应用基因表达谱芯片技术筛选HCV p7蛋白反式调节基因

目的应用基因芯片技术对pcDNA3.1(-)和pcDNA3.1(-)-p7分别转染的HepG2细胞的基因表达谱进行分析,筛选能被HCV p7蛋白反式调节的靶基因,研究p7蛋白的生物学功能。方法以含有HCV全基因组的pBRTM质粒作为模板,应用聚合酶链反应(PCR)扩增p7蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术构建表达载体pcDNA3.1(-)-p7。以脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较。结果构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误,提取高质量的总mRNA并逆转录成cDNA,进行DNA芯片技术分析。在1152个基因表达谱的筛选中,有1个基因表达水平显著上调,22个基因表达水平显著下调。结论 HCV p7蛋白是一种反式调节因子,p7基因的表达对于肝细胞基因表达谱有显著影响。     

HCV p7蛋白反式调节新基因3及其剪切体克隆化和生物信息学分析

目的:筛选HCV p7病毒蛋白反式调节的新靶基因p7TP3,克隆p7TP3基因及其不同剪切体基因序列,并进行功能分析,探讨丙型肝炎病毒(HCV)p7病毒蛋白在HCV致病过程中的作用．方法:依据我们构建的真核表达载体pcDNA 3．1(-)-p7转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总RNA,逆转录为cDNA后进行基因表达谱芯片分析,利用生物信息学技术获得新基因 p7TP3及其可变剪切体的编码序列,设计特异性引物,并对其进行克隆化研究. 结果:经测序鉴定获得新基因p7TP3的编码序列,并发现了p7TP3的不同剪切体,对 D7TP3基因组进行分析,获得剪切体的编码序列,并进行了克隆化研究及生物信息学分析．p7TP3(416 bp)编码蛋白质序列比 p7TP3(477 bp)少TQNTDVYPGLAVFFQNAL IFFSTLIY 26个氨基酸残基,其余序列相同．结论:HCV p7蛋白是一种典型的病毒基因组编码的具有反式调节作用的蛋白．利用分子生物学技术与生物信息学分析,发现并鉴定了HCV p7TP3反式调节作用的新的靶基因 p7TP3及其剪切体,为阐明HCV p7蛋白的反式调节作用及其机制开辟了新的研究方向．     

HBV X蛋白反式调节基因XTP11的克隆化研究

目的:应用寡核苷酸基因芯片技术及生物信息学分析,筛选并克隆乙肝病毒X蛋白(HBxAg)反式激活新型靶基因.方法:以HBxAg表达质粒pcDNA 3.1(-)-X转染HepG2细胞,以空载体pcDNA 3.1(-)为平行对照,提取mRNA并进行寡核苷酸基因芯片分析.对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性.通过序列同源性搜索和比对和电子拼接,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列.从转染了pcDNA 3.1(-)-X的HepG2细胞提取总RNA,以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实.结果:该新基因命名为XTP11,在GenBank中注册,注册号为AY740520.该基因的编码序列全长为1 344个核苷酸(nt),编码产物由448个氨基酸残基(aa)组成.结论:HBxAg反式激活新型靶基因XTP11的筛选与克隆,为进一步研究HBxAg反式激活作用的分子生物学机制奠定基础.     

丙型肝炎病毒F蛋白反式激活基因2的克隆化研究

目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioinformatics)技术筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)F蛋白反式激活新型靶基因,进一步阐明HCV感染相关疾病的发病机制.方法:以HCV F蛋白表达质粒pcDNA3.1(-)-F转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析.应用分子生物学技术,结合生物信息学技术,克隆HCV F蛋白反式激活作用的新的靶基因.结果:对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段.从HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实,因其可以被F蛋白反式激活,故命名为F蛋白反式激活蛋白2(HCV FTP2),已在GenBank中注册,注册号:AY740522.HCV FTP2基因的编码序列全长为177个核苷酸(nt),编码产物由58个氨基酸残基(aa)组成.结论:HCV F蛋白在病毒的自然感染过程中有明显的表达,最近的研究表明蛋白还具有反式激活的作用,上调宿主细胞某些基因的表达,可能参与HCV致癌.HCV F反式激活新靶基因的发现,为进一步研究HCV F蛋白的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定了基础.     

乙型肝炎病毒DNA聚合酶逆转录酶蛋白反式调节基因1的克隆化研究

目的　应用抑制性消减杂交 (SSH)技术及生物信息学 (bioinformatics)技术筛选并克隆乙型肝炎病毒 (HBV)DNA聚合酶(DNAPolymerase)逆转录酶 (RT)区蛋白的反式调节新型靶基因 ,进一步阐明HBV感染相关疾病的发病机制。方法　以HBVDNA聚合酶RT基因的表达质粒pcDNA3 1( -) RT转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 1( -)为平行对照 ,提取mRNA并进行SSH分析。并应用分子生物学技术 ,结合生物信息学技术 ,克隆RT反式调节作用的新的靶基因。结果　对于所获基因片段序列分析表明 ,其中之一为新型基因片段。从HepG2细胞提取总RNA ,以逆转录多聚酶链反应 (RT PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列 ,并测序证实 ,因其可以被HBVDNA聚合酶逆转录酶RT反式激活 ,故命名为DNA多聚酶反式激活蛋白 1(DNAPTP1) ,已在GenBank中注册 ,注册号 :AY45 0 3 89。DNAPTP1基因的编码序列全长为 43 5个核苷酸 (nt) ,编码产物由 14 4个氨基酸残基 (aa)组成。结论　HBVDNA聚合酶逆转录酶RT在HBV进入宿主细胞的过程中起着重要的作用 ,最近的研究表明RT蛋白还具有反式激活的作用 ,上调宿主细胞某些基因的表达 ,从而改变宿主正常的免疫应答水平 ,引起病变。逆转录酶RT反式激活新靶基因的发现 ,为进一步研究RT蛋白的分子生物学机制和探索新型治疗     

乙型肝炎病毒前-S1蛋白反式激活蛋白3基因的克隆化研究

目的应用抑制性消减杂交技术(SSH)及生物信息学技术(bioinformatics)筛选并克隆乙型肝炎病毒(HBV)前-S1蛋白(Pre-S1)反式激活新型靶基因，进一步阐明HBV感染相关疾病的发病机制。方法以HBV前-S1蛋白表达质粒pcDNA3．1(-)-PreS1转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照，提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。并应用分子生物学技术，结合生物信息学技术，克隆HBV前-S1反式激活作用的新的靶基因。结果对于所获基因片段序列分析表明，其中之一为新型基因片段。从HepG2细胞提取总RNA，以逆转录多聚酶链反应(RT—PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列，并测序证实，因其可以被前-S1蛋白反式激活，故命名为前-S1反式激活蛋白3(PSITP3)，已在GenBank中注册，注册号：AY446274。PSITP3基因的编码序列全长为1173个核苷酸(nt)，编码产物由390个氨基酸残基(aa)组成。结论HBV前-S1蛋白在HBV进入宿主细胞的过程中起着重要的作用，最近的研究表明前-S1蛋白还具有反式激活的作用，上调宿主细胞某些基因的表达，从而改变宿主正常的免疫应答水平，引起病变。HBV前-S1反式激活新靶基因的发现，为进一步研究HBV前-S1蛋白的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。     

乙型肝炎病毒前-S1蛋白反式激活蛋白2基因的克隆化研究

目的：应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioinformatics)技术筛选并克隆乙型肝炎病毒(HBV)前-S1蛋白(pre-S1)反式激活新型靶基因,进一步阐明HBV感染相关疾病的发病机制。方法：以HBV前-S1蛋白表达质粒pcDNA3．1(-)-pre-S1转染HepG2细胞．以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。并应用分子生物学技术,结合生物信息学技术,克隆HBV前-S1反式激活作用的新的靶基因。结果：对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段。从HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实,因其可以被前-S1蛋白反式激活,故命名为前-S1反式激活蛋白2(PS1TP2),已在GenBank中注册,注册号：AY426673。PS1TP2基因的编码序列全长为573个核苷酸(nt),编码产物由190个氨基酸残基(aa)组成。结论：HBV前-S1蛋白在HBV进入宿主细胞的过程中起着重要作用,最近的研究表明前-S1蛋白还具有反式激活的作用,上调宿主细胞某些基因的表达,从而改变宿主正常的免疫应答水平,引起病变。HBV前-S1反式激活新靶基因的发现,为进一步研究HBV前-S1蛋白的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。     

乙型肝炎病毒前-S1蛋白反式激活蛋白l基因的克隆化研究

目的　应用抑制性消减杂交 (SSH)技术及生物信息学 (bioinformatics)技术筛选并克隆乙型肝炎病毒 (HBV)前 S1蛋白(pre S1)反式激活新型靶基因 ,进一步阐明HBV感染相关性疾病的发病机制。方法　以HBV前 S1蛋白表达质粒pcDNA3 .1(-) PreSl转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 .1(-)为平行对照 ,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。并应用分子生物学技术 ,结合生物信息学技术 ,克隆HBV前 Sl反式激活作用的新的靶基因。结果　对于所获基因片段序列分析表明 ,其中之一为新型基因片段。从HepG2细胞提取总RNA ,以逆转录多聚酶链反应 (RT PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列 ,并测序证实 ,因其可以被前 S1蛋白反式激活 ,故命名为前Sl反式激活蛋白 1(PSlTPl) ,已在GenBank中注册 ,注册号 :AY42 6672。PSlTPl基因的编码序列全长为64 2个核苷酸 (nt) ,编码产物由 2 13个氨基酸残基 (aa)组成。结论　HBV前 Sl蛋白在HBV进入宿主细胞的过程中起着重要的作用 ,最近的研究表明前 Sl蛋白还具有反式激活的作用 ,上调宿主细胞某些基因的表达 ,从而改变宿主正常的应答水平 ,引起病变。HBV前 Sl反式激活新靶基因的发现 ,为进一步研究HBV前 Sl蛋白的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础     

乙型肝炎病毒DNA聚合酶中核糖核酸酶RNase H反式调节基因DNAPTP4的克隆化研究

目的应用抑制性消减杂交(SSH)技术筛选乙型肝炎病毒(HBV)核糖核酸酶RNaseH蛋白反式激活基因差异表达的cDNA,克隆RNaseH反式激活相关靶基因。方法以RNaseH表达质粒pcDNA31(-)RNaseH转染HepG2细胞,以空载体pcDNA31(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaⅠ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析,其未知基因片段通过Kozak规则和多聚腺苷酸信号序列,初步确定。以逆转录聚合酶链反应(RTPCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序加以证实。结果该新基因被命名为DNAPTP4,在GenBank中注册,注册号为AY450392。DNAPTP4基因的编码序列全长为828个核苷酸(nt),编码产物由276个氨基酸残基(aa)组成。结论应用SSH技术成功筛选与克隆RNaseH反式激活新型靶基因DNAPTP4,为进一步阐明RNaseH反式调节作用及其在HBV感染中的分子生物学机制提供理论依据和研究方法。     

Hepatitis C virus p7: molecular function and importance in hepatitis C virus life cycle and potential antiviral target

p7, a 63‐residue peptide encoded by hepatitis C virus (HCV), a major pathogen associated with a risk of developing severe liver disease, is involved in ion channel activity in lipid bilayer membranes both in in vitro and cell‐based assays. p7 protein consists of two transmembrane α‐helices, TM1 and TM2 connected by a loop oriented towards the cytoplasm. HCV relies on p7 function in addition to ion channel formation for efficient assembly, release and production of infectious progeny virions from liver cells. p7 activity is strictly sequence specific as mutation analysis showed the loss of ion channel function. Moreover, p7 ion channel activity can be specifically inhibited by different drugs suggesting the protein as a new target for future antiviral chemotherapy. In the present review, we focused to bring together the recent development to explore the potential role of p7 protein in HCV infection and its inhibition as a therapy.     

C7orf69基因的克隆表达及生物信息学分析

目的体外克隆表达并纯化C70rf69重组蛋白,对C70rf69蛋白进行生物信息学分析。方法PCR扩增C70rf69目的基因片段,构建原核表达载体,转化BL21,IPTG诱导目的蛋白表达,SDS—PAGE和Westernblot鉴定,Ni-NTA纯化目的蛋白。结果扩增获得序列完全正确的C70rf69基因片段（自然变异体）,重组蛋白以包涵体的形式高效表达,在非变性条件下获得较高纯度的重组蛋白。生物信息学软件预测C70rf69蛋白（含信号肽）含有PKC、CK2磷酸化位点和N-十四烷基化位点。结论成功的对分泌蛋白C70rf69进行了基因克隆、表达与初步纯化,为其进一步的功能研究奠定了坚实的基础。     

p7TP2融合蛋白在大肠埃希菌中的表达及其多克隆抗体的制备和应用

目的应用基因芯片技术筛选获得p7蛋白反式调节的新基因,即丙型肝炎病毒(HCV)p7蛋白反式激活基因p7TP2,研究其生物学功能。方法应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增其全长cDNA序列,并构建原核表达载体pET-32a(+)-p7TP2,转入大肠埃希菌Rosetta-gami B中,通过异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组融合蛋白,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析在相对分子量约35kD处有一条特异的蛋白质条带,以包涵体形式表达,并通过蛋白质变性、重折叠及纯化后得到了高纯度融合蛋白,将重组蛋白免疫新西兰大耳白兔,制备抗-p7TP2多克隆抗体。结果经酶联免疫吸附法(ELISA)测定、蛋白印迹(Western blot)和免疫组织化学鉴定,制备的多克隆抗体具有较高效价和特异性。结论 p7TP2蛋白的表达及多克隆抗体的制备为进一步研究HCV p7TP2蛋白的功能及丙型肝炎的发病机理创造了条件。     

Screening of genes of proteins interacting with p7 protein of hepatitis C virus from human liver cDNA library by yeast two-hybrid system

AIM: To investigate the biological function of p7 protein and to look for proteins interacting with p7 protein in hepatocytes. METHODS: We constructed p7 protein bait plasmid by cloning the gene of p7 protein into pGBKT7, then transformed it into yeast AH109 (a type). The transformed yeast was mated with yeast Y187 (a type) containing liver cDNA library plasmid, pACT2 in 2xYPDA medium. Diploid yeast was plated on synthetic dropout nutrient medium (SD/-Trp-Leu-His-Ade) containing x-α-gal for selection and screening. After extracting and sequencing of plasmids from blue colonies, we performed sequence analysis by bioinformatics. RESULTS: Fifty colonies were selected and sequenced. Among them, one colony was Homo sapiens signal sequence receptor, seven colonies were Homo sapiens H19, seven colonies were immunoglobulin superfamily containing leucine-rich repeat, three colonies were spermatid peri-nuclear RNA binding proteins, two colonies were membrane-spanning 4-domains, 24 colonies were cancer-associated antigens, four colonies were nucleoporin 214 ku and two colonies were CLL-associated antigens. CONCLUSION: The successful cloning of gene of protein interacting with p7 protein paves a way for the study of the physiological function of p7 protein and its associated protein.     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活基因2的克隆化研究

目的 应用抑制性消减杂交技术(SSH)及生物信息学技术(bioinformcs)筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3(NS3)反式激活新型靶基因，进一步阐明HCV感染相关疾病的发病机制。方法 以HCVNS3蛋白表达质粒pcDNA3．1(-)-NS3转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照，提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。并应用分子生物学技术，结合生物信息学技术，克隆HCvNS3反式激活作用的新的靶基因。结果 对于所获基因片段序列分析表明，其中之一为新型基因片段，从HepG2细胞提取总RNA，以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列，并测序证实，因其可以被NS3蛋白反式激活，故命名为NS3TP2，在GenBank中注册，注册号为AYll6970。NS3TP2基因的编码序列全长为1299个核苷酸(nt)，编码产物由432个氨基酸残基(aa)组成。结论 HCVNS3是一种典型的病毒基因组编码的具有反式激活作用的蛋白，而抑制性消减杂交(SSH)是一种鉴定、分离组织细胞中选择性表达基因的技术。通过这种技术，发现了HCVNS3反式激活作用的新的靶基因，这一发现，为进一步研究HCVNS3蛋白反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。     

Chimeric GB virus B genomes containing hepatitis C virus p7 are infectious in vivo

BACKGROUND/AIMS: The development of new therapies for hepatitis C virus (HCV) infection has been hampered by the lack of a small animal model. GB virus B (GBV-B), which infects new world monkeys, has been proposed as a surrogate system for HCV replication. Despite their short genetic distance, however, difficulties exist when extrapolating results from GBV-B to the HCV system. One way of addressing this is the creation of chimeric GBV-B containing HCV elements. METHODS: Construction and analysis of GBV-B chimeras in which the p13 ion channel was replaced by its HCV counterpart, p7. RESULTS: Replacing all, or part of, the GBV-B p13 protein with HCV p7 resulted in viable chimeras which replicated at wild-type levels in marmosets following intra-hepatic RNA injection. Serum from one animal injected with chimeric RNA was infectious in three na?ve recipients, indicating that chimeras formed fully infectious virions. Amantadine, which blocks the ion channel activity of both HCV and GBV-B proteins in vitro, also inhibited GBV-B replication in primary hepatocytes. CONCLUSIONS: These viruses highlight the potential for chimeric GBV-B in the development of HCV-specific therapies and will provide a means of developing HCV p7 as a therapeutic target.