晚期糖基化终产物对心肌细胞细胞周期和凋亡的影响

目的探讨晚期糖基化终产物(advanced glycation end products,AGEs)对体外培养乳鼠心肌细胞细胞周期及凋亡的影响。方法体外培养3~5 d的乳鼠心肌细胞,用含1%或10%胎牛血清的DMEM培养基中继续培养24 h,应用流式细胞仪和原位末端标记技术观察不同浓度AGEs(50、100 μg/ml)对心肌细胞刺激12、24、48 h后细胞周期分布、凋亡率及凋亡小体/凋亡细胞核分布的影响。结果AGEs对心肌细胞细胞周期分布无明显影响;在正常培养液培养时,心肌细胞的凋亡随着培养时间延长而增加,24、48 h与12 h相比,凋亡小体/凋亡细胞核分别增加了0.55、1.23倍;AGEs可以明显增加心肌细胞的凋亡程度,并随着刺激时间、刺激浓度的增加而增加,50、100 μg/ml AGEs组与对照组相比,凋亡小体/凋亡细胞核12、24、48 h分别增加了0.74和1.21、1.15和1.78、0.83和1.19 倍。结论AGEs对心肌细胞细胞周期分布无影响,但可以通过增加心肌细胞凋亡率对心肌细胞造成损伤。     

Transient cytosolic free calcium changes in cultured neonatal rat cardiac myocytes in response to advanced glycation end-product treatment]

OBJECTIVE: To investigate the effects of advanced glycation end-products (AGEs) on transient cytosolic free calcium in neonatal rat cardiac myocytes (CMs) cultured in vitro. METHODS: CMs cultured for 3 to 5 days in vitro were incubated with Ca(2+)-sensitive fluorescent indicator Fluo-3AM with light screening at 37 degrees celsius; with 5% CO(2) for 60 min. Changes of the fluorescence signal of free calcium caused by AGEs were measured under laser scanning confocal microscope (LSCM). RESULTS: Compared with the control cells, AGEs caused an increase in the concentration of cytosolic free calcium in a dose-dependent manner. CONCLUSION: AGEs may impair neonatal rat CMs by altering cytosolic free calcium concentration.     

糖基化终极产物对乳鼠心肌细胞胞内游离钙瞬间变化的影响

目的 探讨糖基化终极产物(AGEs)刺激对体外培养乳鼠心肌细胞内游离钙的影响。方法 应用荧光钙离子指示剂Fluo-3/AM将体外培养3~5 d的乳鼠心肌细胞染色,激光共聚焦显微镜(LSCM)观察不同浓度AGEs(50、100、200 μg/ml)对心肌细胞瞬时刺激后细胞内游离钙离子浓度的影响。结果 与对照组相比,AGEs刺激可以迅速引起心肌细胞胞内游离钙浓度的升高,其恢复时程显著延长并呈剂量依赖性。结论 AGEs可能通过改变心肌细胞内游离钙离子浓度对心肌细胞造成损伤。     

甘草酸二铵对新生大鼠心肌细胞凋亡的影响

目的 观察甘草酸二铵对新生大鼠心肌细胞凋亡及对Bcl-2/Bax蛋白表达的影响.方法 取新生鼠心肌细胞培养36小时后,加入不同浓度甘草酸二铵(0.01～10 μmol/L).用丫啶橙荧光染色法和流式细胞仪检测心肌细胞凋亡.用免疫组化法测定心肌细胞的Bcl-2和Bax蛋白的表达.结果 不同浓度甘草酸二铵加入细胞24小时后,随着剂量的加大凋亡细胞所占比值逐渐增加;同时Bax蛋白平均光密度值(MOD)逐渐增加,Bcl-2蛋白MOD逐渐下降,Bcl-2/Bax比值下降,与对照组相比有显著性差异(P＜0.05).结论 甘草酸二铵明显促进心肌细胞的凋亡,且具有浓度依赖性,可能与Bcl-2/Bax蛋白表达下调有关.     

阿托伐他汀对大鼠糖基化终末产物水平的影响

目的观察阿托伐他汀对大鼠糖基化终末产物（advallcedglyced glycation end-products,AGEs）水平的影响。方法40只雄性SD大鼠随机分为对照组、高脂组（喂予高脂饲料）、AGEs．BSA组（腹腔注射AGEs-BSA并喂予高脂饲料）和AGEs-BSA＋他汀组（腹腔注射AGEs-BSA,同时阿托伐他汀灌胃并予高脂饲料）,每组10只;分别在12、24周,测定大鼠血糖和血清AGEs、胆固醇、丙二醛（maleicdialdehyde,MDA）水平。结果12、24周时,AGEs-BSA组的血清AGEs水平较其他组显著升高,而阿托伐他汀能不依赖降脂效应地降低AGEs水平（P〈0．05）。结论阿托伐他汀能够降低血清AGEs水平。     

尾加压素Ⅱ诱导体外培养的乳鼠心肌细胞肥大的研究

目的 研究尾加压素Ⅱ(UⅡ)能否诱导体外培养的乳鼠心肌细胞肥大。方法 心肌细胞体外培养40h后，换无血清DMEM继续培养24h，应用流式细胞仪和3H-亮氨酸(^3H-Leu)掺入法观察不同浓度UⅡ作用24h后对心肌细胞大小和蛋白掺入率的影响。结果 10^-7mol／L的UⅡ心肌细胞的大小(P=0．021)和^3H-Leu掺入率(P=-0．015)。结论 UⅡ能诱导体外培养的乳鼠心肌细胞肥大。     

柿叶黄酮对晚期糖基化终产物诱导的血管外膜成纤维细胞增殖的影响

OBJECTIVE: To observe the effects of flavone from the leaves of Diospyros kaki on proliferation of adventitial fibroblasts induced by advanced glycation end-products (AGEs) in vitro. METHODS: NIH/3T3 cells cultured in vitro were treated with both AGEs and flavone from the leaves of Diospyros Kaki for observation in comparison with the cells that received treatments with either AGEs or flavone, or neither. The ratio of cell proliferation was determined by non-radioactive MTS/PES assay. RESULTS: The ratio of cell proliferation was 0.840+/-0.061 in the untreated control group, and was 1.330+/-0.055, 1.210+/-0.119, 1.029+/-0.076 and 0.792+/-0.060 in AGEs groups corresponding to AGE concentrations of 100, 50, 10 and 1 microg/ml respectively. AGEs significantly induced fibroblast proliferation in a dose-dependent manner when the concentration was above 10 microg/ml (P<0.05), as compared with the untreated control group. (P<0.05). The ratio of cell proliferation was 0.829+/-0.056 in cells treated with flavone at the concentration of 50 microg/ml, which alone failed to affect fibroblast proliferation (P>0.05). With AGEs stimulation, however, flavone from the leaves of Diospyros kaki significantly inhibited the proliferation of the fibroblasts (P<0.05). CONCLUSION: Flavone from the leaves of Diospyros kaki can significantly inhibit the proliferation of adventitial fibroblasts stimulated by AGEs in vitro.     

新生大鼠心肌细胞的原代培养方法的探讨

目的 改进心肌细胞的原代培养方法,提高心肌细胞收获率和存活率。方法 使用Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶分次消化心脏组织,差速贴壁分离法和化学试剂抑制法纯化心肌细胞。结果 8h后少数细胞出现自发性搏动;24h心肌细胞几乎全部贴壁,第1-3天形成细胞簇或细胞单层,心肌细胞收缩明显而有力。结论 胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶配合使用可以分离获得形态、活力良好的心肌细胞。     

新生大鼠心肌细胞原代培养方法的改良

目的:探讨更为简便的新生大鼠心肌细胞原代培养的方法,使分离的心肌细胞达到理想的数量、存活率和纯度.方法:用胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶联合消化,分离新生大鼠心肌细胞,进行体外培养,观察心肌细胞形态学变化,并以细胞免疫荧光进行心肌细胞纯度鉴定.结果:心肌细胞分离良好,收获细胞数量及存活率高,可贴壁搏动生长,免疫荧光显示培养的心肌细胞纯度达95%以上.结论:改良的细胞培养技术可获得生长状态良好的心肌细胞.     

糖基化终产物对大鼠血管平滑肌细胞骨保护素mRNA表达的影响

目的:研究糖基化终产物(AGEs)对大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)骨保护素(OPG)mRNA表达的影响。方法:体外培养VSMCs,在含10 mmol.L-1β-甘油磷酸(β-GP)的培养液中加入不同浓度(0、50、100、200、400 mg.L-1)的AGE-牛血清白蛋白(BSA)与VSMCs孵育不同时间(0、12、24、36、48、72 h)。采用RT-PCR检测OPG的mRNA表达水平。结果:AGE-BSA呈时间和剂量依赖性地增加VSMCsOPG mRNA的表达;200 mg.L-1的AGE-BSA与VSMCs孵育24 h,OPG mRNA表达水平达到高峰。结论:AGE-BSA能够促进大鼠VSMCsOPG mRNA的表达。     

次声诱导的大鼠心肌细胞凋亡和血管内皮损伤

目的: 检测次声诱导的大鼠心肌细胞凋亡和血管内皮损伤. 方法: 用8 Hz, 130 dB的次声分别作用大鼠0, 7, 14, 21和28 d,每日2 h,观察大鼠心肌凋亡蛋白Bax, Bcl-x的表达,测定大鼠血浆NO, ET-1的含量变化. 结果: 大鼠心肌凋亡蛋白与对照组比较Bax, Bcl-x的表达均增强,Bcl-x的表达增加比Bax表达增加少(P<0.01),有统计学意义. 大鼠血浆ET-1含量在暴露期间均明显升高(P<0.01),7 d时升高最多,14 d时升高最少,21和28 d时较14 d时有所升高;次声暴露7 d NO含量减少(P<0.05),14 d时显著降低(P<0.01),在次声作用的0,21和28 d时,与对照组比较无差别(P>0.05). 结论: 次声可引起大鼠心肌凋亡,血管内皮受损伤,这些变化和次声暴露的时间和量有关.     

缺氧-复氧对培养的大鼠心肌细胞损伤与细胞凋亡的影响

目的:探讨体外培养的大鼠心肌细胞在缺氧(缺血)和缺氧-复氧(再灌注)状态下心肌细胞损伤和细胞凋亡情况。方法:常规方式培养SD大鼠心肌细胞。给予模拟缺血(缺氧)溶液、模拟复氧(再灌注)液以及终浓度为200U/mL的超氧化无歧化酶(SOD)干预处理,制备缺氧-复氧损伤组(H/R组)、SOD+缺氧-复氧损伤组(SOD+H/R组)和缺氧预处理组(HP组)模型,未经处理的为正常对照组(control组)。结果:屹H/R组的细胞存活率较对照组明显降低(P<0.01);H/R+SOD组和HP组的细胞存活率虽然较正常对照组明显降低(P<0.05),但比H/R组为高(P<0.05);亿H/R组培养液中培养液中心肌酶活性显著高于HP组和H/R+SOD组(P<0.01)。役H/R组心肌细胞内的脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量也明显增高,与HP组和H/R+SOD组的心肌细胞内MDA含量比较有显著性差异(P<0.05);而HP组、H/R组与对照组间比较,无明显差异(P>0.05);均提示了缺氧-复氧过程中心肌细胞损伤严重,也说明了缺氧(血)预处理或SOD均有细胞保护作用。臆H/R组心肌细胞内游离钙含量增加,显著高于HP组和H/R+SOD组(P<0.01);逸流式细胞仪测定出H/R组心肌细胞凋亡率也明显高于HP组和H/R+SOD组(P<0.01)。心肌细胞凋亡的数量与细胞内钙的增加呈正相关(P<0.01)。肄电镜下所见H/R组的许多细胞表现为胞浆减少,核深染、固缩状态,异染色质不均匀,部分线粒体呈空泡变性,或是肌浆网囊泡变等凋亡期或凋亡前期样改变,少数呈凋亡向坏死方面改变;而其他组则少见此些变化。结论:体外培养的心肌细胞在缺氧-复氧情况下同样可加重心肌细胞损伤,可能是通过降低细胞内钙离子浓度而起作用的。     

STAT3在sRAGE抑制缺血再灌注导致的心肌细胞凋亡中的作用

目的 建立体内和体外缺血再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)模型,观察缺血再灌注心肌细胞凋亡情况及STAT3蛋白表达变化;检测sRAGE对缺血再灌注心肌细胞凋亡及STAT3的蛋白表达的影响。方法 复制C57BL/6J小鼠心脏和原代心肌细胞缺血再灌注模型,在sRAGE和(或)STAT3抑制剂AG490的干预下,通过检测TUNEL及caspase-3活性评价心肌细胞凋亡的程度;通过Western blotting检测磷酸化的STAT3(p-STAT3)及总的STAT3(t-STAT3)蛋白的表达。结果 体内实验,与Sham组相比,I/R组TUNEL阳性细胞数目和caspase-3活性分别增加了115%和120%,I/R组p-STAT3/STAT3比值降低了50%,sRAGE降低了I/R诱导的心肌细胞凋亡,包括TUNEL阳性细胞数目降低了51%,caspase-3活性降低了36%,此外,sRAGE预处理I/R组的p-STAT3/STAT3比值增加了381%; 体外实验,与Control组相比,I/R组TUNEL阳性细胞数目和caspase-3活性分别增加了380%和77%,I/R组p-STAT3/STAT3比值降低了69%,sRAGE(900 ng/mL)同样降低了I/R诱导的心肌细胞凋亡,表现为TUNEL阳性细胞数目降低了63%,caspase-3活性降低了33%,此外,sRAGE预处理I/R组的p-STAT3/STAT3比值增加了243%,与I/R+sRAGE组相比较,I/R+sRAGE+AG490组的TUNEL阳性细胞数目升高了126%,caspase-3活性增加了42%,p-STAT3/STAT3比值降低了68%。结论 sRAGE可通过激活STAT3抑制缺血再灌注诱导的心肌细胞凋亡。     

糖基化终产物对THP-1巨噬细胞酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶-1表达的影响

目的 观察糖基化终产物(advanced glyeosylation end-products,AGEs)对THP-1巨噬细胞酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶.1(aeyl coenzyme A:cholesterol acyhransferase-1,ACAT-1)表达的影响.方法 将糖基化-牛血清白蛋白(AGE-modified bovine serum albumin,AGE-BSA)与佛波酯(PMA)诱导分化72h的THP-1巨噬细胞共同孵育,运用RT-PCR和Western blot分别检测巨噬细胞ACAT-1 mRNA和蛋白的表达水平.结果 PMA诱导72 h后,THP-1细胞停止增殖,由单核细胞分化成为巨噬细胞.用50、100、200和400 mg/L AGE-BSA处理巨噬细胞后,细胞ACAT-1 mRNA相对表达量逐渐增加;ACAT-1蛋白表达的平均积分光密度值也逐渐增加,二者较对照牛血清白蛋白组明显增加(P＜0.05).用200 mg/LAGE-BSA作用巨噬细胞0、12、24、36 h和48 h后,细胞ACAT-1 mRNA相对表达量逐渐升高;ACAT-1蛋白表达的平均积分光密度值也逐渐升高,较0 h明显增加(P＜0.05).结论 AGEs可上调THP-1巨噬细胞ACAT-1 mRNA和蛋白的表达,呈浓度和时间依赖性,这可能与糖尿病动脉粥样硬化有关.     

柿叶黄酮对晚期糖基化终产物诱导的血管外膜成纤维细胞增殖的影响

目的观察柿叶黄酮对晚期糖基化终产物诱导的血管外膜成纤维细胞增殖的影响。方法体外培养成纤维细胞,应用柿叶黄酮与晚期糖基化终产物共同进行作用并设立对照进行比较,采用非放射性的MTS/PES法确定成纤维细胞的增殖状态。结果各组的细胞增殖率分别为对照组(0.840±0.061);细胞增殖率分别为(1.330±0.055)、(1.210±0.119)和(0.792±0.060)、柿叶黄酮50 μg /ml组(0.829±0.056);AGEs 50 μg /ml联用柿叶黄酮50 μg /ml组(0.947±0.072)。统计分析显示低至10 μg/ml 的AGEs仍能明显刺激成纤维细胞的增殖(P<0.05),并呈现剂量依赖性(P<0.05)。柿叶黄酮单独作用对成纤维细胞细胞增殖率无影响(P>0.05);柿叶黄酮对AGEs诱导的成纤维细胞增殖有明显的抑制作用(P<0.05)。结论柿叶黄酮能明显抑制由晚期糖基化终产物刺激的血管外膜成纤维细胞增殖,     

左西孟旦对去甲肾上腺素诱导的心肌细胞钙瞬变信号的影响

目的:研究心肌细胞衰竭过程中钙瞬变信号的变化及左西孟旦(levosimendan,LeV)对其影响?方法:培养Sprague Dawley(SD)乳大鼠心肌细胞48 h后,分为对照组?去甲肾上腺素(NE)组?NE+LeV1(0.1 μmol/L)诱导组和NE+LeV2(1 μmol/L)诱导组?NE组以去甲肾上腺素10 μmmol/L诱导;NE+LeV1组先用NE诱导,再以LeV 0.1 μmol/L干预;NE+LeV2组先用NE诱导,再以LeV 1 μmol/L干预?用Ca2+荧光指示剂Fluo-3/AM负载心肌细胞,激光共聚焦显微镜观察心肌细胞钙瞬变信号变化以及心肌细胞的搏动频率?结果:① 与对照组相比,NE组心室肌细胞钙波分散?传导减慢?同步性较差,细胞搏动频率较快(26.7 ± 4.3 vs. 11.6 ± 3.6,P < 0.01)?收缩期钙瞬变峰值下降(128.37 ± 65.44 vs. 155.33 ± 61.77,P < 0.05)?达峰时间(Ttp,0.413 ± 0.324 vs. 0.212 ± 0.050,P < 0.01)?衰减时间(Tau,1.162 ± 0.524 vs. 0.722 ± 0.169,P < 0.01)均延长,钙瞬变幅度(60.80 ± 39.88 vs. 75.41 ± 36.52,P > 0.05)?谷值(67.57 ± 42.59 vs. 79.92 ± 38.05,P > 0.05)变化不大;② LeV处理后,钙波传导均匀同步,心肌细胞搏动频率及钙瞬变的峰值?幅度?谷值较NE组无明显变化,NE+LeV1组和NE+LeV2组Ttp分别为 (0.212 ± 0.044?0.205 ± 0.062)?Tau分别为(0.735 ± 0.269?0.753 ± 0.152)均较NE组缩短(P < 0.01);③NE+LeV1与 NE+LeV2两组相比,钙瞬变峰值和谷值?钙瞬变幅度?Ttp和Tau差别无统计学意义?结论:心肌细胞衰竭过程中钙瞬变减弱变慢?同步性较差;LeV通过增加钙瞬变速度?改善钙瞬变传导形式,发挥正性肌力作用?     

Rho激酶在乳鼠心肌细胞模拟缺血再灌注损伤细胞凋亡中的作用

摘要：目的观察Rho激酶在培养乳鼠心肌细胞缺血再灌注损伤细胞凋亡中的作用,及Rho激酶抑制剂盐酸法舒地尔（fasudil,F）对缺血再灌注损伤细胞凋亡的影响。方法原代培养出生1～2d的SD乳鼠心肌细胞,并行肌钙蛋白抗体免疫荧光染色鉴定,建立缺血再灌注损伤（I/R）模型。实验分3组：① 正常对照组;② I/R组;③ I/R+F组：建立I/R模型前20min 加入法舒地尔,使其终浓度分别为10μmol/L（F1组）、30μmol/L（F2组）、50μmol/L（F3组）。Western blot分别检测缺血2h,再灌注3h肌球蛋白磷酸酶目标亚单位1（myosin phosphatase target subunit 1,MYPT1）磷酸化水平,作为Rho激酶功能活化的标志。应用流式细胞仪Annexin-V/PI双色法检测再灌注3、6h时点心肌细胞的凋亡率。结果再灌注3h后MYPT1的磷酸化水平明显增加,I/R组为正常对照组的 5.7倍(P＜0.01),F1、F2、F3组法舒地尔干预后较I/R组分别减少24.6%、40.1%、60.1%（P＜0.05）;法舒地尔组再灌注3、6h心肌细胞的凋亡率较I/R组同时间点显著下降,随给药浓度的增加,细胞凋亡率呈下降趋势。结论Rho激酶在缺血再灌注心肌细胞中有促凋亡作用,法舒地尔可减少缺血再灌注心肌细胞凋亡的发生,从而发挥良好的心肌保护作用。     

新生大鼠心肌细胞培养及电生理特性观察

目的 应用原代细胞培养技术,以获取大量具有正常电生理特性的心肌细胞.方法 用胶原酶溶液处理1 d龄SD大鼠的心脏,差速贴壁法纯化获得的单个心肌细胞,CO2培养箱中培养8d后,以膜片钳技术记录心肌细胞的动作电位和各跨膜离子流.结果 细胞培养中,改进了酶溶液的成分、浓度和经典的差速贴壁法作用时间,获得了大量的高纯度单个心肌细胞.在此细胞上,采用电流钳技术,可引导出心室肌动作电位.运用心肌细胞离子通道的电压依赖性和特异阻断剂,在不同的钳制电位和指令电位下,可记录到Ina,Ica,Ito,IK等多种离子流.结论 改进的细胞培养技术可获得大量的具有正常电生理特性的心肌细胞.     

糖基化终产物对人血管平滑肌细胞表达及分泌甲状旁腺激素相关肽和血管钙化的影响

目的：观察糖基化终末产物（AGEs）对人血管平滑肌细胞表达及分泌甲状旁腺激素相关肽（PTHrP）功能的影响,探讨PTHrP影响血管平滑肌细胞钙化发生的相关机制。方法：不同浓度的AGE-BSA分别与人血管平滑肌细胞孵育相同时间后,检测各组细胞钙含量及碱性磷酸酶（ ALP）活性判断钙化程度;酶联免疫吸附法检测各组细胞PTHrP的分泌量;实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测PTHrP、核心结合因子（ cbfα1）及骨形态发生蛋白2（ BMP-2）在各组细胞中的表达量。结果：随AGEs浓度增加,细胞中的钙含量及ALP活性增加（P＜0．05）,而细胞分泌的PTHrP量逐渐减少（P＜0．05）,且AGEs可促进cbfα1、BMP-2及PTHrP在血管平滑肌细胞的表达,这在较高浓度组较为显著（ P＜0．05）。结论：适当浓度的晚期AGEs可影响人血管平滑肌细胞PTHrP的表达水平及分泌量,促进钙含量增加,进而有助于血管钙化的发生。