人巨细胞病毒对人脐血巨核系祖细胞生长的影响及作用机制研究

[目的]探讨人巨细胞病毒(HCMV)对巨核系祖细胞生长的影响及其机制.[方法]采用造血祖细胞体外半固体培养技术,用HCMVAD169株分别感染去除T细胞和未去除T细胞的脐血单个核细胞.观察CFU-MK集落数;用原位聚合酶链反应(IS-PCR)检测集落细胞中的HCMVDNA.[结果]2个感染组的CFU-MK集落数均减少,与灭活病毒组比较,分别为29.5%和48.6%(P<0.05),未去除T细胞组CFU-MK集落数减少比去除T细胞组明显(P<0.05),经IS-PCR检测发现各病毒感染组CFU-MK细胞中有HCMVDNA存在.[结论]HCMV在体外能抑制CFU-MK的分化和增殖,HCMV感染引起的血小板减少可能与该病毒对巨核系祖细胞的直接抑制以及免疫因素有关.     

重组人巨细胞病毒pp65蛋白与金叶败毒颗粒联合抗人巨细胞病毒效应

目的 比较重组人巨细胞病毒(HCMV)pp65蛋白与中药金叶败毒颗粒的抗HCMV作用并探讨二者间的关系.方法 用重组HCMV pp65蛋白刺激培养的人外周血单个核细胞,制备HCMV抗原特异性细胞毒T细胞,即pp65-CTL.分别将pp65-CTL、金叶败毒颗粒、pp65-CTL 金叶败毒颗粒、更昔洛韦作用于HCMV感染的人胚肺成纤维细胞(HEL),比较各组对HEL细胞病变的抑制作用,同时用RT-PCR法半定量检测作用前和作用不同时间点HCMV mRNA表达水平的变化.结果 pp65-CTL组在HEL细胞感染后72 h才开始出现少许细胞病变,有显著抗HCMV作用;pp65-CTL 金叶败毒颗粒组作用不同时间点对HCMV mRNA表达及HCMV所致细胞病变的抑制作用明显强于单一用药.结论 重组HCMV pp65蛋白刺激培养的pp65-CTL对HCMV有明显的抑制作用,与中药金叶败毒颗粒有显著的协同作用,可共同应用于HCMV活动性感染的治疗.     

人巨细胞病毒地方分离株的鉴定及其UL83序列分析

目的鉴定从合肥市某医院先天性脑瘫患儿尿标本中分离的4株人巨细胞病毒（HCMV）毒株并对其UL83基因序列进行分析，为HCMV感染的预防及pp65蛋白疫苗的研制提供参考依据。方法应用细胞培养法复苏病毒，间接免疫荧光法检测pp65蛋白表达，并用特异性引物对UL73基因进行PCR，扩增的产物经凝胶纯化后测序；序列结果运用DNAMAN软件和GenBank登录的3株代表性HCMV毒株进行核苷酸和氨基酸序列比对。结果HCMV AD169株与HCMV-1分离株的UL83基因核苷酸及编码氨基酸序列的同源性均为100％，与其余3株的同源性也达99．26％～99．69％；4株HCMV分离株与Merlin株、Towne株在相应基因片段核苷酸及氨基酸的同源性最低的分别为98．95％，99．06％。结论UL83序列分析结果表明，HCMV UL83编码pp65蛋白的优势抗原决定簇氨基酸序列无变化。     

HCMV pp65抗原血症和UL83基因检测对肾移植术后HCMV感染的诊断价值

目的 探讨外周血白细胞人巨细胞病毒(HCMV)pp65抗原血症检测和UL83基因检测对肾移植术后HCMV感染的诊断价值和临床意义.方法 对77例肾移植受者术后定期随访患者外周血进行HCMV感染检测,分别进行外周血白细胞HCMV pp65抗原血症实验和PCR技术检测HCMV UL83基因,比较两种方法的诊断准确性.结果 ...     

人巨细胞病毒感染对脐血淋巴系祖细胞增殖的影响

目的探讨人巨细胞病毒(HCMV)感染对脐血淋巴系祖细胞(CFU-TL)集落增殖能力的影响。方法采用甲基纤维素半固体培养CFU-TL集落,不同浓度HCMV-AD169持续攻击CFU-TL,观察计数CFU-TL集落数、抑制率、集落峰值时间及集落维持时间;用MTT法测量HCMV对宿主细胞增殖活性的影响;用流式细胞仪测定相应表面抗原阳性T-淋巴细胞百分率;并用聚合酶链反应(PCR)技术检测集落细胞内HCMV-AD169DNA。结果HCMV感染组CFU-TL集落数明显低于对照组(P<0.01),抑制程度与病毒感染滴度呈剂量依赖关系;HCMV感染组CFU-TL集落维持时间明显缩短,而各组集落出现时间及集落维持时间无明显差异;HCMV感染组48h、72h宿主细胞增殖指数分别1.59、1.28,感染96h、120h的增殖指数分别为0.58、0.32.;CD3+细胞较培养前明显提高,占集落组成细胞的(90.4±5.6)%,表明集落组成细胞中绝大部分细胞为T淋巴细胞;通过PCR,在HCMV感染组CFU-TL集落细胞内检测到HCMV-AD169存在。结论HCMV在体外试验中能抑制CFU-TL的分化和增殖;淋巴系祖细胞是HCMV的宿主细胞之一,HCMV-AD169能直接感染淋巴系祖细胞。此作用可能是HCMV感染所致的免疫功能低下的主要原因之一。提示HCMV感染引起的细胞免疫功能紊乱与CFU-TL受该病毒抑制有关。     

骨髓成纤维细胞条件培养液对体外巨核系细胞生成的促进作用

目的：探讨骨髓成纤维细胞条件培养液对体外巨核系细胞生成的促进作用。方法：制备骨髓成纤维细胞条件培养液(bone marrow fibroblasts conditioned medium ,BMF-CM),分别观察BMF-CM或BMF-CM联合IL-11对体外培养条件下成熟巨核细胞生成的影响及BMF-CM对巨核系祖细胞生成的影响,并用RT-PCR的方法检测Meg-01人巨核细胞系细胞NF-E2 mRNA的表达。结果：BMF-CM促进成熟巨核细胞生成。BMF-CM联合IL-11促进成熟巨核细胞生成的效果更佳。BMF-CM能促进巨核系祖细胞的生成。将30％BMF-CM加入Meg-01人巨核细胞系培养体系培养4　h,与对照组相比,NF-E2表达增强。结论：骨髓成纤维细胞条件培养液对体外巨核系细胞生成有促进作用。     

巨细胞病毒吸附穿入人胚肺成纤维细胞对HLA-Ⅰ抗原表达的影响

目的 体外实验探讨人类巨细胞病毒(HCMV)与细胞表面硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPGs)结合后对人类白细胞抗原Ⅰ(HLA-Ⅰ)表达的影响。方法 流式细胞仪检测不同干预条件细胞表面HLA-Ⅰ的表达。免疫组织化学法检测不同干预条件细胞内HCMV pp65蛋白的表达。结果 流式细胞仪检测的结果表明人胚肺成纤维细胞(HELF)表面HLA-Ⅰ的表达HCMV感染组低于对照组；紫外线灭活HCMV(UV-HCMV)组高于对照组；肝素和氯酸钠干预HELF细胞后再用UV-HCMV感染的HELF细胞，其表面HLA-Ⅰ的表达低于UV-HCMV组。免疫组织化学法检测结果显示：HCMV感染HELF24h，HCMV pp65蛋白呈阳性表达；UV-HCMV感染HELF24h，HCMV pp65蛋白呈阴性表达。结论 HSPGs可能参与影响HLA-Ⅰ在HCMV感染的HELF细胞表面上的表达，对HCMV逃避宿主的免疫监视起间接调节作用。     

人巨细胞病毒感染及其IE86蛋白对ARPE-19细胞周期的影响

目的 研究人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)感染ARPE-19细胞后对其细胞周期的影响,观察这种变化与HCMV IE2基因的关系,探讨HCMV感染的发病机制. 方法 用HCMV感染同步化的ARPE-19作为感染组,同时设模拟感染组为对照组.于感染后第1、2、3、4、5天收获细胞,RT-PCR方法 检测HCMV IE mRNA的表达水平,用免疫荧光法检测细胞核内HCMV IE蛋白的表达,Western blot法检测HCMV早期蛋白IE和晚期蛋白pp65的表达.采用PCR方法 从质粒pIEP86AD169扩增出IE2片段,构建真核表达质粒pEGFP-N3-IE2,脂质体介导瞬时转染ARPE-19细胞,RT-PCR、免疫荧光法分析IE2基因的表达.流式细胞术检测细胞周期的变化. 结果 HCMV IE72、IE86和pp65可分别在病毒感染ARPE-19细胞后第2、3和5天时检测到表达,流式细胞术示感染组在感染第3、4、5天细胞周期的S期细胞比例显著增高,与对照组比较差异均有显著性统计学意义,P﹤0.05.瞬时转染质粒pEGFP-N3-IE2后细胞周期表现为S期细胞比例显著增高. 结论 ARPE-19是HCMV的允许细胞,HCMV可引起ARPE-19细胞周期的改变,这种变化与IE2基因的表达有一定的关系.     

HCMV体外感染小鼠胚胎成纤维细胞的研究

目的 观察人巨细胞病毒(HCMV)AD169株体外感染小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的生物学特征,为探讨HCMV AD169株能跨种属感染MEF提供依据.方法 将100 TCID50 HCMV AD169株病毒悬液接种至MEF和人胚胎成纤维细胞(HF)上,逐日观察HCMV特征性细胞病变效应(CPE);分别收集感染后1、3、5 d 的MEF和HF培养物,提取细胞DNA,采用实时荧光定量PCR检测HCMV立即早期基因(IE)拷贝数变化;分别采用HCMV立即早期基因(IE-1)、主要衣壳蛋白(MCP)和包膜糖蛋白(gB)单克隆抗体进行间接免疫荧光实验检测感染后的1、3、5 d MEF和HF中相应病毒蛋白的表达.结果 观察到HCMV AD169株接种MEF出现病毒所致CPE,与HF出现的CPE相似;实时荧光定量PCR检测HCMV IE基因拷贝数发现,MEF在HCMV AD169感染后的1、3、5 d,病毒基因拷贝数呈增长趋势,但均低于相同时间点的HF中病毒拷贝数;间接免疫荧光检测HCMV感染MEF和HF后1、3、5 d HCMV IE-1、MCP和gB蛋白表达情况时发现,在MEF上HCMV IE-1、MCP和gB蛋白表达随时间延长呈增强趋势.结论 HCMV AD169株可以体外感染MEF,并在其中复制增殖.     

骨髓内皮细胞条件培养液对巨核系细胞体外增殖的影响

目的: 探讨骨髓内皮细胞条件培养液（E-CM）对巨核系细胞体外增殖的调节作用。方法: 分离纯化骨髓内皮细胞和骨髓成纤维细胞,分别收集其无血清条件培养液,比较两种无血清条件培养液对体外扩增成熟巨核细胞和巨核系祖细胞的作用。结果: E-CM和骨髓成纤维细胞条件培养液（F-CM）对成熟巨核细胞及巨核系祖细胞有体外扩增作用;E-CM对巨核系祖细胞的扩增作用明显优于F-CM（P<0.05）;对成熟巨核细胞的扩增作用弱于F-CM（P<0.01）。结论: E-CM对巨核系细胞, 主要是巨核系祖细胞有体外扩增作用。     

孕妇胎儿间巨细胞病毒感染的探讨

目的　探讨人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ） 活动性感染对胎儿的影响;方法　采用ＥＬＩＳＡ 法对不同组别的妇女检测ＨＣＭＶ－ ＩｇＡ两种抗体;结果　试验组ＩｇＡ 检出率高于Ｉｇ Ｍ,差异显著,对照组无差异,对妊娠早期ＨＣＭＶ 活动性感染追踪观察至生产６４ 例,发现各种异常占２５ ％ ,与对照组对比差异显著; 结论　ＨＣＭＶ 活动性感染妨碍胎儿发育,对准备受孕或受孕早期的妇女,检测ＨＣＭＶ 特异性ＩｇＭ、ＩｇＡ 抗体,可预测先天性ＨＣＭＹ 感染所致胎儿发育异常的危险性     

HCMV对培养HUVEC凋亡的作用

目的 :探讨人巨细胞病毒 (HCMV)在动脉粥样硬化 (AS)发生和发展中的作用及可能的机制。方法和结果 :采用组织培养技术和流式细胞计数仪观察HCMV对离体培养的HUVEC凋亡的影响。实验发现无血清培养和TNF诱导的细胞凋亡率较正常对照组升高 ,而CMV感染组凋亡率明显降低。用流式细胞仪检测发现 ,在DNA直方图上 ,在G1峰左侧可呈现亚二倍体核峰型 (亚G1峰 ,即凋亡峰 )。而正常的细胞经流式细胞仪检测 ,没有亚二倍体细胞群的峰型 ;CMV可以抑制HUVEC的一氧化氮 (NO)的合成 ,并且呈浓度依赖性。结论 :HCMV感染HUVEC后能够抑制HUVEC的细胞凋亡 ,可能的介导因素为被HCMV感染的HUVEC其NO合成减少。     

秦巴山区HCMV感染母婴垂直传播与HCMV gB基因分型的关系

目的:了解陕西秦巴山区母婴人巨细胞病毒(HCMV)感染流行株的gB基因型分布,探讨HCMV gB基因型与宫内HCMV感染结局的关系. 方法: 采用巢式PCR方法检测214对孕妇血清和新生儿脐血血清中的HCMV gB基因,利用限制性核酸内切酶Rsa I和Hinf I分别对HCMV gB基因进行限制性片段长度多态性分析(RFLP). 结果: ①214例孕妇血清中HCMV-DNA阳性13例,阳性率为6.1%. 新生儿脐血血清中HCMV-DNA阳性5例,阳性率为2.3%. 在13例HCMV-DNA阳性孕妇中,其配对脐血阳性4例,HCMV宫内传播率为30.8%. ②13例HCM VgB DNA阳性标本均为gB2型,3例症状性HCMV感染婴儿与2例无症状性感染婴儿均具有相同的基因型. ③HCMV感染孕妇早产、胎儿生长受限、低出生体质量儿(＜2500 g)及病理性黄疸的发生率均高于非感染孕妇(P＜0.05),而新生儿窒息两组间无明显差异. 结论: 陕西秦巴山区母婴HCMV流行株以gB2型为主. gB2基因型可引起母婴传播.     

人胚肺成纤维细胞感染人巨细胞病毒不同时间病毒载量的分析

目的:检测人巨细胞病毒(HCMV)感染人胚肺成纤维细胞(HELF)后不同时间点HCMV DNA载量,以明确HCMV感染HELF的时效性.方法:将HCMV接种HELF细胞,收集感染后3,5,8,10,15,20,30,60,120 min时间点细胞,提取病毒DNA,以即刻早期1基因(IE-1)为靶基因进行荧光定量PCR检...     

乳头瘤病毒及巨细胞病毒在宫颈癌组织中的协同作用

应用ＤＮＡ－ＤＮＡ斑点杂交技术，对６４例宫颈标本（包括正常宫颈２６例，重度宫颈糜烂１７例，宫颈癌２１例）分别检测ＨＰＶ－１６ＤＮＡ及ＨＣＭＶＤＮＡ。结果发现正常宫颈、宫颈糜烂及宫颈癌组织中ＨＰＶ１６ＤＮＡ的检出率分别为２３．０８％、６４．７１％、７１．４３％。而ＨＣＭＶＤＮＡ的检出率则依次为３．８５％、２３．５４％、及４２．８６％，两者检出率呈直线相关（ｒ＝０．９２３）。因此，推测ＨＣＭＶ很可能与ＨＰＶ１６协同作用导致宫颈癌的发生。     

人巨细胞病毒部分抗原基因的克隆及表达

目的克隆表达人巨细胞病毒（human cytomegalovirus,HCMV）特异性强的抗原决定簇基因,制备特异性抗原。方法从感染HCMV的细胞上清液中提取病毒基因组DNA,用PCR扩增HCMVpp150（ppUL32）、gp52（UL44）、pp65（ppUL83）、ppUL80a蛋白IgM抗原决定簇编码区DNA序列,将其克隆至pMD-18T载体并测序,然后克隆至表达载体pGEX-4T-1诱导表达,采用免疫印迹法（Western blotting）检测表达产物的抗原性。结果经序列测定各基因片段序列正确,并在pGEX-4T-1表达载体中得到了高效表达,表达的融合蛋白经Western blotting和ELISA分析,具有良好的抗原性,能够与HCMV IgM阳性血清发生特异性反应。结论通过基因工程技术可以有效地获取纯度较高、特异性强的HCMV抗原。为HCMV感染者的早期诊断提供检测用抗原。     

人类巨细胞病毒感染的临床检测方法

人类巨细胞病毒(HCMV)在人群中的感染率极高．绝大多感染者不出现任何临床症状，而当宿主免疫力降低时，即诱发严重临床疾病，因而人类巨细胞病毒感染的临床检测就显得很重要。病毒的分离与鉴定虽是临床诊断的金标准，但受各种条件的制约不能得到广泛的应用。随着医学检测手段与技术的提高，人类巨细胞病毒感染的临床检测也出现了更多更好的检测方法。     

人巨细胞病毒感染对单核细胞和内皮细胞株ECV-304间趋化和黏附的增强作用

目的 研究人巨细胞病毒(HCMV)感染对单核细胞及内皮细胞株表达趋化因子的影响,以及对两者之间趋化和黏附的影响。方法 通过ELISA法和半定量RT-PCR的方法,检测CMV感染对单核细胞株(THP-1)及内皮细胞株(ECV-304)几种趋化因子及其受体表达的改变,同时通过趋化实验和黏附实验研究内皮细胞对单核细胞的趋化和黏附的改变。结果 HCMV感染可刺激ECV-304分泌MCP-1、GROα,在mRNA水平可改变内皮细胞MCP-1、CRO-α和IL-8表达,先下调后上调(IL-8除外);而对单核细胞趋化因子受体CCR2、CXCR2的表达在mRNA水平却有明显的下调作用(P<0.05)。HCMV感染可显著增强内皮细胞对单核细胞的趋化和黏附。结论 HCMV感染可增强内皮细胞对单核细胞的趋化和黏附,参与炎症反应,这可能与CMV上调内皮细胞趋化因子表达有关。     

HCMV感染对人神经胶质瘤U251细胞p38MAPK活性的影响

人巨细胞病毒(HCMV)在人群中的感染非常普遍。随着器官移植的广泛开展、艾滋病的传播以及耐药病毒株的出现,对HCMV致病、致畸机制的研究越来越受到重视。MAPK是细胞内的一类丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶,它介导的信号转导通路是生物信号引起核反应的重要通路,参与细胞生长、分化、凋亡等多种生理过程,并在细胞恶性转化等病理过程     

肾移植患者人巨细胞病毒的检测

采用ＰＣＲ和ＥＬＩＳＡ方法对１１例肾移植者的巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）感染情况进行了研究。在术前及术后的４周内，对其外周血及尿中病毒和血清中ＩｇＡ及ＩｇＭ抗体进行了连续检测。结果显示：有６例在移植后出现巨细胞病毒感染，感染率为５４％（６／１１）。血、尿中ＨＣＭＶＤＮＡ或ＨＣＭＶ抗体（ＩｇＡ或ＩｇＭ）阳性。提示：用ＰＣＲ和ＥＬＩＳＡ方法对肾移植病人的ＨＣＭＶ感染情况进行监测，对预防和治疗ＨＣＭＶ感染和提高肾移植的成功率有着重要的意义。