NF-κB结合位点在NOD2基因调控中的作用

目的 探讨NF-κB结合位点在NOD2基因调控中的作用.方法 以人基因组DNA为模板,PCR扩增含有NF-κB结合位点的人NOD2基因启动子序列,以切除启动子的pEGFP-N3作为框架结构,将这段序列进行酶切并定向克隆入表达载体pEGFP-N3中,构建含有NF-κB结合位点的人NOD2基因启动子驱动的绿色荧光蛋白(GFP)载体,将构建的重组质粒经脂质体LipofectAMINETM2000介导瞬时转染HeLa细胞,在倒置荧光显微镜下观察其能否在NOD2基因启动子的调控下表达报告基因GFP.用突变试剂盒将重组质粒pEGFP-N3-NOD2wt中的NF-κB结合位点缺失突变,将构建的突变重组质粒mpEGFP-N3-NOD2瞬时转染HeLa细胞,观察绿色荧光蛋白的表达情况.结果 pEGFP-N3-NOD2wt和mpEGFP-N3-NOD2经酶切鉴定和序列测定证实重组质粒构建成功,并且NF-κB结合位点突变成功.细胞转染结果表明,构建的重组质粒pEGFP-N3-NOD2wt转染HeLa细胞,在倒置荧光显微镜下能看到绿色荧光,而突变质粒mpEGFP-N3-NOD2荧光强度明显减弱,与未转染质粒相近.结论 成功构建了含有NF-κB结合位点的人NOD2基因启动子的重组质粒和含有NF-κB结合位点缺失突变的重组质粒;NF-κB结合位点突变重组质粒在HeLa细胞巾绿色荧光表达明显减弱,说明NF-κB结合位点在NOD2基因调控中发挥了正调节作用;为进一步研究NOD2基因表达及调控机制奠定了良好的基础.     

NF-κB结合位点突变对人NOD2基因启动子调控的影响

探讨NF-κB结合位点突变对人NOD2基因启动子调控的影响。采用PCR技术从人基因组DNA中扩增含有NF-κB结合位点的人NOD2基因启动子序列,并定向克隆入已切除启动子的表达载体pEGFP-N3中,构建含有NF-κB结合位点的人NOD2基因启动子驱动的绿色荧光蛋白(green fluorescent proteins,GFP)载体pEGFP-N3-NOD2wt,并构建NF-κB结合位点2个碱基缺失突变的载体,将构建的重组质粒瞬时转染HEK293细胞,在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况。结果显示重组质粒转染HEK293细胞后,在倒置荧光显微镜下均能看到绿色荧光,其中pEGFP-N3-NOD2wt重组质粒在HEK293细胞中荧光表达较强,而突变质粒mpEGFP-N3-NOD2荧光强度明显减弱。说明NF-κB结合位点是驱动NOD2基因转录的重要元件,且在NOD2基因启动子的调控中发挥了正调节作用,为进一步研究NOD2基因表达及调控机制提供了新的思路。     

P53结合位点对人 NOD8 基因的调控

目的: 探讨P53结合位点在 NOD8 基因调控中的作用。方法: 利用生物信息学方法,我们发现人与黑猩猩的 NOD8 基因核心启动子区域相似位置含有P53结合位点;以人基因组DNA为模板, PCR扩增含有人 NOD8 基因序列,构建含有/缺失人P53结合位点的 NOD8 基因启动子驱动的、表达绿色荧光蛋白-NOD8融合蛋白的质粒p NOD8 (760 bp)-EGFP- NOD8 和mp NOD8 (750 bp)-EGFP- NOD8 ;将构建的重组质粒经阳离子聚合物JetPei^TM介导瞬时转染HEK293细胞中,并加入不同浓度的P53抑制剂pifithrin alpha(PFT-α)处理HEK293细胞,用RT-PCR和Westren blotting 方法检测NOD8 mRNA和蛋白的表达;此外,用p NOD8 (760 bp)-EGFP质粒转染HEK293细胞,利用染色质免疫共沉淀法(ChIP)观察P53是否与 NOD8 启动子结合。结果: 经酶切鉴定和序列测定证实重组质粒构建成功。ChIP实验证实P53能与 NOD8 启动子结合。 p NOD8 (760 bp)-EGFP- NOD8 转染组中NOD8 mRNA的表达显著高于pEGFP-C2转染组(P＜0.05),并且NOD8 mRNA 在缺失人P53结合位点的mp NOD8 (750 bp)-EGFP- NOD8 转染组中的表达明显降低(P＜0.01);同时发现加入 PFT-α的p NOD8 (760 bp)-EGFP- NOD8 转染组NOD8 mRNA的表达显著下降,并呈剂量依赖关系,其中90 μmol/L PFT-α 对NOD8 mRNA表达的抑制作用最为显著(P＜0.01)。与mRNA检测结果一致的是p NOD8 (760 bp)-EGFP- NOD8 转染组NOD8蛋白的表达量显著高于对照组pEGFP-C2; 而mp NOD8 (750 bp)-EGFP- NOD8 转染组NOD8蛋白的表达量明显低于p NOD8 (760 bp)-EGFP- NOD8 转染组和加入 PFT-α的p NOD8 (760 bp)-EGFP- NOD8 转染组(P＜0.01)。结论: P53结合位点在 NOD8 基因调控中起着重要的作用,并且P53结合位点与 NOD8 基因之间可能存在正反馈调节。     

动脉内皮细胞中TIE2启动CREG真核表达质粒pTIE2-CREG-EGFP-N1的表达

背景：血管内皮发生的分子机制是细胞及基因替代治疗的首要前提。 目的：构建一种通过血管内皮细胞特异蛋白TIE2启动子来启动表达的E1A激活基因阻遏子(cellular repressor of E1A-stimulated genes, CREG)和增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein, EGFP)融合的真核表达质粒。 方法：根据GenBank中公布的TIE2基因的启动子序列,人工合成TIE2启动子DNA序列,经AseⅠ和NheⅠ双酶切后,亚克隆入表达质粒pEGFP-N1中构建pTIE2-EGFP-N1。同时,用BamHⅠ和EcoRⅠ 双酶切pcDNA3.1 myc-His/hCREG质粒得到CREG基因,亚克隆入质粒pTIE2-EGFP-N1中构建pTIE2-CREG-EGFP-N1,酶切鉴定。应用脂质体法将该质粒转染至体外培养的小鼠动脉内皮细胞,荧光显微镜下观察EGFP的表达;Western blot检测CREG蛋白的表达。 结果与结论：经酶切鉴定证实实验构建的pTIE2-CREG-EGFP-N1质粒正确;体外转染48 h,荧光显微镜下可见EGFP的表达,Western blot检测到CREG蛋白的表达。说明实验成功构建了pTIE2-CREG-EGFP-N1重组质粒,其可携带目的基因在小鼠动脉内皮细胞中有效表达。     

人Gax基因真核表达载体的构建及在血管平滑肌细胞中的表达

目的:构建人Gax基因真核表达载体,并观察在兔血管平滑肌细胞中的表达。方法:通过PCR从pCMV-SPORT6-Gax质粒中扩增出人Gax cDNA片段,经双酶切后装入到有绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP-N1中,经限制性内切酶酶切分析和DNA测序鉴定后通过梭华-Sofast转染试剂介导重组质粒转染至兔血管平滑肌细胞中进行表达,通过荧光显微镜观察转染细胞的绿色荧光蛋白表达和RT-PCR扩增转染细胞的cDNA来鉴定Gax在兔血管平滑肌细胞中的表达。结果:琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物人Gax基因片段约915bp,与预期分子量相符;酶切分析和测序鉴定证明人Gax真核表达载体pEGFP-N1-Gax连接正确;荧光显微镜观察到重组质粒转染细胞中有绿色荧光蛋白表达,及RT-PCR证明转染细胞有人GaxmRNA表达。结论:成功构建人Gax基因的重组真核表达载体pEGFP-N1-Gax,并证实在兔血管平滑肌细胞中表达,为进一步研究Gax基因在心血管病中的作用提供了实验基础。     

人RUVBL2真核表达载体的构建及其在HeLa细胞中的表达

目的:构建带有绿色荧光蛋白的RUVBL2真核表达载体pEGFP-N1-RUVBL2,并鉴定其在HeLa细胞中的表达。方法:以pGADT7-RUVBL2质粒为模板,PCR扩增RUVBL2基因,首先克隆至T载体中,进一步亚克隆至p-EGFP-N1,并对重组表达载体进行酶切及测序鉴定。采用脂质体转染法将重组质粒瞬时转染HeLa细胞系,应用荧光显微镜观察绿色荧光融合蛋白的表达,并用Western blot法检测RUVBL2-GFP融合蛋白的表达。结果:经限制性酶切鉴定及测序分析证实pEGFP-N1-RUVBL2载体序列正确;荧光显微镜下可见转染的HeLa细胞中有绿色荧光蛋白的表达,Western blot法证实转染细胞中能表达RUVBL2-GFP融合蛋白。结论:pEGFP-N1-RU-VBL2表达载体构建成功,并在HeLa细胞内成功表达。     

癌胚抗原启动子控制基因靶向表达研究

目的 构建由癌胚抗原(CEA)启动子控制报道基因增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达的重组表达质粒CMVE-pCEA-IRES-EGFP.了解CEA启动子靶向驱动的含目的基因的重组质粒的效率.方法 构建重组质粒CMVE-pCEA-IRES-EGFP,以PCR,DNA测序及酶切进行鉴定.通过脂质体介导重组质粒CMVE-pCEA-IRES-EGFP体外分别转染A549细胞(CEA阳性)和16HBE(CEA阴性)细胞,进行绿色荧光蛋白检测分析基因表达的靶向性.结果 CMVE-pCEA-IRES-EGFP分别用VSP Ⅰ,VSP Ⅰ/Nhe Ⅰ酶切后电泳分别出现大小约405 bp,372 bp和4110 bp的片断,与预计各片断大小相符.以CMVE-pCEA-IRES-EGFP为模板PCR扩增得到CMV和CEA片段,分别连于T载体(pMD18-T)并测序,结果正确.嵌合启动子CMVE-pCEA能特异地驱动下游报告基因在CEA阳性肺癌细胞株绿色荧光表达阳性,而CEA阴性细胞株16HBE表达阴性.结论 成功构建了嵌合启动子CMVE-pCEA驱动的CMVE-pCEA-IRES-EGFP重组质粒,并能在转染的CEA阳性细胞株中表达,为靶向启动双基因表达载体构件提供了实验依据.     

人NKG2D的基因克隆及其在CHO细胞中的表达

目的:构建重组人NKG2D真核表达载体并在CHO细胞表达重组人NKG2D。方法:用RT-PCR方法从NK-92细胞中调取NKG2D基因片段,克隆到pGEM-TEasy载体并对克隆的DNA片段进行序列分析。用限制内切酶EcoRI和BamHI消化pGEM-TEasy/NKG2D重组质粒,分离NKG2D片段,并插入真核表达质粒pEGFP-N1的相应限制酶位点,酶谱分析鉴定重组表达载体pEGFP-N1/NKG2D。然后经脂质体介导转染CHO细胞。应用荧光显微镜观测、Westernblot方法和免疫组化染色对转染细胞内pEGFP-N1/NKG2D的表达进行鉴定。结果:RT-PCR扩增获得650bp基因片段,经DNA序列分析证明所获得的DNA序列与文献报道的NKG2D序列一致。转染的CHO细胞在荧光显微镜下发出强绿色荧光,Westernblot分析显示重组蛋白能特异地与抗人NKG2D单克隆抗体结合;免疫组化检测显示,转染的CHO中有棕色颗粒,证明所构建的NKG2D真核表达载体可以在细胞中表达。结论:构建了人NKG2D的哺乳动物细胞表达载体,并成功地在CHO细胞中获得重组人NKG2D的表达。     

HBx蛋白对IGF-II基因P4启动子活性的影响

目的:构建乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)表达载体pEYFP-C1-X及人IGF-II基因P4启动子调控的荧光素酶报告载体pGL3-P4,并初步探讨HBx对IGF-II基因P4启动子活性的影响。方法:应用基因重组技术,将HBx基因及P4启动子分别克隆入pEYFP-C1及pGL3-Basic载体,构建重组质粒pEYFP-C1-X及pGL3-P4;将pEYFP-C1-X稳定转染HepG2细胞,进行G418筛选;将体外甲基化pGL3-P4瞬时转染HepG2-EYFP-X细胞,采用双荧光素酶实验检测P4启动子的转录调控活性。结果:(1)经酶切及测序鉴定,重组质粒中的目的片段HBx和P4启动子的大小分别为465bp及1246bp,序列与GenBank数据库一致。(2)获得了表达HBx的细胞系HepG2-EYFP-X,在荧光显微镜下呈现黄绿色荧光。(3)转染HepG2-EYFP-X细胞的甲基化P4启动子的荧光素酶活性明显高于其对照细胞HepG2-EYFP(P0.01)。结论:HBx可增加P4启动子的转录活性。     

USP22基因克隆及其融合蛋白真核表达载体的构建

目的 克隆人类泛素水解酶22(ubiquitin-specific processing enzyme 22,USP22)基因,构建与绿色荧光蛋白融合表达的真核载体.方法 利用RT-PCR技术以HeLa细胞总RNA为模板分别扩增USP22基因cDNA序列两片段,依次插入真核表达载体pEGFP-N1;重组质粒转染HEK293T细胞,观察融合蛋白表达及绿色荧光的分布.结果 测序结果显示USP22序列与GenBank收录数据一致,酶切显示重组质粒pEGFP-USP22构建无误,质粒转染后有80 %左右HEK293T细胞表达绿色荧光,且在胞质与胞核中广泛分布.结论 成功克隆USP22基因并构建与GFP融合表达的真核载体,为进一步深入研究USP22基因的生物学功能奠定了基础.     

Salusin-a基因真核表达载体的构建及在HEK293细胞中的表达

目的:研究增强型绿色荧光蛋白真核表达载体Salusin-a(pEG-FP-Salusin-a)的构建及在人胚胎肾细胞系293细胞(HEK293)中的表达。方法:提取人单核细胞系THP-1细胞Salusin-a的mRNA,逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)扩增Salusin-a基因,克隆入pEGFP-N3载体,双酶切、菌落PCR及测序鉴定pEGFP-Salusin-a质粒。用脂质体转染pEGFP-Salusin-a入HEK293细胞,分为转染细胞组、质粒对照组和空白对照组,检测分析各组荧光蛋白和Salusin-a基因的表达。结果:成功构建pEGFP-Salusin-a质粒,并转染HEK293,细胞转染效率86%,转染细胞组和质粒对照组绿色荧光蛋白的表达明显高于空白对照组(P0.05);转染细胞组Salusin-amRNA的表达明显高于质粒对照组和空白对照组(P0.05)。结论:重组pEGFP-Salusin-a质粒能转染HEK293细胞并表达Salusin-a,为Salusin-a基因功能的进一步研究提供了实验基础。     

变形链球菌表面蛋白可变区真核载体质粒pEGFP-N1一SrV+的构建及在293T细胞的表达

目的 构建变形链球菌(变链菌)表面蛋白可变区(extended-v)真核表达质粒pEGFP-NI-SrV+,并转染哺乳动物细胞293T,为进一步研究该区功能奠定基础.方法 根据已报道变链菌OMZ175的sry+基因序列,化学合成srV+的编码基因srv+,将真核载体质粒pEGFP-N1和srv+基因片段分别用Kpn Ⅰ/Xho Ⅰ双酶切,连接获取重组质粒pEGFP-NI-SrV+,并对其进行PCR、酶切和测序鉴定.通过脂质体法瞬时转染哺乳动物细胞293T.运用荧光显微镜观察、Western blot及real-time PCR法检目的 蛋白在293T细胞中的表达情况.结果 通过基凶化学合成技术,获得1136 bp的目的 基因srv+,经测序鉴定与模板目的 基因序列一致;成功构建真核表达质粒pEGFP-N1-SrV+;PCR扩增榆测可获得1.33 kb目的 基因片段;Kpn Ⅰ/Xho Ⅰ双酶切可见4.7 kb和1.1 kb两条电泳条带,证实重组质粒pEGFP-N1-SrV+携带目的 基因;通过荧光显微镜观察到重组质粒pEGFP-N1-SrV+融合GFP后的表达,目的 细胞的转染效率达到80%以上;Western blot检测到相对分子质量(M1)为72 × 103处有特征条带,其大小和Srv+融合蛋白(42 × 103+28 × 103=70 × 103)相吻合;real-time PCR 数值分析显示:在293T细胞中,srv+基因的过表达效果显著.结论 成功构建了真核表达载体质粒pEGFP-N1-SrV+,并能够在哺乳动物细胞293T中表达.

Abstract：

Objective To construct the recombinant plasmid pEGFP-N1-SrV+ and evaluate the expression of SrV+in mammalian 293T cells.nethods srv+.a gene encoding the vailable region of the surface protein of the Streptococcus mutans OMZ175.was cloned chemically based on its reported nucleotide sequence.The eukaryotic expression plasmid,pEGFP-N1-SrV+,was constructed by introducing the srv+ gene into the Kpn Ⅰ/Xho Ⅰ site of pEGFP-NI.The recombinant plasmid pEGFP-N1-SrV+was transfected into 293T cells with lipofectamine and the expression level of SrV+was evaluated.Results The eukaryotic expression plasmid pEGFP-N1-SrV+was constructed successfully.GFP was observed by green fluorescent microscope.and a 72 × 1 03 protein was detected bv Westem blot.Real-time RT-PCR analysis revealed that the expression of the pEGFP-N1-SrV+in 293T was excellent and significant compared the control group. Conclusion The recombinant plasmid pEGFP-N1-SrV+was successfully constructed.which could encode the expression of SrV+after transfected into the mammalian 293T Cells.     

前凋亡因子bimS基因的重组腺病毒载体构建

为探讨前凋亡因子bimS用于肿瘤基因治疗奠定基础,拟构建bimS的重组腺病毒载体。采用RT-PCR方法从人HL-60细胞扩增目的基因bimS;克隆至T载体测序正确。亚克隆bimS基因到腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV上,形成含目的基因和绿色荧光蛋白(GFP)基因的穿梭载体。穿梭载体pAdtrack-CMV-bimS和病毒骨架载体pAdEasy-1经电穿孔法转入BJ5183大肠杆菌中行同源重组,获得重组pAdEasy-CMV-bimS,线性化后脂质体法转染人胚肾(HEK)293细胞进行病毒的包装、扩增、病毒滴度测定以及瞬时表达的观察;将病毒以MOI=100感染HEK293细胞,western blot检测bimS蛋白表达。结果显示病毒感染293细胞48~72h观察到GFP表达,7d出现典型细胞病变症状(CPE);提取培养上清中病毒DNA,以PCR法可检测到bimS的扩增产物;western blot检测病毒感染的293细胞总蛋白,与未感染的阴性对照细胞相比,bimS蛋白表达明显高于阴性对照细胞。表明重组bimS腺病毒构建成功;为进一步进行肿瘤基因治疗的体内外试验奠定基础。     

表达人B7-1的重组腺病毒的制备及初步鉴定

目的构建表达B7-1基因的重组腺病毒载体,制备相应的复制缺陷型重组腺病毒并检测其在喉癌细胞中的表达。方法构建携带人B7-1基因的重组穿梭载体pAdtrack-B7-1,PmeI线性化后与腺病毒载体pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183,通过同源重组得到重组腺病毒载体pAd-B7-1。将重组腺病毒载体转染HEK293包装细胞制备重组腺病毒,应用病毒悬液感染人喉癌细胞株,RT-PCR检测感染细胞中B7-1基因mRNA表达。结果酶切鉴定证实阳性pAdTrackB7-1重组穿梭载体含有目的基因B7-1,同源重组后制备的病毒载体DNA经酶切鉴定获得了阳性重组腺病毒载体,该载体能有效转染HEK293细胞并在细胞内成功包装,转染3d后可以观察到绿色荧光蛋白(GFP)表达并逐渐增多、增强。制备的Ad-B7在体外能有效感染Hep-2细胞,感染后可维持6d高水平的B7-1的表达,整体表达可持续两周。结论成功构建了同时表达B7-1的重组腺病毒载体并制备出重组腺病毒颗粒,该病毒能有效地感染喉癌细胞并表达高水平的B7-1基因,为进一步研究B7-1的功能及应用B7-1进行基因治疗奠定基础。     

大鼠ferroportin 1过表达慢病毒载体构建及其转染PC12细胞

目的:构建含大鼠ferroportin 1(FP1,膜铁转运蛋白1)基因和EGFP(绿色荧光蛋白)基因的过表达慢病毒载体并转染PC12细胞。方法:化学合成含有目的基因FP1的质粒,将酶切获得的目的基因连接入线性化慢病毒载体,构建重组质粒PGC-FU-FP1并进行测序鉴定;鉴定正确的阳性克隆采用Lipofectamine2000转染293T细胞,通过荧光显微镜和Western Blot检测FP1表达情况;在脂质体介导下将PGC-FU-FP1、pHelper1.0和pHelper2.0三质粒系统共转染入293T细胞,包装产生慢病毒,并通过实时荧光定量PCR法检测病毒滴度。以重组慢病毒载体质粒PGC-FU-FP1转染PC12细胞,荧光显微镜下观察EGFP的表达,实时荧光定量PCR和Western Blot法分别检测FP1mRNA和蛋白表达情况。结果:FP1基因序列经测序后与GeneBank报道的序列完全一致;重组质粒PGC-FU-FP1中携带有正确的FP1基因并能在293T细胞中表达;病毒滴度为2×108TU/ml。荧光显微镜、实时荧光定量PCR和Western Blot法证实目的基因FP1能被重组慢病毒高效导入PC12细胞并得到过表达。结论:成功构建携带FP1基因的慢病毒载体,并获得FP1基因修饰的PC12基因工程细胞。为进一步研究FP1在帕金森病中的作用及基因治疗奠定基础。     

α-synuclein基因过度表达诱导HEK293细胞α-synuclein蛋白病理性积聚

目的观察α-synuclein过度表达诱导HEK293细胞α-synuclein蛋白病理性积聚的作用。方法将消除终止密码子α-synuclein基因扩增产物连入pGEM T-easy载体，DNA测序证实后亚克隆入增强型绿色荧光蛋白pEGFP-N1质粒，通过限制性内切酶酶切鉴定重组质粒。采用脂质2000将野生型α-synuclein-EGFP真核表达载体转染HEK293细胞，48h后采用Axiovert200型倒置荧光显微镜、荧光免疫细胞化学观察其在细胞内的表达，HE染色观察细胞胞浆内嗜酸性小体的形成。结果消除终止密码子的扩增序列经测序证实并亚克隆入pEGFP-N1质粒后，限制性内切酶酶切鉴定质粒大小、酶切位点上均符合实验设计。将野生型α-synuclein-EGFP真核表达载体转染HEK293细胞，48h后荧光显微镜下观察细胞在波长488nm蓝色激发光下发出明亮的绿色荧光，其中某些细胞出现绿色荧光物质积聚；免疫荧光细胞化学检测，EGFP阳性细胞同时也表现为α-synuclein免疫反应阳性，某些细胞胞浆内可见α-synuclein免疫阳性产物聚集；HE结果发现一些细胞胞浆内出现圆形的嗜酸性小体形成，约占细胞总数的10．8％。结论野生型α-synuclein基因过表达可诱导α-synuclein蛋白在HEK293细胞内积聚，胞浆内嗜酸性小体形成。     

HIV-1包膜蛋白ENV慢病毒载体的构建及表达

目的:构建表达HIV-1包膜蛋白ENV的慢病毒载体,感染人胚肾细胞HEK293T,观察env基因在HEK293T中的表达。方法:通过点突变获得HIV-1 env完整基因,将env基因亚克隆至慢病毒穿梭载体pLVX-IRES-ZsGreen1的EcoRⅠ、XhoⅠ位点,构建重组质粒pLV-env,采用脂质体转染法转染HEK293T,经RT-PCR、Western blot检测目的基因表达,同时利用激光共聚焦技术对env基因的表达进行了定位。结果:成功获得了HIV-1 env基因,构建了重组慢病毒质粒pLV-env,RT-PCR、Western blot检测均表明外源基因能够表达,并具有抗原性,同时env基因表达后可以分泌到细胞膜表面膜上。结论:成功构建了含有HIV-1包膜蛋白env基因的重组慢病毒质粒,并验证了其表达,为下一步慢病毒的包装以及细胞模型和动物模型的构建奠定了基础。     

人黑色素浓集激素受体2基因shRNA真核表达载体体外转染

目的构建针对人黑色素浓集激素受体2(MCHR2)的短发夹RNA(shRNA)真核表达载体,并观察其转染效率。方法根据MCHR2基因序列,设计并合成特异性的小干扰片段,将其定向克隆到真核表达载体pGenesil-1中,酶切和测序后,用脂质体转染到HEK293细胞中,用荧光显微镜和流式细胞仪观察荧光表达,鉴定转染效率。结果与结论成功构建4条表达shRNA的质粒及其阴性对照质粒,并成功转染到HEK293细胞系中,转染效率达50%以上。