iTRAQ技术筛选人黑素瘤A375细胞系let-7a靶标蛋白

目的 同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）技术在人黑素瘤A375细胞系中筛选let-7a潜在的靶标蛋白,探讨let-7a的抑癌机制。 方法 100 nmol/L let-7a模拟物及其对照转染A375细胞,提取细胞总蛋白,运用同位素标记的iTRAQ技术分析和鉴定差异表达的蛋白质,运用生物信息学分析let-7a靶标蛋白及其功能,采用双荧光素酶报告系统验证靶标。 结果 let-7a模拟物组和对照组相比,质谱共分析鉴定到327个显著差异蛋白,其中表达量上调 > 1.2倍的蛋白有151种,下调 < 0.8倍的蛋白有176种。下调的176种蛋白中,软件预测到结合靶标有47个,双荧光素酶报告系统验证表明,let-7a模拟物组与对照组相比,HMGA2和THOC2野生型3′UTR比值分别降低64.3%和46.4%。 结论 iTRAQ技术和生物信息学方法在人黑素瘤A375细胞系中筛选出47个let-7a候选靶标蛋白,其中HMGA2和THOC2分别为let-7a的靶标。     

miRNA-21在人黑素瘤细胞系A375和M14中的表达及功能初探

目的 探讨miRNA-21在人黑素瘤细胞系A375、M14中的表达及对其细胞活性的影响。 方法 采用荧光定量PCR法,以U6基因为内参,分别检测A375、M14细胞中miRNA-21的相对含量。利用LipofectamineTM2000脂质体将三种浓度的miRNA-21抑制剂分别转染这两种细胞系,用CCK-8检测转染前后实验组、对照组的细胞活性。用SPSS13.0统计软件分析细胞活性的变化情况。结果 荧光定量PCR法检测提示,miRNA-21在A375细胞系中的表达（2－ΔCT值为1.2928 ± 0.1509）明显高于M14细胞系（2－ΔCT值为0.1894 ± 0.1803）。miRNA-21抑制剂浓度为90 nmol/L时,A375、M14细胞活性受到极显著抑制,细胞活性（R值）分别为0.7362 ± 0.1662、0.7295 ± 0.1478;当浓度为180 nmol/L、270 nmol/L时,A375细胞活性显著下降,R值分别为0.7248 ± 0.3204、0.6767 ± 0.2998,而M14细胞活性无显著变化。结论 miRNA-21在A375、M14两种人黑素瘤细胞系中均有不同程度的表达。miRNA-21在A375、M14细胞系中可以促进细胞增殖,可能下调了某些肿瘤抑制因子而起到癌基因样作用。     

短发卡RNA对人黑素瘤细胞BRAF基因的沉默作用

目的构建BRAF基因序列特异性的短发卡RNA(shRNA)质粒载体,检测其对人黑素瘤细胞BRAF基因的干扰作用。方法设计2条BRAF基因序列特异性的shRNA编码序列和1条非特异性阴性对照序列,插入质粒pGenesil-1,双酶切和测序鉴定。用构建成功的3条质粒转染人黑素瘤细胞株A375和M14,分别采用RT-PCR和蛋白印迹检测其BRAF基因的mRNA和蛋白表达。结果所设计的shRNA序列被正确插入质粒pGenesil-1。非特异性对照质粒neg对黑素瘤细胞BRAF基因表达不产生干扰,2条序列特异性质粒braf1和braf2抑制了BRAF基因mRNA和蛋白的表达,其中braf1干扰效果最为明显,最高抑制率可达90%。结论质粒介导的shRNA可成功干扰人黑素瘤细胞BRAF基因的表达,其抑制时间可持续至少1个月。     

肿瘤相关巨噬细胞对皮肤恶性黑素瘤细胞A375生物学行为的影响

目的 探讨肿瘤相关巨噬细胞对皮肤恶性黑素瘤细胞增殖、侵袭和迁移的影响。 方法 取对数生长期人单核细胞株U937,采用佛波酯诱导48 h后,分为3组, Mφ组（继续用佛波酯诱导48 h）、M1组（用25 mg/L LPS诱导48 h）、M2组（用15 μg/L IL-4诱导48 h）。酶联免疫吸附试验检测各组巨噬细胞上清中IL-12p70和IL-10表达水平。建立巨噬细胞与恶性黑素瘤A375细胞体外共培养体系,分别设单独培养组、Mφ组（A375细胞和Mφ巨噬细胞共培养）、M1组（A375细胞和M1型巨噬细胞共培养）、M2组（A375细胞和M2型巨噬细胞共培养）,分别运用噻唑蓝法、Transwell小室法观察不同激活途径的巨噬细胞对A375细胞增殖、侵袭、迁移等生物学行为的影响。 结果 增殖实验显示,共培养48、72 h后Mφ巨噬细胞、M2型巨噬细胞显著促进A375细胞的增殖,M1型巨噬细胞抑制A375细胞的增殖,各处理组间两两比较,差异有统计学意义（均P < 0.05）,共培养24 h后各组间两两比较A375细胞增殖率差异无统计学意义（P > 0.05）。侵袭实验显示M2组和Mφ组穿过Transwell膜的A375细胞数量（147.00 ± 7.92、113.22 ± 8.15）较单独培养组（84.11 ± 6.07）明显增加（P < 0.05）,M1组穿膜细胞（56.44 ± 7.55）明显减少（P < 0.05）。迁移实验显示M2组和Mφ组穿过Transwell膜的A375细胞数量（198.33 ± 8.22、156.00 ± 8.83）较单独培养组（123.89 ± 7.01）明显增加（均P < 0.05）,M1组穿膜细胞（97.11 ± 6.75）明显减少（P < 0.05）。 结论 IL-4激活的M2型巨噬细胞对A375细胞的增殖、侵袭和迁移可能起促进作用;脂多糖激活的M1型巨噬细胞对A375细胞的增殖、侵袭和迁移可能起抑制作用。佛波酯诱导的巨噬细胞更倾向于M2型巨噬细胞表型。     

BRAFV599E突变基因对A375细胞生长的影响

目的 探讨BRAFV599E突变对黑素瘤生长的作用。方法 使用BRAF表达受到抑制的黑素瘤细胞Abraf1和Abraf2,以及BRAF表达未受抑制的A375细胞和Aneg细胞,MTT比色实验和平板克隆形成实验分别检测4种细胞的生长和克隆形成能力,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡的变化。结果 与A375和Aneg细胞相比,Abraf1和Abraf2细胞的体外生长（F = 25.48,P < 0.001）和克隆形成（F ＝ 90.06,P < 0.001）均受到明显抑制,S期细胞减少（F = 147.87,P < 0.001）,G1期细胞增多（F = 9.14,P < 0.05）,但细胞凋亡没有显著增加（F = 2.27,P > 0.05）。结论 BRAFV599E突变基因能促使黑素瘤细胞从G1期进入S期,从而增强黑素瘤细胞的体外生长和增殖能力,但对黑素瘤细胞的体外凋亡没有影响。     

小檗碱抑制人黑素瘤A375细胞增殖的机制研究

目的 探讨小檗碱对人黑素瘤A375细胞周期相关miRNA及其靶基因表达的影响。方法 体外培养人黑素瘤A375细胞,经不同浓小檗碱（20、40、60、80 μmol/L）处理48 h后,采用qRT-PCR检测miRNA-582-5p及其靶基因CDK1 mRNA的表达,以及miRNA-188-5p和其靶基因CDK2、Cyclin D1、Cyclin A mRNA的表达。Western印迹检测细胞周期相关蛋白CDK1、CDK2、Cyclin D1和Cyclin A的表达。结果 qRT-PCR显示,与空白对照组相比,20、40 μmol/L小檗碱组miRNA-582-5p的表达无明显变化（均P > 0.05）,60、80 μmol/L组miRNA-582-5p的表达明显上调（均P < 0.05）。与空白对照组相比,各浓度小檗碱组miRNA-188-5p表达均增强（F = 22.600,P = 0.002）,CDK2、CDK1、Cyclin A、Cyclin D1mRNA表达随小檗碱浓度增加逐渐减弱（F = 51.976、248.510、626.671、312.740,均P < 0.001）。Western印迹显示,小檗碱可降低CDK1、CDK2、Cyclin D1、Cyclin A蛋白的表达（F = 138.124、110.966、278.772、140.167,均P < 0.001）。结论 小檗碱可能通过降低mRNA表达量与升高miRNA-582-5p和miRNA-188-5p含量共同使黑素瘤A375细胞周期相关蛋白CDK1、CDK2、Cyclin D1和Cyclin A表达降低,进而阻滞细胞周期进程,抑制肿瘤生长。     

microRNA在人皮肤黑素瘤与色素痣中共同差异表达的研究

目的 筛选人皮肤黑素瘤组织中表达的已知hsa-microRNA。方法 采用SBC microRNA芯片技术,将6例人皮肤黑素瘤组织总RNA分别与9例健康人色素痣总RNA混合物对比,筛选已知的468条hsa-microRNA表达情况。用qPCR分别检测这6例人皮肤黑素瘤组织中各候选hsa-microRNA的表达。将芯片和qPCR两种方法检测结果一致的候选hsa-microRNA确定为有意义的共同差异表达hsa-microRNA。结果 2倍以上差异表达miRNA占所检测miRNA的12.18% ～ 86.33%,5倍以上差异表达miRNA占1.28% ～ 19.02%,10倍以上差异表达miRNA占0.43% ～ 5.34%。 此6例人皮肤黑素瘤中miRNA-21 明显上调表达,miRNA-320和miRNA-494明显下调表达。结论 人皮肤黑素瘤组织中miRNA-21明显上调表达,miRNA-320和miRNA-494明显下调表达。     

p62基因对黑素瘤A375细胞生物学特性的影响

目的研究p62基因在黑素瘤A375细胞生长增殖及细胞周期调控等方面的作用。方法取对数生长期的A375细胞,用干扰p62基因表达的siRNA慢病毒载体转染细胞;MTT法检测转染及正常A375细胞的平均OD值;流式细胞术检测两组的细胞周期分布。结果转染组的平均OD值较正常组小(P0.05);转染组的G0/G1期比例(0.73±0.01)较正常组(0.64±0.02)高(P=0.002);转染组的凋亡率(0.10±0.02)较正常组(0.03±0.01)高(P=0.004)。结论干扰p62表达后,细胞周期阻滞于G0/G1期,p62在维持细胞周期和肿瘤细胞凋亡中起着重要的作用。     

p53调控MicroRNA与皮肤癌

p53是与人类肿瘤发生相关性最高的抑癌基因,MicroRNA是高度保守的内源性单链非编码小分子RNA。p53对MicroRNA的转录调控作用在人类肿瘤发生和发展中起着重要的作用。p53与miRNA之间的调控作用是相互的,不仅p53可以直接或间接调控多种miRNA的表达,同时多种miRNA也可以调节p53的活性和功能。p53主要转录调控分子miR-34a,miR-125b,miRNA-150,miRNA-205,miRNA-221等在某些特定的皮肤肿瘤中存在表达水平异常。随着后基因组时代的来临,miRNA在肿瘤发生发展中的作用逐渐成为国际前沿研究热点,已经证实,MicroRNA在多数肿瘤组织中存在表达异常。     

苦参碱抑制人恶性黑素瘤A375细胞株的侵袭

目的 探讨苦参碱对恶性黑素瘤细胞A375转移能力的影响及其作用机制。方法 采用MTT法和膜联蛋白-V-FITC/PI双染色法分别检测不同浓度苦参碱对A375细胞增殖和凋亡的影响,半定量RT-PCR分析经苦参碱干预后A375细胞乙酰肝素酶mRNA的表达变化,细胞黏附实验检测细胞黏附能力的改变,基质胶侵袭实验观察细胞侵袭能力的变化。结果 苦参碱浓度≥0.5mg/mL时可抑制A375细胞增殖并诱导细胞凋亡,其作用呈剂量依赖性;苦参碱浓度在0.125～0.5mg/mL时,能明显下调A375细胞乙酰肝素酶mRNA的表达,并能抑制细胞的黏附、侵袭能力(P<0.01),其抑制效应呈剂量依赖性,在不同浓度组间比较差异均有统计学意义(P<0.01)。结论 苦参碱在体外能抑制A375细胞的黏附、侵袭能力。苦参碱抗肿瘤侵袭可能与抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡以及下调乙酰肝素酶的表达有关。     

HaCaT细胞ADAR1基因沉默对Wnt11表达和A375细胞酪氨酸酶活性的影响

【摘要】 目的 探讨遗传性对称性色素异常症致病基因ADAR1对Wnt11表达和酪氨酸酶活性的影响。 方法 将HaCaT细胞等细胞数量分为对照组、实验1组、实验2组、实验3组。用3种针对ADAR1基因的shRNA质粒分别沉默3个实验组中HaCaT细胞的ADAR1基因,用Western印迹法检测4个组HaCaT细胞相关蛋白的表达水平。建立HaCaT细胞与黑素瘤细胞A375共培养模型,对实验组（HaCaT细胞中的ADAR1和Wnt11蛋白低表达）与对照组（HaCaT细胞中的ADAR1和Wnt11蛋白正常表达）的细胞形态和酪氨酸酶活性进行比较。 结果 蛋白印迹法发现,ADAR1基因沉默的HaCaT细胞中的Wnt11蛋白条带灰度值明显低于正常HaCaT细胞中的Wnt11蛋白条带灰度值, 证实HaCaT细胞中的ADAR1基因沉默后,Wnt11蛋白的表达水平明显下降。在共培养模型中,实验组HaCaT细胞与A375细胞连接处的树突状突起明显少于对照组,实验组A375细胞的酪氨酸酶活性与对照组相比显著降低,减去空白组A值后,实验组A值为0.0168 ± 0.0069,对照组为0.0490 ± 0.0132,P ＜ 0.01。 结论 HaCaT细胞中ADAR1基因沉默可降低Wnt11的表达,并影响A375细胞酪氨酸酶活性。 【关键词】 基因,ADAR1; Wnt11; 黑素细胞; 角蛋白细胞     

阿扎胞苷对黑素瘤A375细胞HOXA9基因表达及生物学行为的影响

【摘要】 目的 研究甲基转移酶抑制剂阿扎胞苷（5-azaC）对黑素瘤A375细胞中同源框A9（HOXA9）基因表达及细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响。方法 1、5、10、20 μmol/L 5-azaC分别作用于体外培养的A375细胞,以未经药物干预的常规培养A375细胞作为对照组,甲基化特异性PCR检测不同浓度5-azaC处理后HOXA9基因启动子区甲基化状态,筛选5-azaC最佳浓度进行后续实验。细胞计数试剂盒（CCK8）检测5-azaC对A375细胞增殖能力的影响,Transwell及细胞划痕实验分析5-azaC对A375细胞侵袭及迁移能力的影响,实时荧光定量PCR及Western印迹检测5-azaC作用后A375细胞中HOXA9 mRNA及蛋白表达水平。两组间比较采用独立样本t检验。结果 对照组A375细胞中HOXA9基因启动子区表现为甲基化状态,经5-azaC处理后,A375细胞中HOXA9基因启动子区甲基化与非甲基化状态并存,且随5-azaC处理浓度的增加,HOXA9基因去甲基化程度越高,因此选择20 μmol/L 5-azaC浓度处理A375细胞72 h作为5-azaC处理组,用于后续实验。与对照组相比,5-azaC处理组A375细胞增殖能力显著降低（72.46% ± 2.19%比100%,t = 28.09,P < 0.001）,侵袭细胞数量显著减少［（242.70 ± 29.19）个比（466.00 ± 22.65）个,t = 10.47,P < 0.001］,迁移能力减弱（27.56% ± 2.74% 比35.69% ± 2.50%,t = 3.79,P = 0.019）,HOXA9 mRNA表达量升高（1.73 ± 0.28 比1.01 ± 0.15,t = 3.93,P = 0.017）,HOXA9蛋白表达量增多（0.62 ± 0.03比0.50 ± 0.01,t = 3.82,P = 0.019）。结论 5-azaC能够降低黑素瘤细胞株A375的增殖、侵袭、迁移能力,且该过程可能机制之一是5-azaC反转HOXA9基因启动子区甲基化状态,激活基因表达,从而参与调控黑素瘤细胞生物学行为。     

内皮素3上调黑素瘤细胞株A375表达骨桥蛋白的研究

目的 探讨内皮素受体(ETR)-B拮抗剂BQ788和磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)抑制剂LY294002对黑素瘤细胞株A375骨桥蛋白基因的表达。方法 对照组在人A375细胞培养体系中加入100 nmol/L内皮素3,试验组除加入100nmol/L内皮素3外,分别加入1μmol/L BQ788和20μmol/L、50μmol/L LY294002,采用RT-PCR和蛋白质印迹方法检测骨桥蛋白的mRNA和蛋白表达。结果 ETR-B拮抗剂BQ788和PI3K抑制剂LY294002均能显著减少人恶性黑素瘤细胞株A375中骨桥蛋白mRNA和蛋白的表达,与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。高浓度较低浓度LY294002对骨桥蛋白表达的抑制作用更明显(P<0.05)。结论 内皮素3/ETR-B能通过激活PI3K信号通路上调骨桥蛋白的表达。     

全反式维A酸对恶性黑素瘤A375细胞上皮-间质转化相关分子表达的影响

【摘要】 目的 研究全反式维A酸（ATRA）对人恶性黑素瘤A375细胞中上皮-间质转化（EMT）相关分子表达的影响。方法 用含10 μmol/L ATRA的DMEM培养基和DMEM培养基分别处理A375细胞24和48 h作为ATRA-1组和ATRA-2组、对照1组和对照2组,采用实时定量PCR法检测EMT相关基因上皮钙黏着蛋白、神经钙黏着蛋白、波形蛋白、β联蛋白mRNA的表达。Western印迹法检测ATRA-1组、ATRA-2组、对照1组中上述蛋白的相对表达量,直接免疫荧光法检测上皮钙黏着蛋白和波形蛋白的荧光强度。统计分析采用两因素方差分析、单因素方差分析及LSD-t检验。结果 ATRA-1组和ATRA-2组分别与对照1组和对照2组相比,上皮钙黏着蛋白mRNA的表达均显著增加（F = 13.148、31.529,P < 0.05）,而神经钙黏着蛋白、波形蛋白、β联蛋白mRNA的表达均显著降低（均P < 0.05）;ATRA-2组上皮钙黏着蛋白mRNA的表达显著高于ATRA-1组（F = 13.148,P < 0.05）,而其他3种蛋白mRNA的表达显著低于ATRA-1组（均P < 0.05）;对照1组与对照2组上述蛋白的mRNA表达差异无统计学意义（均P > 0.05）。Western印迹法显示,与对照1组相比,ATRA-1组和ATRA-2组上皮钙黏着蛋白表达上调,而神经钙黏着蛋白、波形蛋白、β联蛋白表达均下调（均P < 0.05）;与ATRA-1组相比,ATRA-2组上皮钙黏着蛋白表达上调（P < 0.05）,神经钙黏着蛋白、波形蛋白、β联蛋白表达下调（均P < 0.05）。直接免疫荧光显示,ATRA-1组、ATRA-2组上皮钙黏着蛋白的荧光强度（6.23 ± 0.08、10.37 ± 0.13）显著高于对照1组（2.37 ± 0.14,均P < 0.05）,而波形蛋白的荧光强度（15.17 ± 0.18、10.29 ± 0.03）显著低于对照1组（50.16 ± 0.26,均P < 0.05）,抑制上皮向间质转化。结论 ATRA可上调A375细胞中上皮钙黏着蛋白的表达,降低神经钙黏着蛋白、波形蛋白、β联蛋白的表达,可能抑制A375细胞发生EMT现象。     

白藜芦醇和全反式维A酸对人黑素瘤细胞株A375 LSD-1表达的影响

目的: 确定白藜芦醇(resveratrol,Res)和全反式维A酸(all-trans-retinoic acid,ATRA)对人黑素瘤细胞株A375赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶 1(LSD-1)基因表达的影响.方法: MTT比色法检测Res和ATRA对A375细胞增殖的抑制;倒置显微镜观察A375细胞形态的变化;RT-PCR方法检测LSD-1的mRNA的表达.结果: Res和ATRA均能抑制A375细胞的增殖.100 μmol/L Res及25.0 μmol/L ATRA均能显著减少人恶性黑素瘤细胞株A375中LSD-1的mRNA的表达, 与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05),但对LSD-1的下调作用无显著差异(P＞0.05).结论: 抑制黑色素瘤细胞LSD-1的表达,可能是Res和ATRA抗肿瘤的途径之一.     

微小RNA let-7a下调黑素瘤A375细胞系BRAF蛋白的表达

目的:评价微小RNA let-7a对黑素瘤A375细胞系BRAF蛋白表达的影响。方法:采用蛋白印迹法检测BRAF蛋白在A375细胞及黑素细胞的表达;用微小RNA let-7a的模拟物及阴性对照分别转染A375细胞,CCK-8实验检测细胞增殖情况。结果:与黑素细胞相比,BRAF蛋白在黑素瘤A375细胞表达升高;与阴性对照相比,微小RNA let-7a的模拟物转染A375细胞后,抑制细胞增殖,BRAF蛋白表达下降。结论:微小RNA let-7a可抑制黑素瘤A375细胞增殖,下调BRAF蛋白表达。     

白藜芦醇对黑素瘤细胞株A375增殖及骨桥蛋白表达的影响

目的:确定白藜芦醇(Resveratrol,Res)对黑素瘤细胞株A375细胞增殖及骨桥蛋白表达的影响.方法:用不同浓度的白藜芦醇处理A375细胞,MTT比色法分别检测白藜芦醇对细胞增殖的抑制作用,RT- PCR和蛋白印迹方法检测骨桥蛋白的mRNA和蛋白的表达.结果: 白藜芦醇对A375细胞增殖的抑制呈时间和浓度依赖性;白藜芦醇能显著减少内皮素作用后黑素瘤细胞株A375骨桥蛋白中mRNA和蛋白的表达(P＜0.05).结论: 白藜芦醇作为内皮素受体拮抗剂有可能通过抑制内皮素受体(ETR-B)下调骨桥蛋白的表达,进而抑制A375细胞的增殖.     

沉默ATAD3A对黑素瘤A375细胞增殖、侵袭和迁移的影响及机制研究

【摘要】 目的 探讨沉默三磷酸腺苷酶家族蛋白3A（ATAD3A）对黑素瘤A375细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响。方法 2019年8 - 12月在重庆市渝北区人民医院收集经病理确诊的3例黑素瘤患者的黑素瘤组织及癌旁组织 ,应用Western印迹检测ATAD3A在上述组织中的表达。分别采用沉默ATAD3A慢病毒和空载慢病毒感染黑素瘤A375细胞系,构建沉默ATAD3A（shATAD3A）实验组和空载对照（shCtrl）组,经实时荧光定量聚合酶链反应（qRT?PCR）和Western印迹验证干扰效率。采用CCK?8实验、克隆形成实验比较两组细胞的增殖能力和克隆形成能力,采用Transwell细胞侵袭实验、划痕实验比较两组细胞的侵袭、迁移能力,采用Western印迹检测两组细胞自我更新相关蛋白（NANOG、SOX2、OCT4）和侵袭、迁移相关蛋白［基质金属蛋白酶2（MMP2）、波形蛋白、SLUG］的表达水平。两组间各指标的比较采用独立样本t检验。结果 Western印迹显示,相对于癌旁组织,ATAD3A在3例黑素瘤组织中高表达（t = 10.825,P < 0.001）。qRT?PCR和Western印迹显示,shATAD3A组A375细胞ATAD3A mRNA为0.230 ± 0.073,shCtrl组为1.000 ± 0.244,两组比较,t = 9.461,P < 0.001,蛋白表达水平分别为0.279 ± 0.267和0.867 ± 0.115,t = 8.595,P = 0.002, 表明成功构建沉默ATAD3A的黑素瘤A375细胞系。克隆形成实验和CCK?8实验显示,shATAD3A组克隆形成率低于shCtrl组（22.667% ± 2.510%比43.667% ± 5.030%,t = 6.464,P = 0.003）,且细胞增殖活性自第2天开始直至第4天均显著低于shCtrl组。划痕实验及Transwell细胞侵袭实验显示,与shCtrl组相比,shATAD3A组划痕愈合减慢,划痕愈合率自第12 h开始（32.920% ± 4.642%比49.302% ± 1.448%,t = 5.835,P = 0.004）至24 h明显降低,通过Transwell小室下室的侵袭细胞数减少（68.330 ± 13.050比234.330 ± 19.139,t = 12.411,P < 0.001）。Western印迹显示,shATAD3A组细胞NANOG、SOX2、OCT4、MMP2、波形蛋白、SLUG的表达水平均显著下降（P < 0.05或0.001）。结论 ATAD3A在黑素瘤组织中高表达,沉默ATAD3A能抑制黑素瘤A375细胞的增殖、侵袭和迁移能力。     

Nutlin-3对人A375黑素瘤细胞生物学行为的影响及可能机制

目的 观察顺式咪唑啉衍生物nutlin-3对人A375黑素瘤细胞生物学行为的影响,研究其机制。 方法 将A375细胞分为实验组和对照组,实验组细胞接受2.5、5、10 μmol/L nutlin-3处理,对照组细胞采用二甲基亚砜处理。分别于作用24、48、72 h后,噻唑蓝（MTT）法检测细胞增殖情况;Western印迹检测p53蛋白表达的改变;流式细胞仪检测细胞周期分布以及细胞凋亡;Transwell法检测迁移性变化。采用重复测量的方差分析进行统计学检验。 结果 2.5、5、10 μmol/L nutlin-3处理A375细胞24、48、72 h后,MTT法显示不同时间点间的增殖抑制率差异有统计学意义（F = 67.43,P < 0.01）,不同浓度间的抑制率差异有统计学意义（F = 135.58,P < 0.01）,浓度越高抑制率越高;时间和浓度之间有交互作用（F = 26.95,P < 0.01）。Western印迹 、流式细胞仪、Transwell法检测显示,不同时间点之间A375细胞的p53表达、G2期细胞百分率、凋亡率、迁移抑制率差异均有统计学意义（F值分别为1255.00、831.38、809.45、1100.00,均P < 0.01）,除p53外,时间越长各项指标值越高;不同浓度间各项指标值差异均有统计学意义（F值分别为9196.00、267.99、723.83、1667.00,均P < 0.01）,浓度越高各项指标值越高;时间与浓度之间交互作用有统计学意义（F值分别为826.79、21.602、44.48、313.09,均P < 0.01）。 结论 nutlin-3可能通过p53蛋白积累途径抑制人A375细胞的增殖和迁移,促进细胞周期停滞和细胞凋亡。