含不同启动子的腺病毒载体介导的人β2肾上腺素能受体基因在心肌细胞的表达

目的：观察不同的启动因子cmv,mlc-2v对腺病毒载体介导的人β2肾上腺素能受体（β2－AR）基因在大鼠心肌细胞中表达,方法：分别构建cmv,mlc-2v启动子并携带人β20－AR基因的重组腺病毒Adcmvβ2AR,Admlc,β2AR,用以感染心肌细胞,并检测心肌细胞对人β2－AR基因的表达及cAMP的含量,结果：经RT－PCR,Western免疫印迹分析证帝感染的心肌细胞均表达人β2－AR,放射性配基检测显示含mlc-2v启动子Admlcβ2AR感染的心肌细胞β2－AR密度低于含cmv启动子的A β2AR感染组（P＜0．01）,经10umol/L异丙肾上腺素作用,感染组的心肌细胞内cAMP含量明显高于对照组,感染组间存在明显差异（P＜0．01）,结论：含不同启动子的腺病毒载休感染心肌细胞后均可表达具有生物活性的人β2－AR,但两者存在差异。     

腺病毒载体介导人PML基因在人前列腺癌细胞的高效转染和表达

早幼粒细胞白血病基因（Ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃｌｅｕｋｅｍｉａ，ＰＭＬ）编码的蛋白质是一种广谱的细胞生长抑制因子，在多种肿瘤细胞中过度表达能够有效地抑制细胞生长和裸鼠体内致瘤能力。在前列腺癌、乳腺癌及结肠癌中的表达变化可能与肿瘤的分化、局部浸润和...     

新法制备含VEGF启动子驱动的CD/TK融合基因重组腺病毒

目的 应用简化的细菌内同源重组法高效制备含血管内皮细胞生长因子(VEGF)启动子驱动的CD/TK融合基因重组腺病毒。方法 先以氯化钙法替代电穿孔法将腺病毒基因组质粒pAdEasy-1导入BJ5183细菌,制备BJ5183pAdEasy-1细菌;再以后者作感受态细菌,与线性化的转移质粒pAdtrack-VEGFP-CDglyTK进行同源重组,获得重组腺病毒质粒pAdEasy-VEGFP-CDglyTK,转染293细胞,制备含VEGF启动子驱动的CD/TK融合基因重组腺病毒。结果 构建重组腺病毒质粒的成功率为60%(6/10)。转染293细胞后7~12d可收获病毒。结论 简化的细菌内同源重组法简便易行,重组效率较高,易于推广应用。     

腺病毒载体介导的血友病A基因治疗的实验研究

目的构建含人凝血因子Ⅷ基因（hFⅧ）的高效表达重组腺病毒载体。方法将含hFⅧ-cDNA（B肽缺失型）插入质粒pAdCMV－Linkerl多克隆位点,形成含SV40内含子结构的重组质粒pA－dl－hFⅧ。证实目的基因能在COS－7细胞中表达有凝血活性的FⅧ因子后,分别与pBHG10共转染至293包装细胞,经同源重组,形成E1／E3缺失型重组腺病毒AdI－hFⅧ。经鉴定和纯化,用于体内外基因转移和表达的研究。结果该病毒载体能在COS－7、A549等各种离体细胞高效转移,并表达hFⅧ蛋白。经家兔耳缘静脉注射后,hFⅧ因子表达量在l～2周内升至最高,并维持低水平至少4周。结论腺病毒介导的人B肽缺失型凝血因子Ⅷ基因能在体内外有效地转移和表达,该研究也为血友病A基因治疗提供了一条新途径。     

含有CD基因的腺病毒载体的构建

目的 :构建携带CD基因和LacZ报告基因的腺病毒载体。方法 :先将真核表达载体质粒 pCI中的转录框架构建入腺病毒载体中 ,后再将CD和LacZ基因分别装配到框架的多克隆位点内。结果 :经过酶切鉴定成功地构建了分别携带CD基因和LacZ报告基因的腺病毒载体 ,对肿瘤的前药转换基因治疗有重要意义。     

人MUC16基因启动子区域的初步分析

目的 分析人MUC16基因的转录起始位点和重要的调控区域,确定人MUC16基因的核心启动子可能存在区域.方法 用生物信息学分析人MUC16基因启动子所在区域.培养SKOV3细胞株并提取细胞基因组DNA,用PCR技术扩增启动子区域的594(-1 844/-1 250/)、548(-1 798/-1 250)、326(-1 576/-1 250)和170 bp(-1 420/-1 250)的启动子片段,分别构建重组PGEM-T质粒,再克隆入荧光素酶报告基因载体PGL3载体,构建PGL3-170、PGL3-326、PGL3-548和PGL3-594重组表达质粒.用脂质体介导的方法瞬时转染SKOV3细胞,测定荧光素酶的表达活性.结果 成功构建4种人MUC16基因启动子片段的荧光素酶报告基因表达体系,分别为PGL3-170(-1 420/-1 250)、PGL3-326(-1 576/-1 250)、PGL3-548(-1 798/-1 250)和PGL3-594(-1 844/-1 250),各缺失片段在SKOV3细胞中均有活性.MUC16的核心启动子5′端可能为PGL3-326的3′端,3′端固定在-1 250处,5′端由-1 844向-1420移动时启动子活性逐渐增强,且变化幅度较大,提示这一区间内可能存在重要的顺式作用元件.结论成功构建了人MUC16基因启动子片段的荧光素酶报告基因载体,确定人MUC16基因的核心启动子区域.     

Bek腺病毒表达载体的构建及其在哺乳类动物细胞中的表达

目的构建Bek腺病毒表达载体并观察该载体在成纤维细胞中转基因表达FGFR2-Ⅲc的情况,为研究骨骼发育打下基础.方法利用AdEasy-1腺病毒载体系统构建Bek腺病毒表达载体;该载体感染成纤维细胞后,通过荧光定量PCR(FQ-PCR)检测Bek腺病毒表达载体转基因表达FGFR2-Ⅲc mRNA情况.结果Bek腺病毒表达载体感染成纤维细胞后,成纤维细胞有绿色荧光表达,荧光定量PCR检测表明Bek腺病毒表达载体转基因表达FGFR2-Ⅲc mRNA效果明显(P＜0.05).结论Bek腺病毒表达载体构建成功,能够转基因表达FGFR2-Ⅲc mRNA,为研究骨骼发育和成骨机制提供了基础.     

Survivin启动子驱动的LRIG1基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建含Survivin启动子和LRIG1基因的重组复制缺陷型腺病毒并进行鉴定,为肿瘤基因治疗的研究奠定基础。方法应用分子克隆技术将Survivin启动子连接至pLRIGl-GFP上构建出pEGFP-Surp-LRIGl,将其与含有5型腺病毒右臂的质粒Pbhge3通过Lipofectamine2000共转染至人胚肾293细胞,经同源重组产生重组腺病毒Ad-Surp-LRIGl。Ad-Surp-LRIGl在人胚肾293细胞中大量扩增并通过氯化铯密度梯度离心法纯化,测其滴度。结果 pEGFP-Surp-LRIGl经酶切鉴定正确,扩增得到的Ad-Surp-LRIGl经PCR扩增证实为Survivin启动子驱动的LRIG1重组腺病毒,滴度为2.3×1010pfu/ml。结论成功构建出含有Sur-vivin启动子和LRIG1基因的重组复制缺陷型腺病毒并鉴定正确,可用于下一步膀胱癌基因治疗的研究中。     

心肌细胞β1和β2肾上腺素能信号传导系统的区别

尽管β     

反转录病毒载体介导含增强子的人β—珠蛋白基因在小鼠…

将人β－珠蛋白基因反向克隆以转录病毒载体Ｎ２Ａ，并在Ｎ２Ａ的ＬＴＲ插入３６ｂｐ的增强子ＨＳ２。将此反应转录病毒重组体转染ψ－２和ＰＡ３１７包装细胞系，经Ｇ４１８筛选后，分离出完整整合的并能产生较高病毒滴度的产病毒细胞系。     

重组腺病毒转染兔心肌细胞的实验研究

目的:观察腺病毒载体转染兔心肌细胞的有效性和外源性基因表达的时相性.方法:用Adv5-CAG粘粒(对照组)或Adv5-CAG/LacZ质粒(治疗组)转染兔心肌,转染后第3、7、14、28天取被转染心肌组织行X-gal染色及β-半乳糖苷酶活性检测.结果:X-gal染色示,治疗组转染后第3、7、14、28天注射部位心肌均见蓝染,尤以第7、14天明显,而对照组所有心肌均无蓝染;β-半乳糖苷酶活性检查示治疗组转染后第3天心肌中即有β-半乳糖苷酶表达,第7、14天表达达高峰,28天表达量明显减少.结论:重组腺病毒载体可成功转染兔心肌细胞,外源性基因在兔心肌细胞中能有效地表达并能维持1个月左右.     

ndrg2基因2种亚型重组腺病毒载体的构建

目的：构建表达N-myc下游调节基因2（ndrg2）2种亚型的重组腺病毒载体,为与ndrg2相关肿瘤的基因治疗奠定基础.方法：采用腺病毒表达系统ViraPowerTM Adenoviral Expression System构建腺病毒载体.首先将ndrg22种亚型（长短2种亚型分别命名为ndrg2L,ndrg2S）利用酶切、连接、转化、扩增后提取质粒等方法克隆入入门载体pENTR2B以获得入门克隆pENTR2B-NDRG2L和pENTR2B-NDRG2S,经双酶切及PCR鉴定正确后,用重组酶LR Clonase^TMⅡ Enzyme Mix进行入门克隆与表达载体pAd-CMV/V5-DEST间的重组反应,以获得表达克隆pAd-CMV/V5-DEST-NDRG2L和pAd-CMV/V5-DEST-NDRG2S的质粒.表达克隆经PCR鉴定后用限制性内切酶PacⅠ线性化后转染HEK293A包装细胞得到重组腺病毒（分别命名为Ad-NDRG2L和Ad-NDRG2S）,经过反复的感染扩增后,用半数组织培养感染剂量法（TCID50）检测病毒滴度,用Western Blot法检测重组病毒载体是否能正确表达NDRG2蛋白.结果：证实入门克隆pENTR2B-NDRG2L/S和表达克隆pAd-CMV/V5-DEST-NDRG2L/S经酶切鉴定和PCR鉴定质粒构建正确,转染HEK293A细胞并反复扩增后获得的病毒滴度分别为：Ad-NDRG2L,4.0×10^12空斑形成单位（PFU）/L;Ad-NDRG2S,6.3×1012PFU/L.且这2个病毒能正确表达NDRG2蛋白.结论：成功构建了ndrg2基因长短2种亚型的重组腺病毒载体,并包装扩增病毒,可为肿瘤基因治疗的研究提供依据.     

FnCBD64基因重组腺病毒载体Ad.FnCBD64构建的实验研究

目的 构建纤维连接蛋白羧基端细胞结合域(FnCBD64)基因重组人腺病毒载体(Ad.FnCBD64).方法 (1)FnCBD64重组腺病毒粘粒载体的构建;(2)293细胞和Hela细胞的培养;(3)磷酸钙转染;(4)FnCBD64基因重组腺病毒筛选和扩增;(5)设计腺病毒粘粒载体pAxCAwt公共PCR引物;(6)鉴定Ad.FnCBD64重组腺病毒;(7)浓缩与纯化重组腺病毒;(8)体外安全性研究.结果 成功构建了纤维连接蛋白羧基端细胞结合域(FnCBD64)基因重组腺病毒载体Ad.FnCBD64,病毒滴度较高且安全性亦高.结论 本实验成功构建了携带人FnCBD64基因的重组腺病毒,为应用FnCBD64促进骨髓间质干细胞黏附力提供了转染的载体,其使骨髓间质干细胞更快、更好地在体外构建组织工程心脏瓣膜成为可能.     

不同病毒载体感染内耳组织的比较研究

目的 通过血清5型重组腺病毒和血清2型重组腺相关病毒感染大鼠内耳组织的比较研究,筛选出更适合内耳基因治疗的病毒载体.方法 一定体积的血清5型重组腺病毒液和血清2型重组腺相关病毒液经圆窗膜注入鼓阶外淋巴液,通过荧光共聚焦显微镜、免疫组化、Western免疫印迹及听性脑干反应等方法 对两种载体所携带报告基因的表达部位、表达时程以及两种病毒本身对内耳组织细胞生活状态的影响加以比较.结果 血清5型重组腺病毒和血清2型重组腺相关病毒所携带的增强型绿色荧光蛋白报告基因均可在前庭膜、血管纹、基底膜、盖膜、螺旋神经节区及转染对侧耳表达.rAAV2携带的EGFP蛋白第14天表达开始明显增多,第60天仍可检测到高表达.rAd5携带的EGFP蛋白在耳蜗组织内的表达高峰维持在第1～21天,在30天时表达明显减弱.结论 腺病毒的优势在于其基因表达的迅速和高效,而腺相关病毒载体以其长的表达时程,低组织细胞毒性在内耳基因转染中表现出独特的优势.     

Rho蛋白与β_2肾上腺素能受体减敏的研究进展

小G蛋白Rho蛋白家族具有GTP酶活性,在细胞信号转导通路中起重要的分子开关作用,在所有的真核细胞中发挥重要的生理功能,其作用受到Rho蛋白调节因子GEF、GAP、GDI等的调节。目前研究表明RhoGDI2在β2肾上腺素能受体（β2AR）减敏的哮喘小鼠存在高表达,而G蛋白偶联受体激酶2（GRK2）在β2AR胞内信号转导中调控β2AR的减敏,小G蛋白又可以直接影响GRK2的活性,故RhoGDI2、Rho蛋白、GRK2、β2AR减敏之间的关系的研究将为β2AR减敏机制研究提供新的方向,为临床防治β2AR减敏提供一定的依据。     

转染bcl-2基因对心肌细胞活力的影响

目的：研究转染抗凋亡基因bcl-2对心肌细胞活力的影响。方法：提取含有人bcl－2基因的逆转录病毒真核表爱载体pDOR-SB质粒，用脂质体介导的基因转染法分别将pDOR-SB质粒和pDOR质粒（不含bcl-2基因）转染心肌细胞，观察转染心肌细胞在缺氧环境下的存活能力。结果：（1）原位杂交可见bcl-2基因转染了心肌细胞；（2）转染bcl-2基因能明显提高心肌细胞在缺氧条件下的存活能力，提高对岂氧的耐受力。结论：转染bcl-2基因能显提高心肌细胞对缺氧的耐受性。     

hTERT启动子调控的PUMA腺病毒转染卵巢癌COC1细胞的研究

目的：探讨卵巢癌COC1细胞中大量表达p53正向凋亡调控因子（PUMA）在抑制COC1细胞中的作用。方法采用人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子调控的PUMA基因腺病毒载体（Ad-hTERT-PUMA）转染卵巢癌COC1细胞,通过细胞活性检测试剂盒和凋亡试剂盒研究COC1细胞的生长情况,同时分析表达PUMA的水平。结果转染Ad-hTERT-PUMA后,PU-MA大量表达,抑制COC1细胞生长,促进细胞凋亡。结论Ad-hTERT-PUMA成功转染卵巢癌COC1细胞并大量表达,起到了抑制卵巢癌细胞增长的作用。     

人CIITA基因启动子Ⅳ不同单倍型DNA真核表达载体的构建

目的:构建人MHC Ⅱ类反式激活因子(CIITA)基因启动子Ⅳ4种不同单倍型DNA的真核表达载体.方法:根据人CIITA基因启动子Ⅳ区的2个单个核苷酸多态性(SNPs)位点C-1350T和G-944C,可以构建出4种单倍型(CG、CC、TG和TC).分别以CG/CG、CC/CC、TG/TG和TC/TC4种基因型的人基因组DNA为模板,用PCR法扩增出包含启动子Ⅳ两个SNP位点的长487bp的DNA片断,TA克隆至pMD18-T Simple载体后用MluⅠ/HindⅢ双酶切,纯化回收后分别与同样双酶切的荧光素酶报告基因载体PGL3一Basic和PGL3-Promomr相连接,构建CG-PGL3一Basic、CG-PGL3-Promoter、CC-PGL3-Basic、CC-PGL3-Promoter、TG-PGL3-Basic、TG-PGL3-Promoter、TC-PGL3-Basic、TC-PGL3-Promoter8个表达载体,并测序验证其DNA序列.结果:实验得到含有人CIITA基因启动子Ⅳ4种不同单倍型DNA序列的真核表达载体8个,且测序证实了这8个表达载体序列与理论序列完全一致.结论:成功构建人CIITA基因启动子Ⅳ不同单倍型的真核表达载体,为CIITA基因启动子Ⅳ不同单倍型的功能研究奠定基础.     

Id1启动子的荧光素酶报告基因载体的构建及其在肝癌HepG2细胞中的活性检测

目的:扩增Id1启动子基因,构建Id1启动子的报告基因载体. 方法:通过PCR及双酶切方法,从HepG2细胞基因组DNA中获得Id1基因编码序列上游包含不同长度碱基的两段Id1启动子序列;分别克隆到报告基因pGL3-enhancer载体上,构建包含两段不同长度Id1启动子的报告基因载体;用脂质体转染法将两报告基因载体分别转染至肝癌HepG2细胞系;采用双荧光素酶报告基因系统评估Id1启动子活性. 结果:经PCR方法扩增出大小分别为1096 bp和266 bp的两段不同长度的Id1启动子片段,序列测定其编码序列及读框正确,酶切鉴定亚克隆序列正确. 瞬时转染HepG2后经报告基因检测,两段启动子均具有转录活性. 结论:成功构建了Id1启动子的报告基因载体,为进一步研究Id1启动子和肝癌的关系奠定了实验基础.