HBV DNA在血清HBV标志物阴性肝炎肝组织中的表达

１．资料与方法：肝穿刺活检组织４５例均取自１９９５～１９９７年传染科住院患者,用ＥＬＩＳＡ 法检测血清ＨＢＶ标志物及常规ＰＣＲ 检测血清 ＨＢＶ ＤＮＡ均为阴性。男３９例,女６例,年龄１２～５６岁。临床诊断：急性黄疸性肝炎２４例;慢性肝炎：轻度１３例,中度３例,重度１例;肝硬化４例。肝组织原位杂交：带有ＨＢＶ全基因组的重组ＰＣＲ１０质粒,经ＰＣＲ扩增,获Ｓ基因 ５００ ｂｐ片段,经 ＤＮＡ回收试剂盒回收,以其作为裸探针,采用地高辛标记试剂盒制备探针。常规脱蜡入水,０．２盐酸室温消化 ２０ ｍｉｎ,蛋白酶 …     

血清HBV标志与HBV DNA含量关系的初步研究

HBV血清标志(HBVM)是应用多年判断HBV感染的指标.近年来斑点杂交、聚合酶链反应(PCR)定性及定量检测的运用,使人们以往从HBVM中形成的观念有所改变.本文同时检测了66例HBV感染者以及28例抗病毒治疗患者血清HBVM、斑点杂交和HBV DNA定量测定,初步探讨上述指标在反映HBV感染和复制状态,以及观察抗病毒疗效的意义.     

乙型肝炎病毒在异种动物原代肝细胞中复制与表达的研究

目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)DNA复制和表达的跨种属特异性。 方法 分离培养原代大鼠肝细胞(PRH)与原代鸭肝细胞(PDH),电转HBV线性裸DNA(转染组每1×107PRH或PDH 1.19×1012拷贝),分别于转染后1～15d各时点,收集PRH或PDH培养上清液与细胞裂解液,分别以Southern杂交分析和斑点杂交法分析HBV DNA的复制中间体与复制型式;以全自动免疫荧光检测系统检测乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎e抗原(HBeAg),以western免疫印迹、免疫斑点印迹和免疫细胞化学法检测乙型肝炎核心抗原(HBcAg);用逆转录聚合酶链反应检测HBV S/X mRNA。以单纯电击PRH/PDH为对照组。 结果 Southern杂交分析显示:PRH/PDH转染组HBV DNA均为游离复制型,可见4.0 kb以下分子区带,包括松弛环状DNA、共价闭环形DNA和单链线形DNA等复制中间体;未见整合型HBVDNA-高分子(4.0～24.0 kb)区带。HBV DNA在PRH中表达蛋白产物水平,HBsAg于转染后各时点PRH裂解液中均可检测到(P/N值2.17～93.41,平均值为14.74±31.82,阳性≥2.1),峰值于1～3 d;仅转染后1d PRH培养上清液中检测到HBsAg,P/N值为6.66;HBcAg和HBeAg仅于转染后1～3 d时点内检测到低度表达;HBV S mRNA为阳性,而X mRNA为阴性。HBV DNA转染PDH组,转染后1、3、5 d各时点PDH裂解液中HBsAg分别为15.24、     

HBV—DNA定量检测的临床意义探讨

血清乙肝病毒 ( HBV)抗原抗体五项指标 ( HBV-M)是临床诊断乙型肝炎的常用指标。因 HBV为逃避人类免疫清除不断地发生变异 ,故定量观察血清HBV- DNA含量对诊断和治疗慢性乙型肝炎具有重要意义。我们对 40 0例不同 HBV- DNA表现形式的患者采用 PCR荧光定量法进行 HBV- DNA含量检测 ,并对其临床意义讨论 ,现将结果报告如下。1　资料与方法本文 40 0例患者均系我院 2 0 0 0年 9～ 1 2月诊治的慢性乙肝患者 ,其中男 30 8例 ,女 92例 ;年龄 1 1～67岁。均符合 1 995年全国肝炎会议制定的诊断标准。按 HBV- M表现形式分为 8组 ,每组…     

乙型肝炎病毒裸DNA转染原代大鼠肝细胞模型的建立

目的建立乙型肝炎病毒(HBV)环化裸DNA转染原代大鼠肝细胞瞬时表达模型,为进一步研究肝细胞与HBV之间的互动关系奠定基础. 方法采用原代大鼠肝细胞(PRH)作为靶细胞,电转环化HBV DNA,于转染后1～10d各时点分别以Southern杂交和斑点杂交分析HBV DNA的复制中间体与复制形式,以IMX系统检测HBsAg、HBeAg,以western免疫印迹、免疫斑点印迹和免疫细胞化学法检测HBcAg,用RT-PCR检测HBV S/X mRNA,并采用电镜观察有无Dane颗粒合成.以单纯电击PRH为对照组. 结果 HBV环化裸DNA在PRH中的复制为游离型,可见rcDNA、cccDNA和ssDNA等复制中间体;表达的蛋白质产物、HBsAg于转染后各时点PRH裂解液中均可检测到(P/N值4.83～85.69,阳性≥2.1),峰值于1～3d,转染后1～10d平均P/N值为18.239±27.459;PRH培养上清液中未检测到HBsAg;HBeAg于PRH培养上清液和细胞裂解液中均呈阴性(P/N值＜2.1);HBcAg于转染后1～3d时点内检测到低度表达;HBV S mRNA为阳性,而X mRNA为阴性;电镜未观察到Dane颗粒. 结论 HBV环化裸DNA转染原代大鼠肝细胞瞬时表达模型稳定性、可重复性均良好.     

多聚酶链反应检测HBV DNA

多聚酶链反应是由多聚酶作用使DNA特异性片段的增殖反应，它基于两个已知顺序的引物、4种磷酸盐脱氧核苷酸和一个多聚酶。引物组合于变性DNA及向一定方向伸长，最后形成新的DNA。我们应用1pgHBV DNA增殖40周期，用^32P标记探针进行杂交，在自显影底片1021bp处出具具有诊断性的条带，说明有HBV DNA存在。如果改用细胞DNA(HepG2)代替HBV DNA,就不能获得特异性DNA条.5分原发性肝癌患者血清，原HBVDNA阴性，经多聚酶链反应后，发现其中2份为阳性。同样，5份HBsAg携带者血清，经多聚酶链反应后发现有3份为阳性。多聚酶链反应是高特异性和高灵敏度的方法。     

HBV—DNA在各型乙肝中的分布规律探讨

采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术检测乙肝患者的血清ＨＢＶ－ＤＮＡ，商时用ＥＬＩＳＡ法检测ＨＢＶ各抗原抗体指标。结果显示，９０４例乙肝患者的ＨＢｅＡｇ阳性率为３７．９％，而ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性率达６８．８％，血清ＨＢＶＤ－ＮＡ阳性率明显高于ＨＢｅＡｇ（Ｐ〈０．０５）。在ＨＢｅＡｇ阴性病例中，ＨＢＶ－ＤＮＡ阳性率达５４．４％，其中有活动性肝病者阳性率为７２．３％，肝病静止期仅１９．９％，差异极显著（Ｐ〈０     

PCR检测抗HBs阳性肝炎43例HBV DNA分析

我们对我院１９９５年～１９９７年４３例血清抗ＨＢｓ阳性肝炎患者ＰＣＲ检测血清ＨＢＶＤＮＡ情况进行分析，现将结果报告如下。１临床资料１．１一般资料：４３例均为住院患者，无乙肝疫苗接种史。既往有明确乙型肝炎病史者８例，无明确乙型肝炎病史者３５例。根据１９...     

各型乙型肝炎患者血液HBV DNA水平与临床的关系

１．资料与方法：２０００年７月-１２月本院住院及门诊各型乙型肝炎患者２２６例，男１７１例，女５５例，年龄５－７６岁，诊断与分型符合１９９５年全国传染病与寄生虫病学术会议修订标准。ＨＢＶ血清学标志物采用酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ），试剂由上海科华公司提供，血清荧光定量ＨＢＶ ＤＮＡ检测使用美国ＰＥ５７００全自动实时荧光定量ＰＣＲ仪，由中山医科大学达安基因诊断中心提供技术操作及试剂盒，取ＨＢＶ ＤＮＡ绝对值的对数值作分析研究，统计处理用ｘ２检验和ｔ检验。 ２．结果：急、慢性ＨＢＶ感染血清ＨＢＶ ＤＮＡ水…     

Replication of hepatitis B virus in primary duck hepatocytes transfected with linear viral DNA

AIM: To explore the expression and replication of hepatitis B virus (HBV) DNA in primary duck hepatocytes (PDHs). METHODS: Complete HBV genome was transfected into PDHs by electroporation (transfected group, 1.19×1012 copies of linear HBV DNA/1×107 PDHs). After 1-5 d of transfection, HBsAg and HBeAg in the supernatant and lysate of PDHs were measured with the IMX System. Meanwhile, replicative intermediates of HBV DNA were analyzed by Southern blotting and Dot blotting. PDHs electroporated were used as control group. RESULTS: HBsAg in the hepatocyte lysates of transfected group was 15.24 (1 d), 14.55 (3 d) and 5.13 (5 d; P/N values, positive≥2.1) respectively. HBeAg was negative (<2.1). Both HBsAg and HBeAg were negative in the supernatant of transfected group. Dot blotting revealed that HBV DNA was strongly positive in the transfected group and negative in the control group. Southern blot analysis of intracellular total DNA indicated that there were relaxed circular (rc DNA), covalently closed circular (ccc DNA), and single-stranded (ss DNA) HBV DNA replicative intermediates in the transfected group, there was no integrated HBV DNA in the cellular genome. These parameters were negative in control group. CONCLUSION: Expression and replication of HBV genes can occur in hepatocytes from non-mammalian species. HBV replication has no critical species-specificity, and yet hepatic-specific regulating factors in hepatocytes may be essential for viral replication.     

载脂蛋白质B mRNA编辑酶催化多肽3G抑制乙型肝炎病毒和鸭乙型肝炎病毒复制

目的了解载脂蛋白质BmRNA编辑酶催化多肽3G（APOBEC3G）对乙型肝炎病毒（HBV）和鸭乙型肝炎炎病毒（DHBV）复制的抑制作用。方法从健康人外周血单个核细胞提取RNA，逆转录聚合酶链反应扩增APOBEC3G，将产物克隆到pXF3H载体的EcoRⅠ和Hind Ⅲ酶切位点以构建真核表达质粒；以ayw亚型HBV全长质粒构建具有复制能力的1．3倍HBV质粒（pHBV1．3）。不同剂量的APOBEC3G真核表达质粒与pHBV1．3共转染HepG2细胞；酶联免疫吸附法检测细胞培养上清液的乙型肝炎表面抗原和e抗原水平，Southernblot和Northernblot分析HBV核衣壳相关DNA和RNA的水平变化。不同剂量APOBEC3G真核表达质粒与头尾相接的2倍DHBV质粒共转染LMH鸡肝癌细胞，Southernblot分析DHBV核衣壳相关DNA水平变化。结果成功构建APOBEC3G真核表达质粒和具有复制能力的1．3倍HBV质粒。APOBEC3G抑制乙型肝炎表面抗原和e抗原的分泌，转染细胞内HBV核衣壳相关RNA表达水平下降，而对核心蛋白质的表达没有影响；APOBEC3G对转染细胞内HBV和DHBV核衣壳相关DNA水平具有剂量依赖的抑制效应。结论APOBEC3G对HBV和DHBV复制具有抑制作用。     

乙型肝炎病毒Ⅹ蛋白对原代小鼠肝细胞周期的影响

目的 探讨HBV复制过程中HBx蛋白对原代小鼠肝细胞周期的影响. 方法 采用原代小鼠肝细胞为研究系统,用野生型HBV质粒(pHBV)和HBx蛋白表达缺失的HBV质粒(pHBV△X)分别转染细胞.Western blot检测细胞周期蛋白cyclin D1、cyclin E、cyclin A及细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子p16 (p16)、p21的表达水平；实时荧光定量PCR和Southern blot检测HBVDNA复制水平.两组之间比较用两样本均数t检验,多样本均数间的比较用方差分析及q检验. 结果 新分离肝细胞和原代培养24、48、72 h肝细胞的细胞周期蛋白表达水平无明显差异；转染48 h后,pHBV组细胞与pHBV△X组细胞周期蛋白条带灰度值相比,前者cyclin D1、p21、cyclin E表达量较高,p16的表达量较低,统计量t值分别为15.713,22.897,14.680,-19.584,P值均＜0.05.培养72 h后提取HBV DNA,Southem blot检测HBV DNA复制中间体松散环状DNA、双链线性DNA、单链DNA的水平,经条带灰度扫描,pHBV组的水平(分别为3288.336±448.011、6458.318±182.163、2760.613±393.561)明显高于pHBV△X组(分别为515.721±62.530、2122.228±28.347、1632.013±207.021)及空白对照组,P值均＜0.05；实时荧光定量PCR检测HBV DNA复制水平,pHBV组[每个细胞(987.50±47.80)拷贝]也明显高于pHBV△X组[每个细胞(303.67±33.94)拷贝],t=20.203,P＜0.05.结论 HBx蛋白能通过调节细胞周期中各蛋白的表达,使细胞由静止期(G0)进入DNA合成前期(G1)并停滞于G1期,从而促进HBV的复制.     

乙型肝炎病毒在HepG2细胞中的稳定复制及表达

目的 建立HBVHepG2肝细胞株，使HBV能长期稳定地表达抗原并复制。方法将含完整转录单位的1．2倍体HBVDNA经Sal1位点克隆入真核表达载体pREP10，构建的重组载体pREP—HBV以Lipofemamine2000转染HepG2细胞，250μg／ml。潮霉素筛选抗性细胞克隆。ELISA检测细胞上清液中的HBsAg和HBeAg。电子显微镜下观察细胞上清液HBV颗粒。制备HBV特异性探针，以Southern印迹法检测细胞株内HBV核心颗粒DNA。结果获得含1．2倍体HBVDNA的重组载体，即pREP—HBV，该重组载体转染HepG2细胞后，获得5株潮霉素抗性细胞RHBV1～RHBV5。均能表达HBsAg和HBeAg。Southern印迹结果显示各株细胞均可见明显的杂交拖带，即存在HBVDNA复制中间体。细胞培养上清液浓缩后在电子显微镜下可见成簇的、直径约42nm的HBV颗粒及直径为22～26nm的球形颗粒。结论 成功建立了HBV稳定复制及表达的HepG2细胞株，目前细胞已传代50次，每3天1次。     

鸭乙型肝炎病毒体液免疫血清学指标的系统建立与应用

目的：建立简便,特异的鸭乙型肝炎病毒（DHBV）感染及免疫血清学检测系统。方法：制备、纯化检测所需同的抗DHVB前S区单克隆抗体腹水,DHBsAg和rDHBcAg , 对随机筛选的80份感染血清及实验感染1日龄重庆麻鸭系列血清分别进行DHBsAg 和抗－DHBc,抗－DHBs检测。结果：PCR方法检测出阳性66份,阴性14例,选用PCR阳性的66份标本,经HDBsAg ELISA检测出58份阳性,斑点杂交检出阳性份数为62份。与DHBVRCR相比较,灵敏度分别为87．9％和93．9％,而8只实验感染鸭仅2只在感染后第3周血清抗－DHBc阳性,抗体效价为1：10,至第4周一已为阴性,抗－DHBs则在所有标本均为阴性,结论：DHBV感染及免疫血清学酶联免疫方法的建立,为进一步研究DHBV感染后腹制规律及体风免疫应答状况奠定了基础。     

乙型肝炎病毒总DNA、共价闭合环状DNA和HBsAg在各种慢性乙型肝炎病毒感染者中的定量检测

目的 定量检测慢性乙型肝炎(CHB)、乙型肝炎肝硬化(LC)、肝细胞癌(HCC)患者HBV总DNA(tDNA)、HBV共价闭合环状DNA (cccDNA)和HBsAg,并探讨其特点.方法 荧光定量PCR检测21例CHB、23例LC和25例HCC患者外周血和肝组织标本HBV tDNA、HBVcccDNA,化学发光法定量检测外周血HBsAg.正态数据采用ANOVA分析和t检验,相关性分析采用Pearson检验,非正态数据采用秩和检验.结果 在CHB、LC和HCC患者中,外周血HBVtDNA分别为(5.38±2.08)、(4.96±1.65)和(4.18±0.91)lg拷贝/mL,肝组织HBV tDNA分别为(7.18±1.91)、(6.51±1.87)和(5.87±1.47)lg拷贝/μg,肝组织HBV cccDNA分别为(3.53±2.03)、(2.63±2.13)和(0.58±1.40)lg拷贝/μg,外周血H BsAg分别为(3.30±0.65)、(3.12±0.52)和(2.60±1.03)lg IU/mL,CHB与HCC患者比较,差异均有统计学意义(t=2.446,P=0.013;t=2.562,P=0.014;t=5.799,P＜0.01;t=2.709,P=0.003),LC与HCC患者肝组织HBVcccDNA及HBsAg定量比较,差异有统计学意义(t=-3.894,P＜0.01;t=-2.237,P=0.023).外周血均未检出HBV cccDNA.HBsAg定量与外周血HBV tDNA(r=-0.290,P=0.016)、肝组织HBV tDNA(r=0.372,P=0.002)及肝组织HBV cccDNA(r=0.378,P=0.001)均有关.结论 HBV tDNA、HBV cccDNA、HBsAg在CHB、LC、HCC患者呈逐渐降低趋势,HBsAg定量与外周血HBV tDNA、肝组织HBV tDNA及肝组织HBV cccDNA有关.