皮肤黑素瘤中miRNA-34c的表达对促血管新生因子VEGF-A、VEGFR-1的影响

目的探讨皮肤黑素瘤中miRNA-34c的表达以及其对促血管新生因子VEGF-A和VEGFR-1的影响。方法 Northern blotting检测原代人黑素瘤细胞、黑素瘤细胞株A375和原代人表皮黑素细胞miRNA-34c表达。构建miRNA-34c基因过表达与基因敲低的黑素瘤细胞株A375细胞系即高表达miRNA-34c组和低表达miRNA-34c组,以空载体转染黑素瘤细胞株A375作为空载体对照组。CCK-8法检测各组细胞增殖活性。qRT-PCR和Western blotting分别检测各组VEGF-A、VEGFR-1 mRNA和蛋白表达。结果与原代人表皮黑素细胞相比,黑素瘤细胞株A375和原代人黑素瘤细胞中miRNA-34c的表达降低(P<0.05)。高表达miRNA-34c组、低表达miRNA-34c组和空载体对照组细胞增殖活性无明显差异(P>0.05)。高表达miRNA-34c组VEGF-A、VEGFR-1的mRNA和蛋白表达较空载体对照组降低(P<0.05)。低表达miRNA-34c组VEGF-A、VEGFR-1的mRNA和蛋白表达较空载体组升高(P<0.05)。结论 miRNA-34c在皮肤黑素瘤中呈现特异性下调,miRNA-34c可能通过对促血管新生因子VEGF-A、VEGFR-1的下调参与皮肤黑素瘤的发生与发展。     

短发卡RNA抑制黑素瘤细胞BRAFV600E突变基因的研究

目的 探讨BRAF^V600E突变基因在黑素瘤发展过程中的作用。方法 用构建成功的质粒载体转染人黑素瘤细胞株A375,并建立动物模型来检测其在体内的干扰作用。分别采用RT-PCR和蛋白质印迹法检测体内外BRAF基因的mRNA和蛋白表达。结果 特异性短发卡RNA在体内外均可抑制人黑素瘤细胞BRAF基因mRNA和蛋白的表达,使其蛋白表达量分别减少62%和90%。在动物模型中使黑素瘤细胞的成瘤性下降,可以抑制肿瘤增长缓慢,抑瘤率达到62%。结论 BRAF^V600E突变基因在黑素瘤的发展中有一定的作用。     

短发卡RNA对人黑素瘤细胞BRAF基因的沉默作用

目的构建BRAF基因序列特异性的短发卡RNA(shRNA)质粒载体,检测其对人黑素瘤细胞BRAF基因的干扰作用。方法设计2条BRAF基因序列特异性的shRNA编码序列和1条非特异性阴性对照序列,插入质粒pGenesil-1,双酶切和测序鉴定。用构建成功的3条质粒转染人黑素瘤细胞株A375和M14,分别采用RT-PCR和蛋白印迹检测其BRAF基因的mRNA和蛋白表达。结果所设计的shRNA序列被正确插入质粒pGenesil-1。非特异性对照质粒neg对黑素瘤细胞BRAF基因表达不产生干扰,2条序列特异性质粒braf1和braf2抑制了BRAF基因mRNA和蛋白的表达,其中braf1干扰效果最为明显,最高抑制率可达90%。结论质粒介导的shRNA可成功干扰人黑素瘤细胞BRAF基因的表达,其抑制时间可持续至少1个月。     

微小RNA let-7a下调黑素瘤A375细胞系BRAF蛋白的表达

目的:评价微小RNA let-7a对黑素瘤A375细胞系BRAF蛋白表达的影响。方法:采用蛋白印迹法检测BRAF蛋白在A375细胞及黑素细胞的表达;用微小RNA let-7a的模拟物及阴性对照分别转染A375细胞,CCK-8实验检测细胞增殖情况。结果:与黑素细胞相比,BRAF蛋白在黑素瘤A375细胞表达升高;与阴性对照相比,微小RNA let-7a的模拟物转染A375细胞后,抑制细胞增殖,BRAF蛋白表达下降。结论:微小RNA let-7a可抑制黑素瘤A375细胞增殖,下调BRAF蛋白表达。     

MIA基因-RNAi对人黑素瘤A375细胞增殖的影响

目的探讨RNA干扰技术抑制恶性黑素瘤细胞株A375MIA基因表达后,对A375细胞增殖的影响。方法构建针对人黑素瘤A375细胞(MIA)基因3个不同靶序列的RNAi真核表达载体pLTE-hMIA-RNAi,用磷酸钙细胞转染法把构建的载体分别转染HEK293细胞,采用Western技术和RT-PCR技术分别检测MIA基因蛋白的表达和mRNA水平。选择对MIA基因表达抑制作用最强的RNAi载体转染A375细胞后,用细胞计数检测细胞增殖的变化。结果构建的3个RNAi质粒和对照组相比,pLTE-hMIA-RNAi352质粒对MIA的表达减少量>80%,hMIA的mRNA水平下降约83%,与对照组比较差异有显著性意义。而pLTE-hMIA-RNAi203、pLTE-hMIA-RNAi343质粒对MIA的表达及mRNA水平的影响,与对照组比较差异无显著性意义。转染pLTE-hMIA-RNAi352质粒的A375细胞增殖能力较对照组显著下降。结论构建的针对人MIA基因352位靶序列的RNAi质粒pLTE-hMIA-RNAi352可显著抑制MIA的表达及A375细胞增殖。     

miRNA-21在人黑素瘤细胞系A375和M14中的表达及功能初探

目的 探讨miRNA-21在人黑素瘤细胞系A375、M14中的表达及对其细胞活性的影响。 方法 采用荧光定量PCR法,以U6基因为内参,分别检测A375、M14细胞中miRNA-21的相对含量。利用LipofectamineTM2000脂质体将三种浓度的miRNA-21抑制剂分别转染这两种细胞系,用CCK-8检测转染前后实验组、对照组的细胞活性。用SPSS13.0统计软件分析细胞活性的变化情况。结果 荧光定量PCR法检测提示,miRNA-21在A375细胞系中的表达（2－ΔCT值为1.2928 ± 0.1509）明显高于M14细胞系（2－ΔCT值为0.1894 ± 0.1803）。miRNA-21抑制剂浓度为90 nmol/L时,A375、M14细胞活性受到极显著抑制,细胞活性（R值）分别为0.7362 ± 0.1662、0.7295 ± 0.1478;当浓度为180 nmol/L、270 nmol/L时,A375细胞活性显著下降,R值分别为0.7248 ± 0.3204、0.6767 ± 0.2998,而M14细胞活性无显著变化。结论 miRNA-21在A375、M14两种人黑素瘤细胞系中均有不同程度的表达。miRNA-21在A375、M14细胞系中可以促进细胞增殖,可能下调了某些肿瘤抑制因子而起到癌基因样作用。     

RNAi沉默c-Met基因对黑素瘤A375细胞生物学行为的影响

目的探讨c-MetshRNA表达载体对人黑素瘤A375细胞增殖、侵袭能力的影响。方法以pGenesil-1质粒为载体,以c-Met为靶基因,构建shRNA表达载体,并将其转染至体外培养的人黑素瘤A375细胞中。倒置相差显微镜下观察经干扰后瘤细胞的形态学变化;采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot法分别检测转染细胞c-Met基因和蛋白的表达水平;四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)检测转染后细胞的生长活力;Transwell小室法测定转染细胞体外侵袭能力。结果构建了pGenesil-1-c-MetshRNA重组质粒,并成功转染A375细胞。转染后A375细胞缩小,变圆。RT-PCR显示转染后c-Met mRNA的表达显著降低,以48h为著,下降近64%;Western blot证实转染后蛋白的表达下降近65%;MTT法显示细胞的活力降低为(68.25±4.4)%;Transwell小室测定转染细胞体外侵袭能力明显下降。结论 pGenesil-1-c-MetshRNA重组质粒明显下调c-Met在黑素瘤细胞中的表达,并抑制肿瘤细胞增殖及其侵袭能力。     

腺病毒介导p27mt基因转移诱导恶性黑素瘤细胞凋亡的实验研究

目的:探讨突变型p27基因(p27mutant type gene;p27mt)对恶性黑素瘤A375细胞凋亡的调节作用。方法:利用重组腺病毒Ad-p27mt转染培养的人恶性黑素瘤A375细胞,用3H-TdR掺入法检测细胞增殖;流式细胞术、DNA片段分析法、TUNEL法检测细胞凋亡。结果:重组腺病毒Ad-p27mt在MOI≥50时,可达到100%的转导效率。Ad-p27mt转染恶性黑素瘤细胞A375后,3H-TdR掺入法检测发现细胞增殖抑制;流式细胞术检测在G1期前出现亚二倍体凋亡峰;细胞DNA抽提电泳后发现凋亡特征性梯带。TUNEL法检测凋亡指数分别为48.5±3.6(Ad-p27mt组)及4.2±0.8(空白对照组),差异有显著性(P<0.01)。结论:重组腺病毒介导的p27mt基因转移可诱导恶性黑素瘤A375细胞在Gl期阻滞并导致细胞凋亡。     

抑癌基因DKK3对皮肤恶性黑素瘤细胞增殖和凋亡的影响北大核心CSCD

目的 探讨DKK3 在人皮肤恶性黑素瘤细胞及组织中的表达及其对黑素瘤细胞A375增殖与凋亡的影响。方法 通过反转录（RT）？PCR及实时定量PCR分析DKK3 mRNA在人恶性黑素瘤细胞系HM、A375、WM451、WM35、SK？MEL？1、Hs？695T和MDA？MB？435s及38例原发性黑素瘤、4例转移性黑素瘤和20例色素痣组织中的相对表达。分别转染恶性黑素瘤A375细胞pcDNA3.1（＋）？Flag？DKK3 质粒（实验组）和pcDNA3.1（＋）？Flag？Vector 质粒（对照组），RT？PCR 验证 DKK3 的过表达；通过CCK8法和平板克隆实验分析 DKK3 对A375细胞增殖的影响，流式细胞仪分析 DKK3对A375细胞凋亡的影响，Western印迹检测A375细胞周期和凋亡相关蛋白的表达。结果 DKK3 mRNA 在WM35细胞系表达下调，HM、A375、WM451、SK？MEL？1和Hs？695T细胞系表达缺失，MDA？MB？435s细胞高表达。与色素痣相比，DKK3 mRNA在人恶性黑素瘤组织表达降低（P 〈 0.001）。与对照组A375细胞相比 （100%），实验组A375细胞克隆形成效率明显受到抑制（23.22% ± 3.55%）；同时转染后24、48、72 h细胞活性受到明显抑制（均P 〈 0.05）。流式细胞仪检测发现，与对照组A375细胞（G1期，25.38% ± 2.92%）相比，实验组A375细胞明显阻滞于G1期（48.68% ± 3.92%，P 〈 0.001），细胞凋亡率明显升高（P 〈 0.001）。与对照组A375细胞相比，实验组周期凋亡相关蛋白p21、Bax、活化的parp和 活化的Caspase？3表达升高，细胞周期蛋白D1和Bcl2表达降低（均P 〈 0.001）。结论 DKK3在人皮肤恶性黑素瘤组织中表达下调，可能作为潜在的抑癌基因参与皮肤恶性黑素瘤的进展。     

抑癌基因DKK3过表达抑制人皮肤黑素瘤细胞迁移和侵袭的机制探讨

目的 探讨DKK3 在人皮肤恶性黑素瘤细胞及组织中的表达及转染DKK3对人黑素瘤细胞A375迁移与侵袭的影响。方法 通过Western印迹法分析DKK3在人黑素瘤细胞系（HM、A375、WM451、SK?MEL?1、Hs?695T、MDA?MB?435s、WM35）及色素痣细胞中的表达,实时荧光定量PCR检测2014 年8月至2017年6月在重庆市中医院皮肤科收集的58例恶性黑素瘤（包括原发性黑素瘤与转移性黑素瘤）和30例色素痣组织中DKK3 mRNA的相对表达水平。分别转染pcDNA3.1（+）?Flag?Vector质粒（对照组）和pcDNA3.1（+）?Flag?DKK3 质粒（转染组）至恶性黑素瘤 A375 细胞中,通过实时荧光定量PCR和Western印迹法验证 DKK3 的过表达,及DKK3过表达对黑素瘤细胞迁移和侵袭相关的分子表达水平的影响;通过细胞平板划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验分析DKK3对A375细胞迁移及侵袭的影响。采用SPSS 13.0软件进行统计学分析,两独立样本间的比较采用t检验;多组数据的比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD?t检验。结果 DKK3蛋白在人黑素瘤细胞系中表达缺失或低表达,在色素痣组织中高表达。原发性黑素瘤、转移性黑素瘤与色素痣中DKK3 mRNA表达水平（2?ΔΔCt）分别为（0. 325 ± 0.150） × 10?3、（0. 142 ± 0.210） × 10?3、（0. 634 ± 0.120） × 10?3,差异有统计学意义（F = 46.57,P < 0.05）,转移性黑素瘤表达水平低于原发性黑素瘤和色素痣 （LSD?t分别为2.48、3.12,均P < 0.05）。A375 细胞转染DKK3后,细胞划痕迁移率（22.11% ± 5.11%）低于对照组（54.36% ± 23.22%）（t = 2.36,P < 0.001）;迁移及侵袭实验中,转染组穿出小室细胞数（265 ± 33、76 ± 18）低于对照组（429 ± 41、135 ± 21）,差异有统计学意义（t值分别为1.24、1.35,均P < 0.001）。转染组A375细胞过表达DKK3后,上皮钙黏着蛋白和mRNA表达上升,神经钙黏着蛋白、波形蛋白、基质金属蛋白酶2（MMP2）、MMP7、MMP11蛋白和mRNA的表达下降。结论 DKK3在黑素瘤细胞系和组织中表达下调,DKK3过表达后A375 细胞的迁移和侵袭受到明显抑制,DKK3可能是抑制皮肤恶性黑素瘤转移的靶点。