组给予常规治疗,在常规治疗基础上,A组给予纳洛酮0.1 mg·kg-1·d-1,B组给予纳洛酮0.4 mg·kg-1·d-1,治疗14 d,3组在此期间持续监测记录BIS值;在治疗1个月末对患者进行格拉斯哥预后评分（GOS）。结果:3组患者入院第1天的BIS值差异无统计学意义（P>0.05）,A组和B组患者入院治疗第14天时BIS值均较入院第1天显著升高（P<0.01）。B组患者入院第14天BIS值升高程度均明显高于对照组和A组（P<0.01）。A组和B组治疗1个月末GOS评分均高于对照组（P<0.01）,且B组患者治疗1个月末GOS评分明显高于A组（P<0.01）。3组患者入院第14天BIS值与GOS评分呈明显正相关关系（P<0.01）。3组患者治疗1个月末的病死率差异无统计学意义（P>0.05）。结论:早期大剂量纳洛酮可保护重度颅脑损伤患者的神经功能,但不能降低病死率,BIS对脑损伤程度及预后评估效果良好。     

早期大剂量纳洛酮对弥漫性轴索损伤患者β淀粉样前体蛋白的影响

目的观察早期大剂量纳洛酮对弥漫性轴索损伤(DAI)患者血浆β淀粉样前体蛋白(β-APP)的影响。方法经头颅CT及MRI检查诊断为DAI的56例患者纳入本研究。将患者随机分为对照组、小剂量治疗组及大剂量治疗组,分别为18、19、19例。对照组给予常规治疗,小剂量、大剂量治疗组在常规治疗基础上,分别按0.1、0.4mg.kg-1.d-1的剂量给予纳洛酮治疗。采用Western blot检测3组患者治疗前后血浆β-APP浓度。结果治疗后1、3、7d,3组患者血清中β-APP含量较治疗前均有统计学意义(F=0.131,P=0.010)。治疗后1d,3组患者血清中β-APP含量间差异均无统计学意义(F=0.570,P=0.612);治疗后3、7d,3组患者血清中β-APP含量间差异均有统计学意义(F=1.820,1.460;P=0.012,0.000)。结论早期大剂量纳洛酮可有效降低DAI患者血清中β-APP的表达。     

大鼠鼠胚海马神经元缺氧复氧致细胞凋亡模型的建立

目的建立大鼠鼠胚海马神经元缺氧复氧致细胞凋亡模型。方法在大鼠鼠胚海马神经元培养基础上,给予不同时间的缺氧复氧,应用Wright-Giemsa染色、TUNEL法检测细胞凋亡情况。结果随着缺氧和复氧时间的延长神经细胞凋亡数逐渐增加,其中缺氧4 h复氧48 h大鼠海马神经细胞凋亡最为显著。结论缺氧复氧可诱导培养的大鼠海马神经细胞发生凋亡,缺氧4 h复氧48 h可作为细胞凋亡模型。     

红景天苷对体外培养大鼠海马神经元化学缺氧损伤ATP敏感性钾通道亚基表达的影响

目的研究红景天苷对大鼠海马神经元化学缺氧损伤的保护作用及机制。方法体外原代培养新生SD大鼠海马神经元并鉴定。以二氮嗪为阳性对照药,通过苏木精-伊红染色观察各实验组神经元形态,通过实时定量聚合酶链反应检测各实验组内向整流性钾通道受体6.2(Kir 6.2)、磺酰脲类受体1(SUR1)mRNA的表达差异,免疫细胞化学染色法检测各实验组Kir 6.2、SUR1蛋白质的表达差异。结果化学缺氧1 h,红景天苷各剂量组均可提高缺氧神经元存活率。与模型组比较,红景天苷各剂量组神经元Kir 6.2与SUR1 mRNA的表达量显著升高(P<0.01或P<0.05),Kir 6.2与SUR1蛋白表达也显著升高(P<0.01或P<0.05)。结论红景天苷通过上调化学缺氧神经元ATP敏感性钾通道亚基Kir 6.2、SUR1的表达对神经元起保护作用。