Cdx2基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建尾型同源盒基因Cdx2 RNA干扰(RNAi)慢病毒表达栽体并进行鉴定.方法:选取Cdx2基因的19 nt特异性序列,设计针对Cdx2的shRNA序列,应用基因重组技术插入到pLentiLox3.7(pLL3.7)慢病毒表达栽体中,Xba Ⅰ和Not Ⅰ进行双酶切和DNA测序鉴定重组克隆,重组病毒质粒及其3种辅助包装原件载体质粒通过LipofectamineTM2000共转染293T细胞,培养48 h后,收集细胞培养上清液,将其浓缩后在293T细胞中测定病毒滴度.结果:通过对pLL-Cdx2-shRNA载体进行双酶切鉴定,证实短发夹RNA正确插入慢病毒载体,DNA测序证实插入的序列正确,Cdx2基因RNA干扰重组慢病毒载体经293T细胞包装成功,收集293T细胞分泌的病毒上清测定病毒的滴度为5×107TU/mL.结论:成功构建A.Cdx2基因RNAi慢病毒栽体,为研究Cdx2对胃癌生长的影响提供了稳定感染细胞载体.     

携带人HCN4与Tbx3基因慢病毒的构建

目的:构建携带人环核苷酸门控离子通道基因(HCN4)、发育调控相关转录因子基因(Tbx3)及增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)的慢病毒载体,获得可供转染的滴度,为进一步研究Tbx3对HCN4异位表达及细胞起搏功能的影响提供高效的慢病毒转基因平台。方法:应用聚合酶链反应(PCR)方法,扩增HCN4及Tbx3基因,利用Gateway技术分别构建出HCN4-Tbx3-EGFP、HCN4-EGFP、Tbx3-EGFP、EGFP 4种慢病毒表达载体。经PCR及基因测序鉴定后,脂质体法转染293FT包装细胞,产生相应慢病毒,测定其滴度,荧光显微镜下观察EGFP的表达。结果:PCR和测序证实,构建出携带有HCN4-Tbx3-EGFP、HCN4-EGFP、Tbx3-EGFP及EGFP基因的慢病毒表达载体。分别转染293FT细胞后,荧光显微镜下可见大量绿色荧光,病毒滴度测定结果分别为4.7×107TU/ml、5.2×107TU/ml、4.5×107TU/ml、6.65×107TU/ml。结论:成功构建同时携带HCN4、Tbx3基因及EGFP基因的慢病毒载体并包装出具高效感染力的慢病毒颗粒,为通过HCN4联合Tbx3基因长期稳定的表达来构建窦房结细胞的实验研究提供高效稳定的转基因技术平台。     

CDK2 shRNA慢病毒载体的构建及其基因沉默效应

目的构建CDK2 shRNA慢病毒载体,并在黑色素瘤细胞B16-F1中鉴定其基因沉默效应。方法体外构建3个慢病毒重组目的质粒p UL-CDK2-shRNAs和1个阴性对照慢病毒重组质粒p UL-NC-shRNA,转化感受态细胞,PCR鉴定后进一步测序验证;293T细胞中测定病毒滴度;用重组慢病毒感染B16-F1细胞测定其感染效率,RT-PCR和Western印迹检测其对B16-F1细胞中CDK2的基因沉默效应。结果 PCR鉴定后进一步测序表明,成功构建了重组慢病毒质粒;病毒滴度为4.5×107~5.5×107TU/ml;用重组慢病毒感染B16-F1细胞,当感染复数(MOI)为10时,感染效率可达90%;RT-PCR和Western印迹结果表明,与未感染组和NC-shRNA感染组细胞相比,CDK2-shRNA1、CDK2-shRNA2、CDK2-shRNA3感染的细胞中CDK2 mRNA和蛋白表达均受到不同程度抑制(P0.05),以CDK2-shRNA3感染组的抑制率最高,RT-PCR和Western Blot检测其抑制率分别为78.5%±4.23%和70.5%±3.54%。结论利用RNAi技术成功构建了3种CDK2-shRNA重组慢病毒载体,均可有效感染B16-F1细胞并具有一定的基因沉默效应,其中以针对靶位点1012-1020的p UL-CDK2-shRNA3基因沉默效应最强,为进一步研究CDK2基因沉默对黑色素瘤化疗敏感性的影响奠定了基础。     

AQP5基因重组慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建人水通道蛋白5（AQP5）基因慢病毒载体。方法体外扩增出AQP5基因全长cDNA,将慢病毒载体pWPTS-GFP与扩增出的AQP5用MluⅠ和SalⅠ进行双酶切,将AQP5全长序列克隆入pWPTS-GFP,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,对长出的克隆用菌落PCR鉴定,再对阳性克隆进行测序和比对分析。重组病毒质粒与另外两种辅助包装原件载体质粒通过CaCl2共转染293T细胞（人胚肾细胞）,培养48 h后收集细胞培养上清液,将病毒浓缩后在293T细胞中测定病毒滴度,并检测慢病毒载体在工具细胞SGC7901细胞（胃癌细胞）的转染效率。Western blot检测SGC7901细胞中AQP5蛋白。结果测序结果和Western blot检测均证明AQP5重组慢病毒载体构建正确,并能在细胞中正确表达。与辅助质粒共转包装细胞获得慢病毒颗粒,并成功感染SGC7901细胞。包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为1×108 TU/ml。结论成功构建了稳定表达AQP5基因的重组慢病毒载体。     

ECEL1基因PSCSI-GFP慢病毒载体的构建

目的设计并构建针对ECEL1基因的RNA干扰慢病毒载体。方法依照ECEL1基因为模板,设计RNA干扰靶点,根据选定的靶点序列,设计短发夹RNA(shRNA)干扰序列,在两端添加相应的限制性内切酶酶切位点,合成单链DNA oligo,退火缓冲液中配对形成双链DNA oligo。利用Age I和EcoR I双酶线性化GV115载体。把载体和DNA oligo相连接,其连接产物转化大肠杆菌感受态细胞,经PCR扩增并测序鉴定。再通过质粒抽提,转染,浓缩与纯化后获得重组的ECEL1基因RNAi慢病毒,用"HIV-1p24抗原ELISA法"测定样品滴度。选取检测合格的慢病毒感染人肝癌细胞(BEL-7404),并设置对照组,荧光观察感染率。并使用Real-time PCR法及Western blot检测人肝癌细胞(BEL-7404)中ECEL1基因敲减后mRNA和蛋白质的表达量。2组间比较采用两独立样本t检验。结果 (1)根据ECEL1基因模板设计后,选定psc48784片段作为RNA干扰靶点,制备双链DNA oligo,PCR鉴定阳性重组子并测序,验证psc48784为正确的克隆。经过质粒抽提,转染以及浓缩纯化后,成功构建ECEL1基因RNAi慢病毒。物理检测与无菌检测合格。(2)通过HIV-1 p24抗原ELISA法测定ECEL1基因RNAi慢病毒样品病毒滴,测定样品病毒滴度为3×108TU/ml;表明已成功构建高滴度且合格的ECEL1基因RNA干扰慢病毒。(3)用ECEL1基因RNAi慢病毒感染人肝癌细胞(BEL-7404),荧光观察结果显示细胞感染效率达到80%,细胞状态稳定;使用Real-time PCR的方法及Western blot检测实验组人肝癌细胞(BEL-7404)中ECEL1基因在mRNA和蛋白质水平的表达量受到抑制(P值均0. 05),敲减效率达到70. 5%。结论成功构建ECEL1基因PSCSI-GFP慢病毒载体并获得稳定高滴度的病毒样品,并获得稳定的ECEL1基因敲减的人肝癌细胞(BEL-7404)。     

慢病毒载体在RNA干扰中的应用

慢病毒载体是以人类免疫缺陷1型病毒为基础发展起来的基因治疗载体.区别一般的逆转录病毒载体,它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力.该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久件表达.在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞,从而达到良好的基因治疗效果.RNA干扰技术是近年来发展起来的新技术,通过产生针对特定基因的小分子干扰RNA,能高效特异地抑制特定基因的表达,在探查基因功能和治疗人类疾病方面有广阔的应用前景.     

解偶联蛋白-2基因过表达慢病毒载体的构建

目的构建解偶联蛋白-2（UCP-2）基因慢病毒表达载体。方法用RT-PCR技术从转基因肥胖小鼠肝脏组织中获得UCP-2基因编码区片段,用In-Fusio技术将PCR产物连接入Age I单酶切后的慢病毒转移质粒体pGC-FU,进行鉴定及序列测定。将构建成功的转移质粒和两种辅助包装原件载体质粒pHelper1.0、Helper2.0（VS-VG元件）共转染293T细胞,包装成慢病毒,浓缩纯化后检测滴度。结果RT-PCR产物经电泳证实成功获取UCP-2基因cDNA克隆,鉴定证实慢病毒转移质粒连接构建正确,病毒包装滴度为2×108TU/ml。结论成功构建了UCP-2基因慢病毒表达载体。     

survivin基因靶向RNAi慢病毒载体的构建及意义

利用sidirect设计干扰stirvivin基因靶序列,合成回文DNA序列退火后克隆至vshRNA载体,双酶切电泳鉴定和测序分析及阳性克隆质粒抽提,慢病毒质粒DNA再转染293T细胞产生病毒,测定病毒滴度.转染A549细胞株,采用逆转录RT-PCR测定不同分组A549细胞中survivin mRNA.vshRNA载体经双酶切电泳鉴定和DNA测序分析,证实插入序列与原序列一致,位置正确.靶向survivin基因的siRNA可以有效抑制survivin基因的表达,RNAi抑制效率＞90%.认为survivin基因的表达siRNA慢病毒载体的构建成功,为研究肺癌分子病因和基因治疗提供依据,为研究高表达Buryivin的其他肿瘤构建了新的平台.     

miR-122慢病毒载体的构建及其在肝癌细胞中的作用

目的构建慢病毒载体并探讨稳定表达的miR-122在肝癌细胞中的作用。方法将miR-122的前体克隆到慢病毒载体pLUNIG上获得稳定表达miR-122的病毒载体,在293T细胞内进行包装,浓缩获得病毒上清。用病毒上清去感染肝癌细胞HepG2,采用MTT法及克隆增生检测对肝癌细胞增殖的影响,并设空载体组为对照进行分析。各组间均数采用t检验。结果慢病毒质粒Lv-miR122经包装浓缩后收获的病毒上清有效的感染肝癌细胞且miR-122表达显著上调,与慢病毒空载体对照组（Lv-Ctrl）相比,差异具有统计学意义（t=10.745,P〈0.01）;稳定表达的miR-122能明显抑制肝癌细胞的增殖,与Lv-Ctrl和HepG2对照组相比差异有统计学意义（P均〈0.05）;而且miR-122能明显抑制肝癌细胞的克隆增生（t=-5.256,P〈0.01）。结论成功的构建了稳定表达miR-122的慢病毒质粒,并使携带的miR-122能稳定表达且具有抑制肝癌细胞增殖的活性。     

敲低ABCG1慢病毒表达载体的构建及功能检测

目的为探讨人急性单核细胞白血病细胞系(THP-1)中胆固醇转运相关的ABCG1基因的表达对动脉粥样硬化发生发展的作用,构建ABCG1慢病毒干扰载体,并验证干扰效果、进行功能检测。方法针对人ABCG1的cDNA序列,设计两个RNA干扰的寡核苷酸单链DNA。将其插入到慢病毒表达载体上;将构建的载体和包装质粒共转染293T细胞;通过实时荧光定量PCR及蛋白质免疫印迹检测干扰载体对ABCG1表达水平的影响;通过检测外流率进行功能验证。结果构建的ABCG1基因的小干扰RNA慢病毒表达载体感染THP-1细胞可以有效地抑制ABCG1 mRNA和蛋白表达水平,且减少ABCG1介导的胆固醇外流,感染组外流率小于对照组(23.87%±0.45%比30.57%±1.00%,P<0.001)。结论慢病毒表达载体成功敲低THP-1细胞的ABCG1,并为后续的ABCG1在巨噬细胞中生物学作用的研究创造条件。     

mmu_circ_0001033过表达慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建环状RNA mmu_circ_0001033慢病毒表达载体,作为在低氧性肺动脉高压功能学实验研究的基础。 方法首先设计引物将目的基因片段从原质粒上扩增下来,通过引物两端所含无缝克隆识别位点将其重组到酶切后的过表达载体上;将连接产物转入制备好的细菌感受态细胞,而后将其单克隆菌落送测序公司进行测序鉴定。其次通过PCR产物跑胶和测序验证成环情况。最后用构建的重组表达载体和包装质粒共同转染293T细胞,包装慢病毒,收集病毒原液,超滤浓缩,并测定滴度。 结果经过比对,重组克隆中插入片段序列与目的片段序列完全一致,表明质粒构建成功。PCR产物后经sanger测序确认环化位点处序列完全正确。将构建的过表达载体测序结果和质粒构建方案基因比对,重组克隆中插入片段序列与目的片段序列与预期完全一致,可实现转染质粒后目的基因的表达,PCR产物跑胶和测序结果表明mmu_circ_0001033成环成功。PCR产物跑胶和测序结果表明mmu_circ_0001033成环成功。最后通过比较RT-qPCR测定病毒滴度值为2.09×10⁸ TU/ml。 结论成功构建环状RNA mmu_circ_0001033慢病毒表达载体,能稳定转染293T细胞,可用于后续细胞实验。     

Pim-3慢病毒质粒构建及其表达鉴定

目的 构建Pim-3慢病毒质粒,鉴定其在卵巢癌SKOV3细胞中基因及蛋白水平的表达.方法 RT-PCR法提取Pim-3 cDNA,经T-A克隆及双酶切将其与慢病毒表达载体pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP重组;酶切鉴定及基因测序后,将阳性重组质粒导入病毒包装细胞293T中;收集病毒上清液转染SKOV3细胞,荧光显微镜下观察转染情况,应用RT-PCR及Western blot法分别检测Pim-3 mRNA及其蛋白.结果 RT-PCR法获得Pim-3基因,重组质粒酶切后片段大小及基因测序结果显示pCDH/Pim-3重组质粒构建成功.将感染重组质粒及空载体的293T细胞生产的病毒上清分别感染SKOV3细胞,感染重组质粒的SKOV3细胞中Pim-3 mRNA及蛋白表达水平均高于空载体细胞.结论 成功构建了pCDH/Pim-3重组慢病毒质粒,建立了Pim-3高表达SKOV3瞬转细胞模型,为探讨Pim-3在卵巢癌发生、发展中的作用及机制奠定实验基础.     

人CXCR4基因启动子萤光素酶报告载体的构建及鉴定

目的构建并鉴定人CXCR4基因启动子萤光素酶报告载体,为AIDS的靶向基因治疗奠定基础。方法利用PCR技术扩增人CXCR4基因启动子的核心片段,克隆至含新霉素抗性的萤光素酶表达载体pGL3-neo,构建含CXCR4启动子的萤光素酶表达载体pGL3-neo-CXCR4,重组子经双酶切、PCR及测序鉴定。再将构建的载体用脂质体转染体外培养的Jurkat细胞株,检测萤光素酶的表达活性。结果扩增得到CXCR4基因启动子序列,克隆入pGL3-neo-CXCR4的CXCR4基因启动子序列与GenBank报道的一致,实验组（pGL3-neo-CXCR4组）萤光素酶的表达活性为869159．0±62618．8,与空白组（未转染组）的464．2±44．0和对照组（pGL3-neo组）的39088．4±3867．9相比,差异有统计学意义（F=1415．124,P均〈0．05）。结论成功构建了含人CXCR4基因启动子的萤光素酶报告基因表达载体pGL3-neo-CXCR4。     

携带Foxp3基因慢病毒载体的构建

目的构建携带叉头样转录因子p3（Foxp3）基因的重组慢病毒载体PWPXL-MOD-Foxp3,并包装成慢病毒,为体外获得CD4＋CD2＋5调节性T细胞（CD4＋CD2＋5 Tregs）奠定基础。方法采用双酶切法构建慢病毒表达载体PWPXL-MOD-Foxp3,用磷酸钙沉淀法将包装慢病毒所需的四质粒系统共转染人胚肾细胞293T,慢病毒系统转染48h后收集病毒上清液,纯化、浓缩后采用流式细胞术测定慢病毒滴度。结果重组的慢病毒载体滴度为3.3×108IU/ml。结论成功构建了含有Foxp3基因的高滴度的慢病毒载体,为体外获得CD 4＋CD 2＋5 Tregs奠定基础。     

转基因重组质粒ATP4B-SV40T-IRES-GFP的构建及鉴定

目的:构建ATP4B-SV40T-IRES-GFP重组质粒并进行鉴定.方法:根据小鼠ATP4B启动子序列设计引物,获得的小鼠ATP4B基因启动子序列,并加入限制性内切酶酶切位点.将其装入载体IRES-GFP,获得重组载体ATP4B-IRES-GFP并进行酶切鉴定.之后将SV40T基因克隆入ATP4B-IRES-GFP载体,并用限制性内切酶PstI和AseⅠ进行验证.结果:将小鼠ATP4B启动子序列插入IRES-GFP载体,经过酶切验证获得正确的ATP4B-IRES-GFP质粒;将SV40T片段插入ATP4B-IRES-GFP,质粒测序及酶切结果验证获得正确的ATP4B-SV40T-IRES-GFP重组质粒.显微注射入小鼠受精卵可获得阳性小鼠.结论:成功构建ATP4B-SV40T-IRES-GFP重组质粒,可用于下一步构建原发性胃癌转基因小鼠.     

PDK1基因shRNA慢病毒载体构建及干扰效应鉴定

目的 构建PDK1基因短发夹RNA(shRNA)慢病毒载体,鉴定其对PC-3细胞PDK1基因的干扰效应.方法 在GenBank数据库检索PDK1基因序列,参考该序列设计PDK1特异性过干扰序列,酶切过表达用载体LV3,纯化酶切产物后进行定向连接.将重组干扰病毒质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,测定病毒滴度.将构建...     

靶向人 BRG1基因的慢病毒载体构建及效率验证

目的：构建靶向人 BRG1基因的短发夹 RNA（shRNA）慢病毒载体并验证其沉默效率。方法：设计3个针对人 BRG1基因的特异性 shRNA 序列（shBRG1）,构建于 pLKO．1慢病毒载体中,并与 psPAX2和 pMD2．G 质粒共同转染293T 细胞以包装成慢病毒颗粒。将包装好的慢病毒感染人主动脉平滑肌细胞（HASMC）,应用实时荧光定量 PCR 和 western blot 检测 BRG1 mRNA 和蛋白表达水平,判断其沉默效率。结果：3种 shBRG1干扰序列均成功插入慢病毒载体中且测序正确,3种慢病毒均可有效降低 BRG1 mRNA 表达水平（P 均＜0．01）。其中 shBRG1-3的沉默效率最高,其感染HASMC 后 BRG1蛋白表达水平较对照组显著下降（P ＜0．01）。结论：靶向人 BRG1基因的 shRNA 慢病毒表达载体构建成功,shBRG1-3慢病毒能够有效降低 BRG1 mRNA和蛋白表达水平。     

大鼠CREB结合蛋白RNA干扰重组慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建大鼠CREB结合蛋白(CREB binding protein,CBP)基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,并观察该载体对大鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)CBP表达的沉默效应。方法设计合成4条CBP基因的siRNA序列,将筛选确定的CBP RNAi有效靶序列与pFU-GW-iRNA载体连接产生CBP shRNA慢病毒表达载体,转化、PCR筛选阳性克隆及测序鉴定。脂质体2000将CBP shRNA慢病毒载体和慢病毒包装质粒共转染293T细胞,完成慢病毒颗粒包装及滴度测定。包装产生的重组慢病毒感染大鼠VSMCs,实时定量RT-PCR检测CBP mRNA的表达,并与未转染及转染阴性对照shRNA慢病毒的细胞进行比较。结果 PCR扩增和测序结果证实,成功构建大鼠CBP shRNA慢病毒载体。经包装产生的慢病毒滴度为2×10~9 TU/ml,与未转染慢病毒及转染阴性对照shRNA慢病毒的细胞比较,CBP shRNA慢病毒转染可使VSMCs的CBP mRNA分别下降88.5%和92.7%。结论成功构建CBP基因RNAi慢病毒表达载体,对VSMCs的CBP表达具有良好沉默作用,为后期基因治疗血管增殖性疾病奠定基础。