胚胎大鼠神经干细胞双向凝胶电泳方法的建立

背景:神经干细胞是当今研究热点,双向电泳是蛋白质组学研究的技术基础,有必要建立稳定的神经干细胞蛋白质组双向凝胶电泳技术体系.目的:通过对神经干细胞双向凝胶电泳几个关键步骤的分析,建立稳定、重复性好的神经干细胞双向凝胶电泳的分离方法.方法:采用无血清体外细胞培养方法,培养胚胎大鼠神经干细胞并进行鉴定.提取样品蛋白并裂解,被动水化,采用不同IEF参数,使用PDQuest8.0软件对图谱进行分析和比较.观察不同等点聚焦参数下双向电泳图谱质量,蛋白质点的数目及重复性.结果与结论:不同IEF参数条件下的双向电泳图谱的质量有所不同,增加低电压的除盐步骤有助于去除电泳胶图上的横纹.在80 000 Vh聚焦总能量下,获得较理想的电泳图.通过选用适当的IEF参数.建立了适当的神经干细胞双向凝胶电泳方法.     

成年无精子症男性睾丸活检组织双向电泳分析技术的初步建立及其优化

目的:建立并优化成年无精子症男性睾丸活检组织双向凝胶电泳图谱.方法:采用固相pH梯度等电聚焦为第一向,SDS-PAGE垂直电泳为第二向的双向电泳分离技术进行分离,凝胶经银染显色后,用Melanie 4软件分析双向凝胶电泳技术(2-DE)图谱.对聚焦参数的设置和样品的处理等步骤进行优化.结果:优化后成功地获得了成年无精子症男性睾丸活检组织分辨率高、重复性好的双向电泳图谱.结论:应用2-DE初步建立了成年无精子症男性睾丸活检组织分辨率较高且重复性好双向凝胶电泳图谱,为从睾丸蛋白质组学水平进一步研究无精子症奠定了基础.     

心肌线粒体双向凝胶电泳技术分析

目的：建立并优化心肌线粒体蛋白质组研究的双向凝胶电泳（two-dimensional gel electrophoresis，2-DE）技术。方法：分离200g雄性SD大鼠心肌线粒体，抽提心肌线粒体的全蛋白，以固相pH梯度、等电聚焦为第一向和垂直SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳为第二向行双向凝胶电泳，对样品制备、上样量、电泳参数、不同固定方式等相关技术进行优化。凝胶行硝酸银染色，扫描仪获取凝胶图像并用PDQuest软件进行分析。结果：45％乙醇和5％乙酸的固定液对蛋白质固定效果最好；构建了心肌线粒体高分辨率和重复性的双向凝胶电泳图谱。结论：建立了SD大鼠心肌线粒体蛋白质组的双向凝胶电泳分析技术。     

吸烟大鼠淋巴细胞蛋白质组的双向电泳分析

目的应用双向凝胶电泳(Two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)方法分析烟染毒大鼠外周血淋巴细胞蛋白质组表达的改变。方法雄性Wistar大鼠随机分正常对照组和烟染毒组,烟染毒组分小、中、大剂量,分离各组大鼠的外周血淋巴细胞,提取总蛋白,2-DE分离总蛋白,电泳凝胶银染显色,用ImageMaster 2D Platinum软件对获得的蛋白图谱加以分析,寻找差异蛋白点。结果与正常对照组大鼠图谱比较,烟染毒组图谱中与剂量有相关性变化的差异表达蛋白点有10个,其中6个随烟染毒剂量增加表达下降,4个随烟染毒剂量增加表达增强。结论2-DE可以有效分离大鼠外周血淋巴细胞蛋白质,大鼠烟染毒后淋巴细胞蛋白质的表达发生改变。     

宫颈癌蛋白质组提取方法的建立及优化

目的:建立及优化人宫颈癌组织蛋白质提取方法,为下一步寻找差异表达的蛋白质并早期诊断宫颈癌提供新的思路.方法:利用一步法和三步法提取宫颈癌组织蛋白质,并分别用Bradford法测定相应样品总蛋白质浓度,并进行双向丙烯酰胺凝胶电泳分离,观察两种方法提取样品蛋白质含量及2-DE蛋白质图谱高分辨率的情况.结果:三步法提取的宫颈癌组织蛋白质含量较一步法有明显的增高,2-DE蛋白质图谱较一步法清晰、分辨率高.结论:与一步法相比较,三步法具有高蛋白质浓度、高分辨率、高清晰度的二维电泳图谱的优点,利于全面准确地进行蛋白质学研究.     

免疫蛋白质组技术小鼠血清样品处理方法的比较分析

目的:建立适用于侵袭性真菌感染免疫蛋白质组学研究的小鼠血清样品处理方法.方法:用白蛋白和IgG去除试剂盒及CLEAN UP试剂盒处理血清,比较处理与未经处理样品的二维凝胶电泳图谱,以及ECL显色图谱的差异.并对该处理方法的稳定性和重复性进行初步评价.结果:用白蛋白和IgG去除试剂盒及CLEAN UP试剂盒处理小鼠血清样品的二维凝胶电泳图谱有更好的分辨率,其ECL显色图有更高的特异性和敏感性.且该处理方法重复性较好.结论:建立稳定的侵袭性真菌感染小鼠血清样品的处理方法,为进一步开展基于双向电泳的免疫蛋白质组学研究奠定了基础.     

建立人肾小管上皮细胞蛋白质组双向电泳的分离体系

背景:双向电泳分离技术是蛋白质组学研究的核心技术之一,但蛋白质样品的分离效果受各种实验条件的影响较大.因此,针对不同来源的蛋白样品进行实验条件的优化可获得具有较高分辨率的双向电泳图谱.目的:拟建立优化的人肾小管上皮细胞株蛋白质组双向电泳分离体系.方法:常规培养人肾小管上皮细胞株HK-2细胞并裂解提取全蛋白,按标准条件对蛋白质进行双向电泳分离,并对各个关键因素进行优化.等电聚焦采用缓慢升压模式,电泳参数根据Bio-Rad公司的预设方案进行调整.改良硝酸银法进行蛋白质斑点染色.采集电泳图谱并分析双向电泳图谱中蛋白斑点的数量、图像分辨率及背景条纹的变化.结果与结论:通过对实验条件的筛选和优化,成功建立了具有较高的分辨率和重复性的人肾小管上皮细胞蛋白质组双向电泳分离体系.其中,优化后的裂解液配方成分为1%TBP,4%CHAPS,0.2%Bio-Lyte,40mmol/L Tris,8mol/L尿素,2 mol/L硫脲:采用pH 4～7的IPG胶条;上样方式选择被动的水化上样.等电聚焦过程中使用预设的缓慢升压模式,充分聚焦后选用合适的电压模式进行SDS-PAGE电泳,然后采用改良硝酸银法进行染色,最终获得了满意的蛋白质组双向电泳图谱.     

问：双向凝胶电泳面临的问题有哪些？

答：双向凝胶电泳在目前的蛋白质分离科学中仍然占据重要的位置，但其也有局限性：（1）2-DE需要较大样品量，而临床样品通常只能获得有限的样品量。（2）低拷贝蛋白通常不被检出，目前的技术还不足以检出拷贝数低于1000的蛋白质，而这些人体微量蛋白往往还是重要的调节蛋白。（3）极酸或极碱的蛋白分离效果有所欠缺。（4）极大（〉200kD）或极小（〈10kD）蛋白的在电泳过程中易丢失，2-DE不能分辨。（5）疏水膜性蛋白不溶于样品缓冲液，     

建立并优化胃溃疡复发大鼠蛋白质组分析的双向凝胶电泳技术

目的:建立并优化白细胞介素1β致大鼠乙酸性胃溃疡复发模型大鼠蛋白质组分析所需的双向凝胶电泳技术。方法:实验于2005-04/2006-02在中南大学湘雅医院中西医结合研究所实验室、卫生部肿瘤蛋白质组学重点实验室完成。①选用成年SD大鼠60只,雌雄不拘。按随机数字表法分为2组:对照组、模型组,每组30只。采用乙酸复制胃溃疡动物模型及白细胞介素1β复制胃溃疡复发动物模型,正常对照组施予相同的饮食方案。②两组大鼠于复发模型建立成功后24h禁食,48h后处死,收集胃组织,在组织样品离体后立即以冰盐水冲洗以去除组织液和血细胞,并于30min内入液氮速冻,采用化学和高速机械法进行胃组织裂解。采用AmershamBiosciences公司专门针对蛋白质组学研究中的蛋白质抽提方法设计的2DQuantKit定量试剂盒,从而实现准确的蛋白质定量。为了尽量可能多分离蛋白质,选择pH值范围(pH3￣10)的固相线性24cm干胶条和125g/L的均匀SDS聚丙烯酰胺凝胶,采用初始电压为2.5W/胶电泳30min,然后以17W/胶恒功率电泳,直至溴酚蓝指示线到达凝胶底边处停止电泳。结果:以固相pH梯度-IPG胶条(pH3～10)进行第一向等电聚焦,以SDS均一胶(12.5%)的垂直电泳为第二向,成功地得到了两组大鼠胃组织斑点分布均匀、数目较多的双向凝胶电泳图谱。结论:通过对蛋白质双向凝胶电泳的建立及技术的优化,获得了适合于研究胃溃疡复发蛋白质组差异表达。     

血清蛋白质组学研究中乙腈沉淀法去除清蛋白的实验研究

目的 建立去除人血清清蛋白的乙腈沉淀法并研究其去除效果.方法 血清经除脂后按血清:水:乙腈=1:2:4.5(v/v/v)比例沉淀分离高丰度清蛋白,用SDS-PAGE验证去除效果和重复性.分别对4名体检健康者和非小细胞肺癌患者去除清蛋白前后的血清凝胶电泳图像进行分析.结果 经本法去除后血清清蛋白平均浓度由(50.65 4...     

三种大鼠骨髓间充质干细胞双向电泳样品制备方法的比较

背景：骨髓间充质干细胞双向电泳样品制备方法很多,但目前尚未有统一标准。目的：通过对比确定合适的大鼠骨髓间充质干细胞双向电泳样品制备方法。方法：充分裂解体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞,所得蛋白样品分为3组：未进一步处理组、丙酮沉淀法处理组、2-D clear-up kit处理组,Bradford法测定蛋白质浓度后分别进行双向电泳,对比分析3组所得电泳图谱。结果与结论：2-D Clean-up kit处理组所得双向电泳图谱在背景,图像清晰度,分辨率,重复性上比丙酮沉淀法处理组和未进一步处理组要好,说明经2-D Clean-up kit处理的样品制备方法更适合用于大鼠骨髓间充质干细胞双向电泳样品的制备。     

A specific immunoprecipitation method for isolating isoforms of insulin-like growth factor binding protein-3 from serum

BACKGROUND: This report describes an in-house developed immunoprecipitation method to isolate insulin-like growth factor binding protein-3 (IGFBP-3) and its isoforms from serum. The method was compared to other existing immunoprecipitation methods. The study of IGFBP-3 isoforms is relevant for further studies on congenital defects in glycosylation (CDG), galactosemia, and alcoholic liver cirrhosis. METHODS: Monoclonal and/or polyclonal anti-human IGFBP-3 antibodies were covalently immobilised on protein-A Sepharose beads using dimethyl pimelimidate as cross-linker. By incubation with these immobilised antibodies, intact IGFBP-3 and fragments of IGFBP-3 were isolated from serum. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and one-dimensional gel electrophoresis (1-DE) experiments were performed to define the optimal immunoprecipitation method. Isolated proteins were separated by 1-DE and two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) and visualised by Western blotting. RESULTS: ELISA and 1-DE results illustrated that an optimal isolation was performed using PBS for the incubation with serum. Laemmli sample buffer, containing 2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol hydrochloride and sodium dodecyl sulfate, or urea/CHAPS was optimal for the elution. Clinical validation was performed using CDG-Ia serum samples. The 2-DE experiments showed characteristic isoform patterns for CDG-Ia. CONCLUSIONS: The optimized in-house developed immunoprecipitation method resulted in specific detection of IGFBP-3 isoforms and is suitable for further studies on glycosylation defects.     

蛋白质组学技术分离及鉴定人脑氧化蛋白质

背景:氧化修饰蛋白质在脑老化及阿尔茨海默病等老年变性神经病的发病机制中扮演着重要角色。蛋白质组学技术可以发现氧化修饰蛋白质,为相关疾病的药物治疗选择新的靶标。目的:建立以双向电泳结合Western blot及生物质谱技术分离、鉴定人脑氧化修饰蛋白质的方法。方法:取3个无神经系统疾患的男性脑组织蛋白,第一向等电聚焦电泳后,固相pH梯度胶条同二硝基苯肼反应,然后行第二向SDS-PAGE电泳。2张相同凝胶中的1张行考马斯亮蓝染色,另1张凝胶上免疫荧光显色。同PVDF膜上显色点相对应的考染凝胶上的蛋白质点即为氧化修饰蛋白质。凝胶蛋白胶内酶解,基质辅助激光解析飞行时间串联质谱鉴定氧化修饰蛋白质。结果与结论:从提取的脑组织中鉴定出β-肌动蛋白、天冬氨酸氨基转移酶、果糖二磷酸醛缩酶、磷酸甘油酸激酶、1,3-磷酸甘油醛脱氢酶、碳酰还原酶1、磷酸丙糖异构酶、转酮醇酶、丙酮酸激酶、血清白蛋白前体、二氢嘧啶酶相关蛋白质2、热休克蛋白60为氧化修饰蛋白质。说明实验成功建立了用蛋白质组学技术分离及鉴定人脑氧化蛋白质的方法。     

突触蛋白质组学分析中双向电泳技术的优化

背景：双向电泳是突触蛋白质组学分析中最流行最通用的蛋白质分离方法之一.但文献中突触蛋白双向电泳对线性固相pH梯度（immobilized pH gradients,IPG）胶条和十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electroph-oresis,SDS-PAGE）浓度的选择很多,尚未见统一标准.目的：对突触蛋白双向电泳的IPG胶条和SDS-PAGE凝胶浓度进行优化,以获得高质量的突触蛋白双向电泳图谱.方法：以大鼠海马突触蛋白为试材,比较pH 5.0-8.0与pH 3.0-10.0线性IPG胶条,线性与非线性pH 3.0-10.0IPG胶条,以及单一浓度10％与12％ SDS-PAGE对双向电泳的影响.此外,还使用计算机检索了1989至2013年中国知网及PubMed数据库中关于突触蛋白双向电泳的文献,对文献中选择的IPG胶条、SDS-PAGE凝胶浓度进行了统计和评价,并总结了突触蛋白在不同pH值IPG胶条和不同浓度SDS-PAGE凝胶的双向电泳图谱上的分布特征.结果与结论：结果表明,使用pH 3.0-10.0的非线性胶条及单一浓度10％ SDS-PAGE凝胶进行突触蛋白双向电泳较为适宜,电泳图谱质量好,实验操作便利;同时还推荐合并使用pH 4.0-7.0和pH 6.0-11.0的IPG胶条,以及线性梯度浓度9％-16％ SDS-PAGE凝胶,也适用于突触蛋白双向电泳分析.     

Magnetic solid-phase radioimmunoassay.

A two-dimensional polyacrylamide gel technique for the separation of proteins is described. Electrofocusing in a 3.5% polyacrylamide gel is followed by electrophoresis through a 4–24% concave polyacrylamide gel gradient. The method resolves a large number of serum proteins and produces highly reproducible patterns. It is particularly useful for studies involving proteins of high molecular weight, such as α₂-macroglobulin, β-lipoprotein and IgM. The application of the technique to the immunoglobulins in pathological sera is reported.     

宫颈永生化细胞和癌细胞的亚细胞蛋白质组学初步研究

目的通过蛋白质双向凝胶电泳方法（2-DE）建立人类乳头状瘤病毒．16阳性的宫颈上皮永生化细胞（H8细胞株）和宫颈癌细胞（Caski细胞株）亚细胞（细胞质、细胞膜、细胞核）蛋白电泳图谱,进行差异蛋白质组学研究筛选差异蛋白点。方法分别对H8和Caski细胞提取细胞质、细胞膜和细胞核蛋白,通过2-DE筛选出差异点进行基质辅助激光解吸飞行时间串联质谱（MALDI-TOF-MS／MS）分析。结果对H8细胞和Caski细胞亚细胞蛋白双向电泳图谱比较,初步比较筛选了6种细胞质差异蛋白点、3种细胞膜差异蛋白点和9种细胞核差异蛋白点。结论通过对HPV-16阳性的宫颈癌前和癌变的亚细胞结构差异蛋白进行分析,为寻找宫颈癌特异性肿瘤标志物和靶向治疗提供实验依据。     

毛细管区带电泳用于血浆蛋白质混合物的分析

目的探索建立采用毛细管区带电泳(CZE)法分析血浆相关蛋白质的条件和方法。方法 1)以血浆COHN法组分Ⅳ(CFⅣ)抽提液为样品,代表蛋白质混合物,分别从波长、基本缓冲液、添加剂、PH、温度等方面,摸索CEZ分析蛋白质混合物的较优条件和方法;2)将摸索得到的较优条件下的CZE分析CFⅣ抽提液的结果,并与通过高效液相色谱(HPLC)法、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法及双向电泳(2-DE)法分析CFⅣ抽提液的结果比较;3)采用较优条件下的CZE法分析标准血浆、标准血浆经离子交换层析(IEC)的FⅧ粗提液等,考察该条件是否适用于血浆中的其他组分。结果 1)CZE法分析CFⅣ抽提液的较优条件为:20℃以214 nm紫外吸收波长,0.5 psi压力进样10 s,10 kV恒压分析50 min,缓冲体系为pH 9.0的0.04 mol/L硼酸硼砂、0.05%SDS、0.007 5%腐胺;2)采用此条件的CZE法分析CFⅣ得到14个蛋白峰、分析时间50 min,HPLC法分析得到10个蛋白峰、分析时间60 min,SDS-PAGE法分析得到11条蛋白条带、分析时间120 min,2-DE法分析得到14个蛋白点数(与CZE分析的蛋白峰数数量相同)、分析时间3 d;3)CZE法用于标准血浆、标准血浆经离子交换层析的FⅧ粗提液的分析可分别分辩出22和11个蛋白峰。结论以CZE法分析血浆相关蛋白混合物与现有分析方法比较,能达到较好的分析效果,经摸索确定的较优分析条件具有一定的通用性。     

Silver staining of an esterase compatible with activity and mass spectrometry analysis after separation using non-denaturing two-dimensional electrophoresis

BACKGROUND: Enzyme activity is normally lost when formaldehyde is used as a reductant for silver staining after separation by electrophoresis. Hydrolytic activity of esterases can be examined on membranes without impairing enzyme activity when another reductant such as glucose is used for silver staining of the enzyme after separation by non-denaturing two-dimensional electrophoresis (2-DE) and subsequent transfer. METHODS: The hydrolysis of lipids in human high density lipoprotein (HDL) by esterases first separated on a polyvinylidene fluoride membrane using non-denaturing 2-DE and silver stained using glucose as a reductant was examined. RESULTS: Esterase activity was retained after glucose was used as a silver reductant for silver staining after separation using non-denaturing 2-DE. Lipids of HDL were removed by the esterases retained on the membrane after esterases were separated by 2-DE. CONCLUSION: The results indicated that hydrolytic enzyme activity is retained after separation, staining and immobilization.