老年神经变性疾病蛋白基因研究:3种α-突触核蛋白提取纯化方法的比较

目的:用经济、简便、快捷的方法得到大量、高纯度的α-突触核蛋白。方法:将重组的proEXNACP,pGEXNACPH和pTYBNACP质粒分别转入大肠杆菌DH5α,BL21和ER2566细胞进行培养增菌,IPTG诱导产生α-突触核蛋白;超声破碎、离心粗提取得到融合的α-突触核蛋白;分别经Ni-NTAresin,GlutathioneSepharose4B和ChitinBeads纯化,得到α-突触核蛋白。用SDS-PAGE电泳观察纯度、Western杂交检测正确性、用BCA蛋白定量法测定蛋白含量。结果:3种方法均能得到较高纯度的α-突触核蛋白,其中用Ni-NTAresin提取纯化的α-突触核蛋白的纯度最高;蛋白收获量分别是10mg/L,5mg/L和5mg/L;经济耗费和实验的繁简程度没有较大差异。结论:3种方法均可作为α-突触核蛋白的提取方法。     

老年神经变性疾病机制研究的基础：人α—突触核蛋白基因在原核细胞中的蛋白表达

目的：为提供人α—突触核蛋白(α—synuclein)抗原，制备抗体以研究其自身聚集在老年神经变性疾病病理机制中所起作用，重组质粒载体、进行DNA测序，以用于α—突触核蛋白基因在原核细胞中的蛋白表达。方法：将质粒pcDNA3NACO(pcDNA3α-svnuclein cDNA)和质粒载体proEXMTHT1分别进行酶切，取α—突触核蛋白cDNA片段，重组于proEX MTHT1质粒载体上；酶切鉴定后测序；再将重组质粒proEXNACP转染进入DH5α大肠杆菌体内；用IPTG诱导α—突触核蛋白基因产生蛋白；将α突触核蛋白纯化后行Western杂交。结果：质粒pnoEX MTHT1和pcDNA3NACP经限制性内切酶消化分别得到4750bp和550bp DNA片段。α—突触核蛋白基因在原核细胞中蛋白表达量为10mg／L。表达蛋白经Western杂交证实为α—突触核蛋白。结论：α—突触核蛋白基因在原核细胞的蛋白表达可作为体内外研究老年神经变性疾病病理机制的基础研究。     

老年神经变性疾病机制研究的基础:人α-突触核蛋白基因在原核细胞中的蛋白表达

目的:为提供人α-突触核蛋白(α-synuclein)抗原,制备抗体以研究其自身聚集在老年神经变性疾病病理机制中所起作用,重组质粒载体、进行DNA测序,以用于α-突触核蛋白基因在原核细胞中的蛋白表达。方法:将质粒pcDNA3NACP(pcDNA3α-synucleincDNA)和质粒载体proEXMTHT1分别进行酶切,取α-突触核蛋白cDNA片段,重组于proEXMTHT1质粒载体上;酶切鉴定后测序;再将重组质粒proEXNACP转染进入DH5α大肠杆菌体内;用IPTG诱导α-突触核蛋白基因产生蛋白;将α突触核蛋白纯化后行Western杂交。结果:质粒proEXMTHT1和pcDNA3NACP经限制性内切酶消化分别得到4750bp和550bpDNA片段。α-突触核蛋白基因在原核细胞中蛋白表达量为10mg/L。表达蛋白经Western杂交证实为a-突触核蛋白。结论:α-突触核蛋白基因在原核细胞的蛋白表达可作为体内外研究老年神经变性疾病病理机制的基础研究。     

帕金森病病因蛋白质：α-突触核蛋白对酪氨酸羟化酶活性的影响

目的：α-突触核蛋白是帕金森病的病因蛋白质之一，α-突触核蛋白与酪氨酸羟化酶具有相互作用。制备一个基因重组酪氨酸羟化酶，探讨α-突触核蛋白对酪氨酸羟化酶活性的影响。方法：实验于2004-05／11在北京老年医学研究所神经生物研究室完成。将携带人酪氨酸羟化酶cDNA的基因重组质粒pGEX-TH转化BL21(DE3)细菌使其表达谷胱甘肽S转移酶-TH为标签的融合蛋白质，用谷胱甘肽-琼脂糖4B亲和层析法纯化基因重组酪氨酸羟化酶，用高压液相色谱(HPLC)法分析酪氨酸羟化酶活性，将α-突触核蛋白添加至酪氨酸羟化酶的酶促反应体系中。观察基因重组型酪氨酸羟化酶制备生成物特点，以及α-突触核蛋白对酪氨酸羟化酶活性的作用。结果：①基因重组酪氨酸羟化酶约占菌体可溶性蛋白组分的1％，纯化的酪氨酸羟化酶在SDS-PAGE上表现为单一条带，可催化L-酪氨酸发生羟化反应生成L-多巴。②随α-突触核蛋白浓度递增，酪氨酸羟化酶活性有不同程度的下降。结论：原核表达方法可制备纯化度较高的人基因酪氨酸羟化酶，α-突触核蛋白对酪氨酸羟化酶活性具有抑制作用。     

制备与鉴定导致家族性帕金森病突变蛋白质的α-突触核蛋白聚合体

目的：制备和鉴定与家族性帕金森病发病有关的α-突触核蛋白突变体A53T与A30P的聚合体，为帕金森病患者的治疗乃至康复干预提供重要理论基础及靶点。方法：实验于2004—01／05在首都医科大学宣武医院北京老年医学研究所神经生物研究室完成。设计含适当酶切位点的聚合酶链反应引物，用聚合酶链反应法从质粒pBS-α-突触核蛋白(A53T)和pBS-α-突触核蛋白(A30P)合成α-突触核蛋白突变DNA，并将其亚克隆至谷胱甘肽巯基转移酶融合表达载体pGEX-4T-1。转化大肠杆菌B121，以异丙基-D-硫代半乳糖苷诱导，使其表达融合蛋白GST-α-突触核蛋白(A53T)和GST-α-突触核蛋白(A30P)。用凝血酶定点分解融合蛋白，并用亲和层析法纯化突变的基因重组型人α-突触核蛋白。将重组蛋白在37℃下孵育2h制备蛋白聚合体。所制备聚合体用Westem blot分析法和透射电镜鉴定。结果：DNA测序结果证明构建载体插入正确α-突触核蛋白突变体A53T与A30P基因。基因表达产物在十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳上表现为单一条带，分子量约为18ku，与所报道的该蛋白的分子量一致。Westem blot分析表明，所表达蛋白可被α-突触核蛋白特异性抗体识别，证明表达的重组蛋白为α-突触核蛋白，聚合后的α-突触核蛋白在108ku左右，相当于六聚体。聚合体在电镜下呈短的丝状结构。结论：制备出人重组α-突触核蛋白突变体A53T与A30P并建立其聚合体模型，这为帕金森病的病因研究提供重要的物质基础从而为帕金森病患者的康复提供新的靶点。     

α-突触核蛋白对MES23．5多巴胺能神经细胞的促增殖作用

目的：分析外源性野生型α-突触核蛋白对多巴胺能神经细胞增殖的影响及其分子机制。 方法：实验于2005—04／11在北京老年病研究所神经生物室完成。向MES23．5多巴胺能神经细胞的培养基中加入重组人野生型α-突触核蛋白，孵育48h后用细胞免疫荧光标记法和Western blot分析法检测α-突触核蛋白在细胞内的分布，用MTS法绘制生长曲线观察细胞增殖率，用基因芯片分技术观察α-突触核蛋白处理细胞的基因表达谱变化。 结果：重组人野生型α-突触核蛋白可以进入MES23．5多巴胺能神经细胞，并促进其增殖。在α-突触核蛋白处理的细胞。有22个基因的表达发生明显变化，有3个基因与内吞相关，5个与转录有关，3个与蛋白质合成有关，3个与细胞生长和增殖有关，4个与分化有关，1个与增殖及分化均有关，2个与小泡生成和神经递质释放有关，1个与生理周期有关。 结论：外源性α-突触核蛋白可能通过内吞作用进入MES23．5多巴胺能神经细胞。从而促进其增殖；α-突触核蛋白的促细胞增殖作用可能与其影响某些基因表达有关。     

重组α-突触核蛋白对SD大鼠黑质多巴胺能神经元的作用

目的：研究重组人全长α-突触核蛋白对大鼠黑质多巴胺能神经元的霉性作用。方法：原核表达、鉴定α-突触核蛋白；雄性SD大鼠30只，随机分为α-突触核蛋白注射组、六羟多巴注射组及α-突触核蛋白和六羟多巴联合注射组。用立体定位的方法分别右侧黑质注射α-突触核蛋白，六羟多巴及α-突触核蛋白 六羟多巴，左侧黑质注射等量的生理盐水，测定大鼠纹状体多巴胺含量和黑质酪氨酸羟化酶阳性神经元数目。结果：六羟多巴和α-突触核蛋白 六羟多巴注射使注射侧多巴胺分别减少到对照侧的36．98％和21．79％，多巴胺能神经元数减少到30．81％和28．05％。而α-突触核蛋白注射对纹状体多巴胺和黑质多巴胺能神经元数目无显著影响。结论：没有发现重组α-突触核蛋白对大鼠黑质多巴胺能神经元有明显的毒性作用。     

神经细胞凋亡机制的研究进展：α-突触核蛋白与线粒体

目的：在帕金森病的病理结构中常常存在反常聚集的α-突触核蛋白和线粒体功能失常，就神经退行性病变中α-突触核蛋白和线粒体功能失常的关系做一综述。 资料来源：应用计算机检索Pubmed 2000-01／2005-09的相关文章。检索词为“α-synuclein，mitochondria and Parkinson＇s disease”并限定语种为“English”。 资料选择：对资料进行初审，查找全文的文献。纳入标准为：①与α-突触核蛋白的作用有关。②与线粒体和神经细胞凋亡有关。排除标准为较陈旧和重复研究的文章。 资料提炼：共收集到349篇文章，其中30篇文献符合纳入标准。 资料综合：在30篇文献中，15篇与α-突触核蛋白的作用有关；12篇与线粒体和神经细胞凋亡有关；3篇与α-突触核蛋白和线粒体的关系有关。以往的研究证明α-突触核蛋白是一种在神经退行性病变中起关键作用的毒性蛋白。但是近期研究表明，α-突触核蛋白可能具有双重作用。α-突触核蛋白与线粒体之间的相互作用可能是此种作用的关键。 结论：α-突触核蛋白与线粒体之间存在复杂的相互作用。未来集中于α-突触核蛋白与线粒体之间的关系的研究可能对帕金森病的病因学研究提供一种新的探索。     

锰对大鼠大脑α-突触核蛋白表达的影响

目的:探讨锰染毒大鼠大脑α-突触核蛋白的表达规律.方法:健康2月龄雄性SD大鼠50只,按体重随机分为A组(生理盐水组)、B组(Mn2+ 2.5 mg/kg)、C组(Mn2+ 5 mg/kg)、D组(Mn2+ 10 mg/kg)、E组(Mn2+ 20mg/kg).染毒30 d后,取脑测定大鼠大脑中α-突触核蛋白的表达情况.实时荧光定量PCR(QT-PCR)检测大鼠脑组织中α-突触核蛋白mRNA的相时表达水平,Western-blot检测α-突触核蛋白蛋白的表达.结果:B组、C组、D组和E组大鼠脑组织α-突触核蛋白mRNA的相对表达分别是A组的1.18、0.54、0.49和0.35倍.α-突触核蛋白表达用α-syn/GAPDH灰度值表示,结果显示α-突触核蛋白相对表达量,A、B、C、D和E组α-syn/GAPDH灰度值分别为0.32、1.33、0.71、0.54和0.57.与A组相比,B组α-突触核蛋白相对表达明显增加(P＜0.01).结论:锰在低剂量的时候可以促进α-突触核蛋白的表达聚集.     

人α防御素3前体蛋白对克雷伯菌和大肠杆菌的杀菌作用

目的：分析α防御素3前体蛋白对于克雷伯菌和大肠杆菌的杀菌效果，为进一步研究人类α防御素3的杀菌机制提供依据。方法：实验于2005—11／2006—09在上海交通大学生命科学技术学院刘建华实验室完成。将α防御素3前体的编码基因克隆到载体pDEST17中，载体转化入大肠杆菌DE3细胞，通过体外诱导及亲和纯化的方法获得α防御素3前体蛋白。根据在不同蛋白浓度下生存下来大肠杆菌和克雷伯菌所占的比例以及导致50％，90％和99％细菌死亡（LD50，LD90和LD99）时人α防御素3前体蛋白浓度来判断前体蛋白的杀菌作用。结果：①在1L培养基培养条件下，可获得纯化后α防御素3前体蛋白12mg，复性效率为15％-20％。②蛋白浓度为5，10，15和30mg／L时，克雷伯菌存活率分别为50％，33％，10％和4％。蛋白浓度为10，20，30和45mg／L时，大肠杆菌存活率分别为50％，10％，5％和1％。③克雷伯菌50％和99％致死率的蛋白质浓度为5和35mg／L。大肠杆菌50％和99％致死率的蛋白质浓度为10mg／L和45mg／L。结论：重组纯化的人α防御素3前体蛋白具有有效杀灭大肠杆菌和克雷伯菌的作用。     

制备与鉴定导致家族性帕金森病突变蛋白质的α-突触核蛋白聚合体

目的:制备和鉴定与家族性帕金森病发病有关的α-突触核蛋白突变体A53T与A30P的聚合体,为帕金森病患者的治疗乃至康复干预提供重要理论基础及靶点。方法:实验于2004-01/05在首都医科大学宣武医院北京老年医学研究所神经生物研究室完成。设计含适当酶切位点的聚合酶链反应引物,用聚合酶链反应法从质粒pBS-α-突触核蛋白(A53T)和pBS-α-突触核蛋白(A30P)合成α-突触核蛋白突变DNA,并将其亚克隆至谷胱甘肽巯基转移酶融合表达载体pGEX-4T-1。转化大肠杆菌BL21,以异丙基-D-硫代半乳糖苷诱导,使其表达融合蛋白GST-α-突触核蛋白(A53T)和GST-α-突触核蛋白(A30P)。用凝血酶定点分解融合蛋白,并用亲和层析法纯化突变的基因重组型人α-突触核蛋白。将重组蛋白在37℃下孵育2h制备蛋白聚合体。所制备聚合体用Westernblot分析法和透射电镜鉴定。结果:DNA测序结果证明构建载体插入正确α-突触核蛋白突变体A53T与A30P基因。基因表达产物在十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳上表现为单一条带,分子量约为18ku,与所报道的该蛋白的分子量一致。Westernblot分析表明,所表达蛋白可被α-突触核蛋白特异性抗体识别,证明表达的重组蛋白为α-突触核蛋白,聚合后的α-突触核蛋白在108ku左右,相当于六聚体。聚合体在电镜下呈短的丝     

帕金森病病因蛋白质:α-突触核蛋白对酪氨酸羟化酶活性的影响

目的:α-突触核蛋白是帕金森病的病因蛋白质之一,α-突触核蛋白与酪氨酸羟化酶具有相互作用。制备一个基因重组酪氨酸羟化酶,探讨α-突触核蛋白对酪氨酸羟化酶活性的影响。方法:实验于2004-05/11在北京老年医学研究所神经生物研究室完成。将携带人酪氨酸羟化酶cDNA的基因重组质粒pGEX-TH转化BL21(DE3)细菌使其表达谷胱甘肽S转移酶-TH为标签的融合蛋白质,用谷胱甘肽-琼脂糖4B亲和层析法纯化基因重组酪氨酸羟化酶,用高压液相色谱(HPLC)法分析酪氨酸羟化酶活性,将α-突触核蛋白添加至酪氨酸羟化酶的酶促反应体系中。观察基因重组型酪氨酸羟化酶制备生成物特点,以及α-突触核蛋白对酪氨酸羟化酶活性的作用。结果:①基因重组酪氨酸羟化酶约占菌体可溶性蛋白组分的1%,纯化的酪氨酸羟化酶在SDS-PAGE上表现为单一条带,可催化L-酪氨酸发生羟化反应生成L-多巴。②随α-突触核蛋白浓度递增,酪氨酸羟化酶活性有不同程度的下降。结论:原核表达方法可制备纯化度较高的人基因酪氨酸羟化酶,α-突触核蛋白对酪氨酸羟化酶活性具有抑制作用。     

热休克蛋白对帕金森病患者的神经保护作用

目的：阐述机体在应激条件下迅速合成的一组蛋白质-热休克蛋白与帕金森病的关系，对热休克蛋白神经保护作用的可能机制进行剖析。 资料来源：应用计算机检索Pubmed数据库1990-01／2005—10关于热休克蛋白对帕金森病神经保护功能的相关文章，检索词“Heat shock proteins”和“Parkinson’s disease,neurodegenerative disease，α-synuclein”分别组合进行检索，限定文章语言种类为English。同时计算机检索中国期刊全文数据库1995—01／2005～10关于热休克蛋白对帕金森病神经保护功能的相关文章，检索词“热休克蛋白，帕金森病，神经退行性疾病，α-突触核蛋白”，限定文章语言种类为中文。 资料选择：对资料进行初审，从查到的资料中选取有关热休克蛋白神经保护作用的文章。纳入标准：④随机对照临床和基础研究，采用单盲、双盲或非盲法。②实验包含平行对照组。排除标准：重复性研究。 资料提炼：共收集到446篇关于热休克蛋白神经保护作用的文章，入选16篇，入选的文章能包含其他文章的内容，体现了热休克蛋白对帕金森病保护作用的研究进展。排除的430篇为非随机对照研究或重复性研究。 资料综合：①近期研究表明热休克蛋白在帕金森病中表达并有神经保护作用，而这一保护作用与α-突触核蛋白密切相关。热休克本身并不会降低α-突触核蛋白的表达水平，由热休克诱导产生的一种保护性蛋白质对α-突触核蛋白所导致的凋亡起到抑制作用。②直接用过表达热休克蛋白70基因的模型来研究应激蛋白的神经保护作用发现，无论是在体内还是体外，分子伴侣热休克蛋白70都能够减少α-突触核蛋白错误折叠和聚集的量，并且对由α-突触核蛋白聚集所致的细胞毒性起抵抗作用。③小分子热休克蛋白的功能之一是在生理应激条件和神经系统疾病时调节蛋白结构。帕金森病患者病变区附近的星形胶质细胞和小胶质细胞中都有小分子热休克蛋白如热休克蛋白-27和αB-晶状体球蛋白表达。热休克蛋白在神经退行性病变过程中也是充当保护性的角色。 结论：帕金森病患者的神经细胞中有热休克蛋白的表达，并且该蛋白具有神经保护作用。其可能机制主要集中在热休克蛋白减少α-突触核蛋白的聚集和毒性以及减少细胞的凋亡和坏死上。     

重组α-突触核蛋白对 SD大鼠黑质多巴胺能神经元的作用

目的 研究重组人全长α-突触核蛋白对大鼠黑质多巴胺能神经元的毒性作用. 方法 原核表达、鉴定α-突触核蛋白;雄性 SD大鼠 30只,随机分为α-突触核蛋白注射组、六羟多巴注射组及α-突触核蛋白和六羟多巴联合注射组.用立体定位的方法分别右侧黑质注射α-突触核蛋白,六羟多巴及α-突触核蛋白+六羟多巴,左侧黑质注射等量的生理盐水,测定大鼠纹状体多巴胺含量和黑质酪氨酸羟化酶阳性神经元数目. 结果 六羟多巴和α-突触核蛋白+六羟多巴注射使注射侧多巴胺分别减少到对照侧的 36.98%和 21.79%,多巴胺能神经元数减少到 30.81%和 28.05%.而α-突触核蛋白注射对纹状体多巴胺和黑质多巴胺能神经元数目无显著影响. 结论 没有发现重组α-突触核蛋白对大鼠黑质多巴胺能神经元有明显的毒性作用.     

线粒体、α-突触核蛋白在帕金森病发病机制中的作用

目的：帕金森病是临床上最常见的神经退行性疾病之一，其确切的病因和发病机制目前尚不清楚。目前一般认为该病主要是由于环境和／或遗传所导致的线粒体功能受损及α-突触核蛋白异常聚集所致。线粒体功能受损尤其表现在complexⅠ功能下降，线粒体DNA的变化，氧应激和凋亡的发生，文章将重点阐述以上内容的研究新进展，以期寻找线粒体损伤和α-突触核蛋白在帕金森病中的确切作用。资料来源：应用计算机检索Medline数据库1980-01／2004-06期间的相关文章，检索词为“pakinson’s disease”和“α-synuclein，mitochondria，complex Ⅰ，oxidative stress，mtDNA，apoptosis”，分别地组合进行检索，限定文章语言种类为英文。同时计算机检索中国期刊全文数据库1999-01／2004-06期间的相关文章，检索词“α-突触核蛋白，线粒体，复合酶Ⅰ，氧应激，线粒体DNA，凋亡”，限定文章语言种类为中文。资料选择：对资料进行初审，从查到的资料中选取与α-突触核蛋白，线粒体在帕金森病发病机制中的作用有关的文章。资料提炼：共收集到62篇符合上述要求的文章，查找全文，有48篇文章找到了全文。将观点非常相似的文章进行对比，筛出阐述详尽，近期发表的文章共26篇，其余排除。资料综合：将所选文章按其所述机制与α-突触核蛋白，复合酶Ⅰ，氧应激，线粒体DNA，凋亡的相关程度进行分类综合。结论：线粒体损伤和α-突触核蛋白在帕金森病的发生过程中起到了重要的作用。线粒体损伤使ATP产生减少，能量不足，α-突触核蛋白聚集，细胞死亡。     

神经细胞黏附分子L1-Ig（1-4）的原核表达及其功能

目的：利用基因克隆、表达、纯化等分子生物学手段获取具有生物活性的神经细胞黏附分子L1（L1）的Ig（1-4）结构域融合蛋白。 方法：实验于2001-10／2004-12在解放军第二军医大学神经生物教研室完成。①从新生4d的SD大鼠的海马组织中提取总RNA，采用反转录-聚合酶链反应法获取L1-Ig（1-4）基因，进行序列分析后构建表达载体pET28a（＋）-LI-Ig（1-4）。②转染大肠杆菌BL21，用IPTG诱导L1-Ig（1-4）的表达。③利用Ni2＋-NTA柱纯化和复性。④用L1-Ig（1-4）融合蛋白观察培养脊髓原代神经元轴突生长情况及其活性，未加入融合蛋白的细胞做对照。 结果：①克隆出编码正确的大鼠L1-Ig（1-4）基因。②并在大肠杆菌中获得高效表达，表达产物占全菌总蛋白的28-3％。③Ni^2＋-NTA柱纯化后的纯度达90％以上。④加入融合蛋白后脊髓神经元突触的生长能力较未加入融合蛋白的细胞增强[（56&;#177;3．8），（43&;#177;2．7）μm，P〈0．01]。 结论：通过原核表达可大量获得L1-Ig（1-4）融合蛋白，该融合蛋白同样具有促神经生长的生物学活性。     

α-突触核蛋白对MES23.5多巴胺能神经细胞的促增殖作用

目的:分析外源性野生型α-突触核蛋白对多巴胺能神经细胞增殖的影响及其分子机制。方法:实验于2005-04/11在北京老年病研究所神经生物室完成。向MES23.5多巴胺能神经细胞的培养基中加入重组人野生型α-突触核蛋白,孵育48h后用细胞免疫荧光标记法和Westernblot分析法检测α-突触核蛋白在细胞内的分布,用MTS法绘制生长曲线观察细胞增殖率,用基因芯片分技术观察α-突触核蛋白处理细胞的基因表达谱变化。结果:重组人野生型α-突触核蛋白可以进入MES23.5多巴胺能神经细胞,并促进其增殖。在α-突触核蛋白处理的细胞,有22个基因的表达发生明显变化,有3个基因与内吞相关,5个与转录有关,3个与蛋白质合成有关,3个与细胞生长和增殖有关,4个与分化有关,1个与增殖及分化均有关,2个与小泡生成和神经递质释放有关,1个与生理周期有关。结论:外源性α-突触核蛋白可能通过内吞作用进入MES23.5多巴胺能神经细胞,从而促进其增殖;α-突触核蛋白的促细胞增殖作用可能与其影响某些基因表达有关。     

兔阴茎海绵体平滑肌细胞的纯化培养及相关鉴定分析

背景：从以往的文献来看，阴茎海绵体平滑肌细胞的原代培养存在着制作时间长，纯度不高以及易破成纤维细胞污染等诸多缺点。目的：探索兔阴茎海绵体平滑肌细胞的纯化培养技术及纯度鉴定方法。设计、时间及地点：对照实验，于2007-10／2008-03在上海交通大学附属第六人民医院泌尿外科，上海市组织工程研究与开发中心完成。材料：成熟的雄性新西兰大白兔5只，体质量2．5～2．8kg。方法：取雄性新西兰兔新鲜的阴茎组织，利用高浓度的胶原酶消化法结合差速贴壁技术对海绵体平滑肌细胞进行纯化培养。以同期兔成纤维细胞作为对照参考。主要观察指标：以四甲基偶氮唑盐分析细胞生长特性；以平滑肌肌动蛋白、肌球蛋白、结蛋白免疫荧光鉴定海绵体平滑肌细胞；以流式细胞仪检测P2及P5代细胞α-肌动蛋白、肌球蛋白、结蛋白阳性率变化情况。结果：培养细胞四甲基偶氮唑盐显示细胞指数增长期为6d左右，随后进入平台期。α-肌动蛋白、肌球蛋白、结蛋白均呈阳性反应，同期成纤维细胞仅。肌动蛋白显示阳性结果。第2代细胞表达α-肌动蛋白、肌球蛋自、结蛋白阳性率分别65.3％，42．2％，62．3％。经过反复多次的纯化技术至第5代时，上述指标阳性表达率分别上升为92．8％，72．7％，78．1％。结论：通过高浓度的酶消化法及差速贴壁技术可获得高纯度的阴茎海绵体平滑肌细胞，肌球蛋白、结蛋白相对于α-肌动蛋白可以成为鉴定海绵体平滑肌细胞的特异性指标。     

人α1微球蛋白基因的质粒载体构建和表达

目的构建表达人α1-微球蛋白(α1-microglobulin,1α-MG)的重组质粒并纯化目的蛋白。方法从正常人肝脏中提取cDNA,RT-PCR扩增α1-mg基因,将扩增产物用NdeI/BamHI消化,切下目的基因片断克隆到质粒pET-15b中,构建重组pET-15b,转化入E.coliDH5α中,经酶谱分析和测序,鉴定出正确的重组质粒pET-15b。将重组pET-15b转化入宿主菌E.coliBL21(DE3)中,用IPTG进行诱导表达。提取细菌总蛋白质进行SDS-PAGE分析和蛋白印迹鉴定。利用重组蛋白中的6个组氨酸(His)组成的“标签”进行亲和层析,纯化重组蛋白。结果筛选到携带有α1-mg基因的正确重组质粒pET-15b,重组蛋白在BL21(DE3)pLysS中得到了诱导表达,含量达20mg/L细菌培养液。经一步金属螯合亲和层析纯化后,重组蛋白在SDS-PAGE上呈现出均一的单一条带。结论重组质粒pET-15b的构建和有活性的酶蛋白的表达成功说明,PCR扩增获得的α1-mg基因具有完整的阅读框架,亲和层析纯化后可得到活性和纯度均较高的目的蛋白,为研制国产免疫比浊法试剂盒打下基础。     

神经细胞凋亡机制的研究进展:α-突触核蛋白与线粒体

目的:在帕金森病的病理结构中常常存在反常聚集的α-突触核蛋白和线粒体功能失常,就神经退行性病变中α-突触核蛋白和线粒体功能失常的关系做一综述。资料来源:应用计算机检索Pubmed2000-01/2005-09的相关文章,检索词为“α-synuclein,mitochondriaandParkinson’sdisease”并限定语种为“English”。资料选择:对资料进行初审,查找全文的文献。纳入标准为:①与α-突触核蛋白的作用有关。②与线粒体和神经细胞凋亡有关。排除标准为较陈旧和重复研究的文章。资料提炼:共收集到349篇文章,其中30篇文献符合纳入标准。资料综合:在30篇文献中,15篇与α-突触核蛋白的作用有关;12篇与线粒体和神经细胞凋亡有关;3篇与α-突触核蛋白和线粒体的关系有关。以往的研究证明α-突触核蛋白是一种在神经退行性病变中起关键作用的毒性蛋白。但是近期研究表明,α-突触核蛋白可能具有双重作用。α-突触核蛋白与线粒体之间的相互作用可能是此种作用的关键。结论:α-突触核蛋白与线粒体之间存在复杂的相互作用。未来集中于α-突触核蛋白与线粒体之间的关系的研究可能对帕金森病的病因学研究提供一种新的探索。