实时荧光定量RT-PCR技术在肿瘤研究中的应用

实时荧光定量RT-PCR以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点而成为了分子生物学研究中的重要工具,广泛应用于医学等领域.全文就其原理、优越性及其在肿瘤研究中的应用及发展前景作一简要叙述.     

胃癌石蜡包埋组织的miRNA实时荧光定量PCR表达

目的:研究miRNA在胃癌石蜡包埋组织和新鲜组织的表达. 方法: 应用实时荧光定量PCR检测6例石蜡包埋胃癌组织及其正常胃黏膜组织、新鲜胃癌组织及其正常黏膜组织的miRNA表达(let-7a,miR-21,miR-155),以U-6为内参对照. 结果: 胃癌石蜡包埋组织与胃癌新鲜组织中miRNA表达呈平行性高表达. 结论: 可以利用石蜡组织进行miRNA相关指标表达研究.     

实时荧光定量PCR 检测胃癌SOX2的 表达及其临床意义

目的： 探讨性别决定相关基因簇2(SOX2)表达与胃癌发生、发展和转移的关系及其临床意义。方法：用Trizol提取52例胃癌组织及对应正常胃黏膜组织的mRNA,并将其逆转录为cDNA。用实时荧光定量PCR方法检测SOX2 mRNA的表达,并分析SOX2基因的表达水平与患者临床病理指标的关系。结果：胃正常黏膜组织中SOX2 mRNA的表达是胃癌组织的2.24倍,两者差异有统计学意义(t=3.22,P=0.002 6)。高分化和中分化的胃癌组织中SOX2 mRNA表达量高于低分化的胃癌组织(t=3.09和2.87,P均<0.05),肿瘤浸润深度为T1+T2的胃癌组织中SOX2 mRNA表达量是T3+T4癌组织的2.57倍(t=2.16,P<0.05),淋巴结无转移组SOX2 mRNA表达量是转移组的2.69倍(t=2.54,P<0.05)。与Ⅰ+Ⅱ期的胃癌组织比较,Ⅲ+Ⅳ期胃癌组织的SOX2 mRNA表达量明显降低(t =2.59,P=0.014)。SOX2 mRNA表达量与患者的性别、年龄无明显关系(P>0.05)。结论：SOX2 mRNA表达水平的降低与胃癌的发生、浸润和转移相关,有望成为胃癌诊断及预后判断的一个指标。     

胃癌石蜡包埋组织的miRNA实时荧光定量PCR表达

目的：研究miRNA在胃癌石蜡包埋组织和新鲜组织的表达。方法：应用实时荧光定量PCR检测6例石蜡包埋胃癌组织及其正常胃黏膜组织、新鲜胃癌组织及其正常黏膜组织的miRNA表达（let-7a,miR-21,miR-155）,以U-6为内参对照。结果：胃癌石蜡包埋组织与胃癌新鲜组织中miRNA表达呈平行性高表达。结论：可以利用石蜡组织进行miRNA相关指标表达研究。     

实时荧光定量PCR检测大鼠肝癌组织中MEF2及ⅡHDACs的表达

[目的]检测大鼠肝脏组织中MEF2A/2C mRNA及HDAC4/10 mRNA表达水平,并分析MEF2A/2C mRNA与HDAC4/10 mRNA表达的相关性。[方法]采用0.01%二乙基亚硝胺饲喂Wistar大鼠,建立大鼠肝癌模型,提取大鼠肝组织中的总RNA并逆转录为cDNA,应用Real-timePCR检测MEF2A/2C mRNA与HDAC4/10 mRNA表达量。[结果]18周后,大鼠致癌率为100%,总死亡率为35%,MEF2A/2C mRNA在第4、8周表达量显著增加（P〈0.01）,HDAC4/10mR-NA在第4周大量表达（P〈0.01）,随后都逐渐趋于正常水平。MEF2A/2C mRNA与HDAC4/10 mRNA表达水平在时间上不存在相关性。[结论]大鼠肝癌发生过程中,MEF2与肝癌组蛋白乙酰化有关,但MEF2A/2C mRNA与HDAC4/10 mRNA表达量在时间上无明显的关联性。     

实时定量PCR检测VEGF在子宫内膜癌及外周血中的表达及其临床意义

目的:检测血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)基因在子宫内膜癌、癌周组织、正常子宫内膜及外周血循环中的表达情况,分析其在肿瘤生长、转移中的作用.方法:采用荧光实时定量PCR方法检测51例子宫内膜癌患者的癌组织和癌周组织、40例正常子宫内膜组织及其对应的患者外周血中的VEGF表达情况,分析其与临床病理参数之间的关系.结果:子宫内膜癌组织中VEGF表达水平显著高于癌周组织及正常子宫内膜组织(P<0.05) ;与临床分期、组织学分级、淋巴结转移、肌层浸润深度密切相关 (均P<0.05),但与肿瘤病理类型及患者是否绝经无明显相关性(P>0.05).子宫内膜癌患者外周血中VEGF的表达明显高于正常对照(P>0.05),且与临床分期、组织学分级、病理类型及淋巴结转移有显著相关(均P<0.05),但与肌层浸润程度及患者是否绝经无明显相关性.结论:荧光实时定量PCR可以敏感、特异性地检测子宫内膜癌组织及外周血中VEGF的表达,VEGF在子宫内膜癌的发生、侵袭、转移过程中可能起重要作用.     

实时荧光定量PCR检测结直肠癌hPTTG1的表达及其意义

背景与目的:虽然人垂体瘤转化基因1(human pituitary-tumortransforming gene 1,hPTTG1)在结直肠癌等恶性肿瘤中高表达,然而hPTTG1mRNA与结直肠癌临床病理参数之间的关系及其能否作为结直肠癌诊断和预后判断的分子标志尚不清楚.本研究检测hPTTG1 mRNA在结直肠癌中的表达.分析其与临床病理参数之间的关系,探讨hPTTG1 mRNA作为结直肠癌诊断和转移复发的分子标志的可能性.方法:采用实时荧光定量PCR检测结直肠癌组织与对应癌旁组织hPTTG1 mRNA,并分析其与临床病理指标的关系.结果:结直肠癌组织hPTTG1mRNA表达较止常癌旁组织显著增高(0.42±0.07 vs.0.03±0.01.P<0.001).hPTG1 mRNA与肿瘤大小、血清CEA水平有关,肿瘤直径≥3.5 cm较<3.5 cm显著增高(15.80±8.80 vs.10.91±5.22.P<0.05).血清CEA>5 ng/mL较<5ng/mL显著增高(22.79±7.42 vs.9.39±2.61,P<0.001).hPTTG1 mRNA在Dukes'C、D期显著高于Dukes'A、B期(15.88±8.09、25.69±7.67 vs, 9.03±0.35、9.58±2.93,P<0.001).伴有淋巴转移、肝转移或其他器官转移者(17.63±8.47、31.07±4.10和22.78±6.39)较无转移者(11.15±6.65)显著增高(P<0.001).hPTTG1 mRNA与患者的性别、年龄和病理分型无关(P>0.05).结论:hPTTG1 mRNA在结直肠癌中高表达.与结直肠癌的疾病进展密切相关,有助于对患者病情进展的预测.     

实时荧光定量PCR法检测卵巢良、恶性肿瘤中Id1 mRNA的表达

目的:检测Id1 mRNA在人卵巢良、恶性肿瘤组织中的表达及其意义。方法:用SYBR GreenI嵌合荧光法进行实时逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),检测Id1 mRNA在人良性卵巢囊肿和卵巢癌组织中的相对定量,分析Id1 mRNA的含量变化与卵巢良、恶性病变的关系。结果:Id1 mRNA在卵巢癌组织中的含量明显高于良性卵巢囊肿组织(P<0.01)。卵巢癌组织分化低和恶性度高的组织Id1mRNA的表达量明显高于分化高或恶性程度低的组织。高Id1mRNA表达和患者预后呈显著相关(P<0.001)。结论:卵巢癌组织中Id1 mR-NA表达显著高于良性囊肿组织,而且与癌组织恶性度和预后密切相关。Id1 mRNA实时定量检测有助于从基因转录水平对卵巢癌进行早期辅助诊断并初步判断预后。     

实时荧光定量PCR法检测卵巢良、恶性肿瘤中Id1 mRNA的表达

目的：检测Id1 mRNA在人卵巢良、恶性肿瘤组织中的表达及其意义。方法：用SYBR GreenI嵌合荧光法进行实时逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）,检测Id1 mRNA在人良性卵巢囊肿和卵巢癌组织中的相对定量,分析Id1 mRNA的含量变化与卵巢良、恶性病变的关系。结果：Id1 mRNA在卵巢癌组织中的含量明显高于良性卵巢囊肿组织（P〈0.01）。卵巢癌组织分化低和恶性度高的组织Id1mRNA的表达量明显高于分化高或恶性程度低的组织。高Id1mRNA表达和患者预后呈显著相关（P〈0.001）。结论：卵巢癌组织中Id1 mR-NA表达显著高于良性囊肿组织,而且与癌组织恶性度和预后密切相关。Id1 mRNA实时定量检测有助于从基因转录水平对卵巢癌进行早期辅助诊断并初步判断预后。     

实时定量PCR检测VEGF在子宫内膜癌及外周血中的表达及其临床意义

摘 要 目的: 检测血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）基因在子宫内膜癌、癌周组织、正常子宫内膜及外周血循环中的表达情况，分析其在肿瘤生长、转移中的作用。方法: 采用荧光实时定量PCR方法检测51例子宫内膜癌患者的癌组织和癌周组织、40例正常子宫内膜组织及其对应的患者外周血中的VEGF表达情况，分析其与临床病理参数之间的关系。结果: 子宫内膜癌组织中VEGF表达水平显著高于癌周组织及正常子宫内膜组织(P<0.05) ；与临床分期、组织学分级、淋巴结转移、肌层浸润深度密切相关 (均P<0.05)，但与肿瘤病理类型及患者是否绝经无明显相关性(P>0.05)。子宫内膜癌患者外周血中VEGF的表达明显高于正常对照(P>0.05)，且与临床分期、组织学分级、病理类型及淋巴结转移有显著相关(均P<0.05)，但与肌层浸润程度及患者是否绝经无明显相关性。结论：荧光实时定量PCR可以敏感、特异性地检测子宫内膜癌组织及外周血中VEGF的表达，VEGF在子宫内膜癌的发生、侵袭、转移过程中可能起重要作用。     

实时定量PCR检测IgH重排在B淋巴细胞恶性肿瘤中的应用

用精确、敏感和可靠的RQ-PCR方法,以克隆性IgH重排为靶分子,可对B淋巴细胞恶性肿瘤的MILD定量检测,对于其疗效评价、预后判断和预防复发等具有重要意义。就RQ-PCR在B淋巴细胞肿瘤中检测IgH重排的技术原理及其应用研究进行综述。     

实时荧光定量PCR检测CK18对胃癌淋巴结微转移的诊断价值

[目的]建立细胞角蛋白18（CK18）实时荧光定量PCR（RTFQ-PCR）检测系统,定量检测CK18在胃癌淋巴结中的表达水平．发现淋巴结微转移,从而提高胃癌淋巴结转移诊断的阳性率。[方法]应用TaqMan探针实时荧光定量PCR方法,以CK18作为淋巴结微转移的标志基因,制备CK18表达序列的标准品,并建立标准曲线。定量检测24例病理证实无淋巴结转移的胃癌患者199枚淋巴结的CK18 mRNA拷贝数。[结果]RTFQ—PCR检测CK18 mRNA的95％CV值为2．38％,敏感性达10个拷贝。24例病理无淋巴结转移的胃癌患者,15例CK18 mRNA阳性。阳性率为62．5％（15,24）。RTFQ-PCR检测CK18 mRNA的量值水平,最小值为2．57×10^2,最大值1．08×10^8。[结论]应用RTFQ-PCR方法,以CK18作为淋巴结微转移的标志基因．可提高胃癌淋巴结转移的检出率．能够发现组织病理学检查不能发现的微转移灶,并可能对微转移分级有益。     

实时荧光定量 PCR检测早期宫颈癌及前哨淋巴结VEGF-C及VEGF-D mRNA表达

[目的]研究血管内皮生长因子(VEGF)-C及VEGF-D mRNA在早期宫颈癌和前哨淋巴结中的表达水平.[方法]收集51例早期官颈癌患者宫颈癌组织、癌周组织、前哨转移淋巴结、非前哨无转移淋巴结、正常区域组织.透射电镜观察淋巴转移情况,实时荧光定量PCR检测VEGF-C及VEGF-D mRNA的表达量,并研究其与宫颈癌临床病理各因素之间的关系.[结果]透射电镜显示宫颈癌周区可见到淋巴管增生.VEGF-C及VEGF-D mRNA在宫颈癌内、癌周、前哨转移淋巴结中的表达均显著高于正常宫颈组织和非前哨无转移淋巴结(P＜0.05).VEGF-C及VEGF-D mRNA在宫颈癌组织中的表达在不同淋巴结转移、淋巴管侵犯、肿瘤浸润深度下差异有统计学意义(P均＜0.05),而不同年龄、临床分期、病灶大小、组织分化、病理类型之间的差异无统计学意义(P均＞0.05).[结论]VEGF-C及VEGF-D在早期宫颈癌的淋巴结转移中起重要作用,可能成为预测宫颈癌淋巴结转移的关键指标,有希望成为抑制宫颈癌淋巴结转移的治疗靶点.     

实时荧光定量PCR检测大肠癌腹腔微转移及其临床意义

[目的]应用实时荧光定量PCR技术检测大肠癌腹腔内游离癌细胞并探讨其临床意义。[方法]2003年5月至2004年1月，收集在日本爱知癌症中心手术81例大肠癌病例的腹腔冲洗液．每个样本的cDNA均应用两种引物合成（随机引物和寡核苷酸引物），并在罗氏实时荧光定量PCR（LightCyckr）上进行定量分析。每个样本同时进行常规细胞学检查。所有病例术后经过平均为1年的随访。[结果]CEA mRNA和CK-20 mRNA的阳性率和阳性值均与肿瘤的浸润深度（T）、分期以及淋巴结转移相关。在一个合理界定值上，CEA和CK-20检测的敏感度与特异度均为100％，而常规的细胞学检查则为33％和100％。[结论]CEA和CK-20 mRNA定量分析是检测大肠癌腹腔微转移的敏感和特异的方法，CEA和CK-20 mRNA水平的异常与术后的无瘤生存率显著相关。     

实时荧光定量PCR检测原发性肝癌中PRL-2基因的表达

Objective: To quantitatively detect the expression level of PRL-2 in primary hepatocellular carcinoma using real-time fluorescence quantitative PCR. Methods: Total RNA isolated from human HCC and liver tissue adjacent to the tumor was reversely transcribed into cDNA. Real-time fluorescence quantitative PCR (Q-PCR) method was used to analyze the expres-sion level of PRL-2 gene. Results: The Q-PCR method was performed successfully to precisely detect RNA level. PRL-2 was expressed in all portal vein tumor thrombosis (PVTT) and HCC, but only in some paratumor tissue. The highest expression level of PRL-2 gene was recorded in PVTT; meanwhile expression level of PRL-2 was higher than that in paratumor liver tis-sues and in HCC (P<0.01), and it was higher in HCC than that in paratumor liver tissues. Conclusion: The Q-PCR may be the most precise method to quantitatively detect RNA level and can be used in gene expression changes. The PRL-2 gene has higher expression in PVTT than that in HCC and in paratumor liver tissue cells, indicating that it plays an important role in the development and metastasis of the HCC.     

直肠癌相关新基因的荧光定量PCR检测

目的应用实时荧光定量PCR技术检测人类新基因C10orf46ky(Genbank登录号为AY743663)在直肠癌中表达情况及其意义.方法制备31例直肠癌患者癌及癌旁正常组织中总RNA并逆转录为cDNA.应用实时荧光定量PCR技术分析C10orf46ky基因的mRNA表达水平.结果在直肠癌癌组织中的C10orf46ky基因的mRNA表达水平高于相邻的癌旁正常直肠组织,但其表达水平与直肠癌的分期和病理分化程度在统计学上没有显著相关性.结论人类新基因C10orf46ky在直肠癌中表达升高,暗示其与直肠癌变可能有关.     

半定量RT—PCR技术在肿瘤相关基因检测中的应用

目的：探讨半定量反转录PCR（RT－PCR）对肿瘤相关基因的检测及方法的改进。方法：用RT－PCR法检测食管癌患者的癌组织MMP－2 mRNA的表达。结果：改进的RT－PCR具有相同的检测灵敏性，并可降低工作强度。结论：半定量RT－PCR为一种灵敏可靠的检测RNA表达的方法。     

荧光定量PCR法检测血浆EB病毒DNA在鼻咽癌诊断上的价值

EB病毒与鼻咽癌密切相关.几乎所有的鼻咽癌组织中均可检测到EB病毒的DNA[1];近年来,有学者报道在鼻咽癌患者的血清或血浆中检测到EB病毒的DNA,并且和健康人之间有明显的差异[2,3].本研究应用荧光定量PCR方法检测鼻咽癌高发区广东地区的鼻咽癌患者与健康对照人群及其他头颈部肿瘤患者的血浆游离EB病毒DNA,以进一步说明此方法在诊断鼻咽癌上的价值.