MC3T3-E1细胞流体剪切力敏感信号通路的基因芯片研究

目的 探讨适宜流体剪切力力值及作用时间下成骨细胞差异表达基因及相关信号通路。方法 通过平行板流室加力装置对盖玻片培养的MC3T3-E1细胞施加流体剪切力,提取总RNA,进行包括44 170个基因的全功能组表达谱基因芯片检测,对差异表达基因进行Pathway和GO分析,并采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（RTPCR）RTPCR）对芯片结果进行验证。结果 芯片结果显示,差异基因共有884个,其中表达增强基因444个,表达降低基因440个。Pathway分析涉及的信号通路,主要包括Notch信号通路、RIG-Ⅰ样受体信号通路等。GO分析主要涉及前列腺素的生物合成、一氧化氮介导的信号传导、钙介导的信号及细胞免疫反应等不同的功能分类。结论 流体剪切力对MC3T3-E1细胞的保护作用可能与激活促进细胞生存及抑制细胞凋亡相关信号通路及生物学过程相关。     

PD1免疫治疗前后口腔癌患者T细胞免疫功能的变化

目的 本研究拟通过检测口腔癌患者PD1免疫治疗前后外周血中T淋巴细胞各亚群的表达情况,探讨肿瘤患者机体免疫系统发生的变化。方法 本项目拟采用2019年10月至2020年9月于河北医科大学第四医院60例经手术后病理证实口腔鳞癌的患者为研究对象,并给予PD1免疫治疗。用流式细胞仪检测CD4+T细胞和CD8+T细胞在T淋巴细胞中的百分比,计算CD4+T细胞/CD8+T细胞的比值。ELISA法检测口腔癌患者PD1免疫治疗前后血液中的IFN-γ和IL-2水平。结果 经过PD1治疗后,口腔癌患者血液中IFN-γ、IL-2含量、CD4+T细胞百分比及CD4/CD8+T细胞比值都明显升高(P<0.001);在PD1治疗后,口腔癌患者血液中CD8+T细胞百分比的含量显著降低（P<0.001）,口腔癌患者在接受PD1免疫治疗之后,患者的免疫功能显著增强。结论 运用PD1免疫治疗口腔癌患者,治疗前后患者T细胞免疫功能明显增强,具有一定的临床应用价值与应用前景,为临床上应用针对口腔癌的免疫治疗提供理论依据。     

Treg 细胞介导的免疫应答在牙周炎小鼠中的研究

目的:研究牙周炎小鼠中调节性T(Treg)细胞介导的免疫应答情况。方法:将8只7周龄C57BL/6雌性小鼠随机分为2组(n=4)。通过口腔涂抹牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)建立牙周炎模型,对照组口腔涂抹羧甲基纤维素。涂抹结束后第4周处死小鼠,流式细胞仪检测CD4+叉头翼螺旋转录分子(Foxp3)+细胞;ELISA检测转化生长因子(TGF)-β1和白细胞介素(IL)-10的表达。结果:牙周炎小鼠牙龈、颈部淋巴结和外周血中CD4+Foxp3+细胞在CD4+T细胞中的比例降低(P<0.01)。牙周炎小鼠TGF-β1在牙龈组织中的表达以及IL-10在牙龈、颈部淋巴结和血清中的表达增高(P<0.05)。结论:在牙周炎的发病过程中,Treg细胞介导的免疫应答减弱,牙龈、颈部淋巴结和外周血可能是牙周炎中Treg细胞主要的细胞来源。     

口腔癌患者手术前后外周血免疫指标的检测及其临床意义

目的 探讨口腔癌患者手术前后免疫功能状态变化及其临床应酬意义。方法：采集口腔癌患者手术前后的外周静脉血，流式细胞仪检测CD3 总T淋巴细胞、CD4 辅助性T细胞、CD8 杀伤，抑制性T细胞、CD4 ，CD8 比值、CDl9 总B淋巴细胞、CDl6 /CD56 NK细胞。酶联免疫吸附法(ELISA)检测外周血肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和可溶性白细胞介素-2受体(sIL-2R)的表达。采用配对t检验进行统计学分析结果：口腔癌术后外周静脉血CD8 杀伤／抑制性T细胞显著减少，CD4 ／CD8 细胞比值显著升高，CDl9 总B淋巴细胞明显升高．CDl6 /CD56 NK细胞显著减少．TNF-α的表达明显减少，其余变化无显著性差异：结论：手术虽然影响口腔癌患者的免疫功能，但减轻肿瘤患者的免疫抑制状态。术后辅助治疗尤其是免疫治疗．对口腔癌患者具有重要意义，     

TNF-α刺激下牙周膜干细胞与CD3+T细胞共培养对Wnt/β-catenin信号通路的影响

目的:探讨炎症条件下牙周膜干细胞与CD3⁺T细胞共培养对经典Wnt/β-catenin信号通路的影响。方法:拔除健康前磨牙及第三磨牙,获取健康牙周膜干细胞(H-PDLSCs);人外源性TNF-α炎症因子10ng/mL刺激PDLSCs(I-PDLSCs)。免疫荧光染色检测H/I-PDLSCs Wnt通路蛋白β-catenin和LEF-1的表达。采用免疫磁珠法获取人的CD3⁺T细胞。H/I-PDLSCs与CD3⁺T细胞分别以1∶10,1∶20,1∶50,1∶100共培养,共培养48h,提取各组PDLSCs的RNA,反转录为c DNA后,qPCR检测β-catenin、LEF1、TCF4的基因表达;以上述比例共培养后收集各组细胞进行流式细胞仪细胞周期检测。结果:免疫荧光检测I-PDLSCs组β-catenin、LEF-1的表达强于H-PDLSCs组。共培养比例为1∶20和1∶50时,H-PDLSCs组β-catenin、LEF1的mRNA表达水平均降低;1∶20时TCF4 mRNA的表达水平增加,1∶50时降低。1∶20时,I-PDLSCs组β-catenin、LEF1的mRNA表达水平均增加,而在1∶50时基因的表达水平均降低。1∶20及1∶50时TCF4的表达水平均降低。H-PDLSCs与CD3⁺T细胞共培养比例为1∶10时与H-PDLSCs对照组相比其增殖指数显著提高;1∶20、1∶50及1∶100时其PI指数显著降低。I-PDLSCs与CD3⁺T细胞共培养比例为1∶10、1∶50及1∶100时与I-PDLSCs对照组相比其增殖指数显著降低(P<0.05)。结论:炎症条件可激活牙周膜干细胞的Wnt/β-catenin信号通路,H/I-PDLSCs与CD3⁺T细胞以1∶20、1∶50可稳定的下调Wnt/β-catenin经典信号通路,证实Wnt通路参与炎症条件下PDLSCs的免疫调节。     

口腔鳞状细胞癌转移相关基因实时定量PCR的验证

目的 对应用基因表达谱芯片从高低转移潜能的口腔鳞癌细胞系中筛选出的差异表达基因,进行基因转录水平的定量验证,筛选转移相关的基因.方法 选择基因表达谱芯片检测发现的、在高低转移潜能的口腔鳞癌细胞系中的差异表达基因,应用实时定量PCR定量检测方法,在口腔鳞癌低转移细胞系Tca8113及其配对的高转移亚细胞系Tb细胞中,进行基因转录水平的检测.将两种检测结果进行对比分析,筛选出可能与口腔鳞癌转移有关的基因或信号转导通路.结果 选择9个基因进行研究.其中有6个基因在高转移的Tb细胞中高表达,1个基因表达下调,2个基因在Tb和Tca8113细胞中表达无明显差异.实时定量PCR检测结果与基因芯片结果的符合率为66.7%.NF-κB信号转导通路中的主要基因A20、IκBα、TANK和p65在Tb细胞中表达明显上调.结论 NF-κB信号通路和其它一些基因,如IER3、CD44和GPMNB可能在口腔鳞状细胞癌侵袭和转移过程中发挥重要作用,这些基因和信号通路为深入研究口腔鳞癌转移的分子机理和治疗靶点奠定了基础.     

NLRP1在头颈部鳞癌中的表达及预后意义

目的: 研究含热蛋白结构域的NOD样受体蛋白1（NLRP1）在头颈部鳞癌（HNSCC）中的表达、预后价值及免疫相关性。方法: 通过基于癌症基因组图谱 (TCGA) 数据库的多个在线网站,分析NLRP1表达及在HNSCC中的预后价值,并通过GO、KEGG分析,明确其参与的生物过程及信号通路。结果: NLRP1在HNSCC中上调,NLRP1的高表达与较长的总生存期呈正相关。功能网络分析及共表达分析表明,NLRP1与先天免疫及炎症等相关,在多个免疫相关的信号通路中发挥作用。此外,在HNSCC中,NLRP1的表达与中性粒细胞、CD4⁺ T细胞、树突状细胞的浸润呈正相关,NLRP1与HNSCC中的多种免疫标志物相关。结论: NLRP1在HNSCC中高表达,NLRP1的高表达可改善预后,可作为HNSCC的潜在预后标志物。NLRP1在先天免疫反应和炎症反应中发挥作用,NLRP1高表达与HNSCC中CD4⁺ T细胞、中粒细胞、树突状细胞的浸润程度呈正相关。     

TNF-α刺激下人牙周膜干细胞对CD3+T细胞功能的影响

目的:研究在TNF-α刺激下牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)对CD3+T细胞功能的影响.方法:分别获取20-30岁患者的健康离体牙8例,分离培养获得PDLSCs;采用免疫磁珠法分离获取20-30岁健康患者的CD3+T细胞;PDLSCs与CD3+T细胞共培养,PDLSCs加炎症因子(TNFα 10ng/mL)与CD3+T细胞共培养,PDLSCs与CD3+T细胞比例分别为1∶10、1∶20、1∶50、1∶100,共培养时间为48h;共培养48h后分别提取不同组的RNA并反转录为cDNA,检测凋亡、炎症及增殖相关基因的变化.结果:两组细胞生长状态良好;随共培养组PDLSCs比例的降低,正常共培养组CD3+T细胞caspase3/8、IL-6,TNFα mRNA表达水平均降低,在1∶50时趋于稳定;随共培养组PDLSCs比例的降低,炎症因子共培养组CD3+T细胞caspase3/8、IL-6、TNFα mRNA表达水平均降低,在1∶20时趋于稳定.当PDLSCs与CD3+T细胞比例分别为1∶20时H-PDLSCs(Healthy-Periodontal ligament stem cells)、I-PDLSCs(Inflammatory-Periodontal ligament stem cells)对CD3+T细胞CCND-1基因有显著抑制作用,H-PDLSCs对CD3+T细胞CCND-1的抑制作用最显著.结论:在恰当的比例时,正常及炎症PDLSCs对CD3+T细胞的凋亡及炎症因子分泌均有抑制作用,在PDLSCs与CD3+T细胞比例1∶20时,可能是由于炎症因子的存在增强了其抑制作用.     

SD大鼠经鼻黏膜免疫牙周炎基因疫苗pVAX1-HA2-FimA-(IL-15)后Tfh细胞的变化

目的:观察SD大鼠经鼻黏膜免疫牙周炎基因疫苗后Tfh细胞的变化,探讨Tfh细胞在黏膜免疫应答产生特异性sIgA抗体中的作用。方法:采用鼻滴方式免疫SD大鼠,A组为生理盐水组,B组为空载体(pVAX1)组,C组为牙周炎疫苗pVAX1-HA2-FimA-(IL-15)组,ELISA法检测大鼠唾液中特异性sIgA抗体的水平;流式细胞技术检测鼻黏膜Tfh细胞及CD4+CXCR5+ICOS+Tfh细胞的表达。结果:第3~7周C组大鼠唾液中特异性sIgA抗体表达水平高于A组和B组(P<0.05);C组FITC(CD4)和Aleax flour 594(CXCR5)融合后呈黄色荧光,A组和B组的免疫荧光双染结果中未见双阳性荧光信号;C组大鼠鼻黏膜细胞中CD4+CXCR5+Tfh及CD4+CXCR5+ICOS+Tfh细胞的表达均高于A组和B组(P<0.05);且发现大鼠唾液中特异性sIgA与大鼠鼻黏膜CD4+CXCR5+Tfh及CD4+CXCR5+ICOS+Tfh细胞均呈正相关关系。结论:牙周炎基因疫苗pVAX1-HA2-FimA-(IL-15)经鼻黏膜免疫大鼠后可激活Tfh细胞在鼻黏膜的表达,表达水平与特异性sIgA抗体水平呈正相关关系,说明Tfh细胞可能在促进机体产生特异性sIgA抗体的过程中起到重要作用。     

TNF-α刺激下人牙周膜干细胞对CD3+T细胞功能的影响

目的:研究在TNF-α刺激下牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)对CD3+T细胞功能的影响.方法:分别获取20-30岁患者的健康离体牙8例,分离培养获得PDLSCs;采用免疫磁珠法分离获取20-30岁健康患者的CD3+T细胞;PDLSCs与CD3+T细胞共培养,PDLSCs加炎症因子(TNFα 10ng/mL)与CD3+T细胞共培养,PDLSCs与CD3+T细胞比例分别为1∶10、1∶20、1∶50、1∶100,共培养时间为48h;共培养48h后分别提取不同组的RNA并反转录为cDNA,检测凋亡、炎症及增殖相关基因的变化.结果:两组细胞生长状态良好;随共培养组PDLSCs比例的降低,正常共培养组CD3+T细胞caspase3/8、IL-6,TNFα mRNA表达水平均降低,在1∶50时趋于稳定;随共培养组PDLSCs比例的降低,炎症因子共培养组CD3+T细胞caspase3/8、IL-6、TNFα mRNA表达水平均降低,在1∶20时趋于稳定.当PDLSCs与CD3+T细胞比例分别为1∶20时H-PDLSCs(Healthy-Periodontal ligament stem cells)、I-PDLSCs(Inflammatory-Periodontal ligament stem cells)对CD3+T细胞CCND-1基因有显著抑制作用,H-PDLSCs对CD3+T细胞CCND-1的抑制作用最显著.结论:在恰当的比例时,正常及炎症PDLSCs对CD3+T细胞的凋亡及炎症因子分泌均有抑制作用,在PDLSCs与CD3+T细胞比例1∶20时,可能是由于炎症因子的存在增强了其抑制作用.     

Tim-3在口腔鳞癌患者外周血NK细胞的表达及意义

目的:探讨T细胞免疫球蛋白粘蛋白分子-3(Tim-3)在口腔鳞癌患者外周血自然杀伤细胞(NK细胞)上的表达及其临床意义.方法:应用流式细胞仪检测72例口腔鳞癌患者和40例健康对照者外周血CD3-CD56+ NK细胞表面Tim-3表达水平,分析其与口腔鳞癌患者临床病理特征的关系.结果:口腔鳞癌患者外周血NK细胞的百分率为(9.30±2.52)％,显著低于健康对照组(17.36±3.15)％ (P＜0.001).口腔鳞癌患者外周血NK细胞表达Tim-3的百分率为(14.35±6.35)％,显著高于健康对照组(1.78±0.86)％(P＜0.001),且与肿瘤临床分期、分化程度及淋巴结转移显著相关(P＜0.01).结论:口腔鳞癌患者外周血NK细胞表达降低,Tim-3在口腔鳞癌NK细胞的表达上调可能与口腔鳞癌的发生发展有关.     

动态营养支持对口腔颌面肿瘤术后能量代谢、免疫功能及应激反应的影响

目的：观察动态营养支持对口腔颌面部肿瘤患者术后能量代谢、免疫功能及应激反应的影响。方法：选取口腔颌面部肿瘤手术患者56例,随机分为实验组（28例）和对照组（28例）。实验组术后根据应激期给予动态肠内、肠外营养支持,并添加ω-3鱼油脂肪乳注射液及谷氨酰胺;对照组常规术后肠内、肠外营养支持。分别于术前1 d、术后2 d及7 d检测能量代谢、免疫功能及应激指标。采用SPSS 19.0软件包对数据进行统计学分析。结果：实验组前白蛋白术后第2天及血清白蛋白、前白蛋白术后第7天能量代谢指标高于对照组,实验组空腹血糖、甘油三酯术后第2天及第7天均显著低于对照组（P<0.05）。实验组术后第7天IgA、IgG、IgM、CD3⁺、CD4⁺、CD4⁺/CD8⁺水平显著高于对照组（P<0.05）。实验组术后第2天IL-6以及术后第7天CRP、TNF-α、IL-6水平显著低于对照组（P<0.05）,2组术后并发症无显著差异。结论：动态营养支持可以改善口腔颌面肿瘤术后能量代谢,提高机体免疫功能,缓解应激反应。     

基于生物信息学分析鉴定人牙周炎牙龈组织中的关键生物标志物及相关免疫细胞浸润

目的:通过生物信息学分析鉴定牙周炎牙龈组织中的关键生物标志物和相关免疫细胞浸润,探索牙周炎的发病机制。方法:从GEO数据库下载GSE10334、GSE16134和GSE23586三个数据集,通过“limma”程序包筛选差异基因,利用STRING和Cytoscape构建蛋白互作(protein-protein interaction,PPI)网络来获取毂基因,利用CIBERSORT算法分析牙周炎和健康对照之间牙龈组织的免疫细胞浸润。结果:共筛选出129个差异表达基因,构建PPI网络后获取10个毂基因,其显著富集于趋化因子和细胞因子活性等多种细胞生理活动,和细胞因子-细胞因子受体相互作用信号通路、趋化因子信号通路、IL-17信号通路。与健康对照组相比,牙周炎牙龈组织中初始B细胞、浆细胞、初始CD4+T细胞、活化的记忆CD4+T细胞、单核细胞,M1巨噬细胞和中性粒细胞的比例更高(P<0.05)。结论:毂基因的功能分析及探究牙周炎和健康牙龈中所浸润的免疫细胞之间的差异可以为研究牙周炎的发生发展机制提供新的见解和思路。     

Lack of evidence for local immune activity in oral hairy leukoplakia and oral wart lesions

BACKGROUND: Oral warts, caused by human papillomavirus (HPV), and oral hairy leukoplakia (OHL) caused by Epstein-Barr virus (EBV), are common oral manifestations in HIV-infected persons. Although both conditions occur most often with reduced blood CD4+ T-cell numbers, oral warts and OHL rarely occur simultaneously, suggesting that dysfunctions in other secondary local immune parameters are also involved. The present study evaluated tissue-associated proinflammatory and T-helper cytokine and chemokine mRNA expression and the presence of T cells in each lesion. METHODS: Biopsies were taken from lesion-positive and adjacent lesion-negative sites of HIV+ persons with oral warts or OHL and lesion-negative sites from HIV+ persons who were oral HPV or EBV DNA-positive (matched controls). Cytokine/chemokine mRNA expression was quantified by real-time polymerase chain reaction. CD3, CD4, and CD8 cells were identified by immunohistochemistry. RESULTS: No differences were detected in tissue-associated cytokine/chemokine mRNA expression in warts or OHL when compared to lesion-negative sites. Immunohistochemical analysis of T cells showed CD8+ cells exclusively, but few cells were present in either lesion. No differences were detected between lesion-positive and -negative control sites of each pathologic condition. CONCLUSION: Little evidence was found for local immune reactivity to either oral warts and OHL, suggesting that CD4+ T cells are a primary host defense against both oral warts and OHL, but with nonimmune factors potentially responsible for the divergent prevalence of each.     

Inflammatory cell infiltrate associated with primary and transplanted tumours in an inbred model of oral carcinogenesis

This study characterised the nature of the local cellular immune responses associated with an inbred animal model of oral carcinogenesis. Inbred F344 rats developed moderately- to well-differentiated primary oral squamous cell carcinomas (SCC) after treatment with the carcinogen 4-nitroquinoline N-oxide (4-NQO) in vivo for 5–6 months. The inflammatory cell infiltrate associated with the primary tumours was predominantly of the macrophage lineage (CD45⁺, Ia⁺) and contained smaller numbers of CD8⁺ cells (NK cells, cytotoxic/suppressor T cells), CD5⁺ cells (T cells) and CD25⁺ cells (activated cells; T and NK cells). Keratinocyte cell lines were established from three lingual and one palatal SCC. By contrast to normal keratinocytes, tumour-derived cell lines were immortal and independent of 3T3 fibroblast support. All of the tumour-derived cell lines were tumorigenic in athymic ( nu/nu ) mice and showed contrasting latent periods of tumour development and histological differentiation; normal keratinocyte grafts were non-tumorigenic in athymic mice. Three of four malignant cell lines formed well-differentiated tumours in syngeneic F344 rats; the tumours regressed after 10–14 days. Regressing grafts contained significantly larger numbers of NK cells (CD5^-, CD8⁺) in the inflammatory cell infiltrate compared with that associated with primary tumours (p<0.04). One malignant cell line and normal keratinocytes were non-tumorigenic in syngeneic hosts. The results demonstrate phenotypic variation in the cell-mediated immune responses associated with the actively growing primary SCC and the regressing tumours in syngeneic hosts and suggest that NK cells, possibly activated by local T cell responses, are important for tumour rejection in this model.     

Expression of TGF-beta receptors in CD8+ T cells of oral lichen planus

OBJECTIVE: To investigate the expression of TGF-beta receptors in CD8+ T cells of oral lichen planus (OLP). METHODS: Immunohistochemical double labeling technique was used to examine the expression of TGF-betaR I and TGF-betaR II in CD8+ T cells of 28 OLP patients and in 10 controls. The results were compared between the two groups. RESULTS: The double labeled cells were negative in controls. The positive rates of double labeled cells of CD8+/TGF-betaR I and CD8+/TGF-betaR II in OLP were (8.82 +/- 9.98)% and (1.11 +/- 2.94)% respectively. CONCLUSIONS: The expression level of TGF-betaR II in CD8+ T cells of OLP did not increase compared with the controls, but the expression of TGF-betaR I increased. The results indicate the abnormal TGF-beta signal transduction in CD8+ T cells of OLP, which may contribute to the persistence of the chronic inflammation in OLP.     

口腔颌面部肿瘤患者T淋巴细胞亚群的检测及其与临床预后关系的研究

目的：了解口腔颌面部鳞癌患者细胞免疫功能状态。方法：应用流式细胞术对19例口腔颌面部鳞癌患者及10例正常人外周血中T淋巴细胞亚群水平进行了检测。结果：口腔颌面部鳞癌患者外周血中的CD3细胞数较健康人低下（P＜0．05），CD4、CD4／CD8下降，而CD8升高。晚期、分化差及有颈淋巴结转移的患者，其CD3、CD4、CD4／CD8较早期、分化好及无颈淋巴结转移的患者低，而CD8则相对较高。结论：口腔颌面部鳞癌患者的细胞免疫功能低下，且可能与肿瘤的临床分期及病理分级有一定的关系。     

Changes in peripheral blood lymphocyte phenotypes distribution in patients with oral cancer/oral leukoplakia in Taiwan

Oral squamous cell carcinoma (OSCC) is common in many Asian countries. The immunopathogenesis of OSCC is unclear. The authors analyzed the lymphocyte subtypes and surface activation markers in healthy Taiwanese people (n = 130) and patients with OSCC (n = 97)/oral leukoplakia (OL, n = 28) using flow cytometry. Univariate analysis found an elevation in the percentage of CD56+ NK cells, CD4+/CD69+ T cells, CD19+/CD69+ B cells and CD56+/CD69+ NK cells in OSCC patients relative to healthy people. The CD19+ and CD19+/CD25+ lymphocyte subtypes decreased in OSCC patients. CD56+ NK cells increased in OL patients. CD56+/CD69+ NK cells were elevated in recurrent and advanced OSCC. Multivariate analysis revealed an increase in CD56+ NK and CD19+/CD69+ cells in OL patients relative to controls. CD19+ B cells declined during progression from OL to OSCC. Betel quid chewing, alcohol, smoking, tumour location and staging showed little effect on lymphocyte subtypes. These results suggest that alterations and activation of NK cells, T and B cells are important and associated with disease status in oral carcinogenesis.