TNF-α促进树突状细胞分化成熟的实验研究

本研究探讨不同浓度肿瘤坏死因子α(TNF-α)对人外周血单个核细胞来源树突状细胞(MNC-derived den-dritic cells,MNCDC)分化成熟的影响。采集正常健康成人外周血30 ml,以Thomas法分离外周血单个核细胞(PBMNC),用重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)、重组人白介素-4(rhIL-4)于体外联合诱导培养8天,并于培养第5天加入不同浓度的rhTNF-α共同培养;用流式细胞术检测DC膜表面的HLA-DR、CD83和CD1a表达,用MTT法检测DC刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力。结果表明,不同浓度的TNF-α能不同程度地刺激DC表达HLA-DR、CD83和CD1a,增强DC刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力。结论:TNF-α能够显著增强外周血单个核细胞来源DC的分化和成熟,不同浓度TNF-α能不同程度地刺激MNCDC功能成熟,TNF-α浓度为20ng/ml时刺激DC分化成熟的作用最强。     

树突状细胞激活介导的炎性反应与主动脉夹层

目的　研究急性主动脉夹层 (AD)患者树突状细胞 (DC)的功能 ,探讨发病与炎性反应的关系。方法　分离 11例AD和 11例正常人外周血单个核细胞 (PBMC) ,在含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 (GM -CSF)和白细胞介素 4 (IL - 4 )的培养条件下制备DC。用流式细胞仪检测DC表面共刺激分子CD86 (B7- 2 )的表达 ;混合淋巴细胞反应 (MLR)检测DC对同种异体T淋巴细胞的刺激能力 ;ELISA法测定MLR上清液及血清中的细胞因子 ;比浊法测定循环血C -反应蛋白 (CRP)水平 ,探讨CD86表达与CRP的相关性。结果　与对照组比较 ,AD患者DC表面CD86的表达明显增高 ,对T淋巴细胞刺激的能力增强 ,MLR上清液中及血液中致炎细胞因子 (IL - 1β、IL - 6、TNF -α)升高 ,抑炎细胞因子 (IL - 10 )降低 ,血CRP水平显著升高 ,CD86的表达与血CRP水平呈正相关。结论　AD患者DC的功能显著亢进 ,由此启动的T淋巴细胞增殖和炎性细胞因子分泌可能在AD的发生发展中起重要作用。     

人外周血单核细胞来源的树突状细胞的体外诱导

目的:探讨在体外从人外周血单核细胞诱导培养成熟的树突状细胞(dendritic cell,DC)的方法.方法:培养过程分两阶段,第一阶段:采用密度梯度离心法分离健康成人外周血中的单个核细胞,再以黏附法分离出单核细胞,经重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)100 ng/mL、重组人白介素-4(rhIL-4)100 ng/mL体外诱导.第二阶段:第5天加入重组人肿瘤坏死因α-(rhTNF-α)100 ng/mL,继续培养2 d,刺激DC成熟.倒置显微镜下观察DC形态,流式细胞仪检测DC表面标志物CD83、CD1a、CD86、CD40、CD14表达水平,用MTT法测定DC刺激同种异体T细胞增殖的能力.结果:人外周血单核细胞经rhGM-CSF及rhIL-4诱导培养5 d后,多数细胞呈集落生长,细胞表型CD83、CD1a、CD86、CD40及CD14分别是14.3%、12.8%、20.1%、19.9%及16.2%.加入rhTNF-α诱导后,即培养第7天,细胞表型CD83、CD1a、CD86、CD40及CD14分别是29.8%、18.2%、33.6%、28.1%及8.0%(与第5天比较,均P<0.05).成熟后的DC具备较强刺激T细胞增殖的能力.结论:rhGM-CSF联合rhlL-4诱导人外周血单核细胞,可获得大量不成熟的DC,该体系有利于Dc扩增,加入rhTNF-α,继续培养2 d,可诱导出成熟的DC,成熟的DC具备较强刺激T细胞增殖的能力.     

t-复合多肽1基因在原发性肾病综合征患者外周血单个核细胞中的表达

目的:初步探讨t-复合多肽1(TCP-1)基因在原发性肾病综合征(PNS)患者外周血单个核细胞(PBMC)中的表达及临床意义。方法:收集体检20例正常人(A组)和30例PNS患者(B+C组,其中B组为初发PNS患者,未用激素;C组为复诊PNS患者,使用激素2～3个月。各15例)的新鲜外周血液。用RT-PCR检测其外周血PBMC中TCP-1基因的表达。结果:A组分别与B+C组、B组、C组相比,TCP-1基因的表达差异均有显著性(P<0.01);B组与C组中的表达差异无显著性(P>0.05)。结论:TCP-1可能参与了PNS的发生发展过程。     

体外纯化培养外周血来源的树突状细胞的研究

目的建立来源于外周血的树突状细胞(DCs)的纯化培养方法并观察DCs的形态及功能。方法以Fi-coll密度梯度离心法从正常人外周血中分离出外周血单个核细胞(PBMNC)后,用体外培养的手段,采用培养黏附法或经免疫磁珠筛选法,获得单核细胞;分别加入不同浓度的细胞因子(重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子重组人白介素4重组人肿瘤坏死因子α)诱导培养,培养12 d诱导出DCs;用光镜和电镜观察培养的DCs,用流式细胞仪检测DCs表面的细胞表型(CD80、CD83、CD86、CD1α、HLA-DR),MTT法检测DC对T细胞的刺激增殖效应。结果在体外诱导出外周血来源的成熟DCs,电镜和光镜分析表明具有DCs的典型形态,所培养的细胞表面高表达CD80、CD83、CD86、CD1α、HLA-DR,并具有刺激异基因淋巴细胞增殖的能力。结论应用外周血来源的单个核细胞,采用培养黏附法或免疫磁珠分选法分选出的单核细胞,细胞因子培养12 d可得到成熟正常的DCs。     

急性呼吸综合征患者外周血树突状细胞表型和功能的变化

目的 探讨严重急性呼吸综合征病毒(SARSV)感染对树突状细胞(DC)表型和功能的影响。方法 采用流式细胞仪检测SARS发病期患者(9例)和正常人(7例)DC的表型；分离培养DC和T淋巴细胞，用混合淋巴细胞反应检测SARS患者和正常人DC对T淋巴细胞增殖的诱导作用。结果 SARSV感染抑制了DC类刺激分子CD80、CD86和HLAⅡ类分子HLA—DR以及与DC成熟有关的分子CD83的表达；抑制DC诱导T淋巴细胞增殖的能力。结论 SARSV可抑制DC的分化成熟和抗原递能力。     

不同来源的树突状细胞体外扩增比较研究

【目的】对脐血和外周血树突状细胞(DC)体外扩增进行比较,探索更好的DC来源。【方法】取正常人脐血及外周血,以Ficoll分离提取白细胞,去除悬浮细胞后,分别加入含有GM-CSF、TNF-α及GM-CSF、IL-4的完全培养基中培养,于4、8、10 d进行表型(CD1α、CD83、CD80、HLA-DR)分析及形态观察,1周左右分别检测同种异体混合淋巴细胞反应培养,比较诱导细胞增殖的能力。【结果】脐血诱导的DC细胞数明显大于外周血来源的DC细胞数(脐血2.05±0.05,外周血0.45±0.01),两组有显著差异(P<0.05)。比较两种来源的DC在形态及细胞表型上无显著差异(P>0.05),两者刺激同种异体混合淋巴细胞增殖的能力无显著差异。【结论】脐血和外周血均可成功诱导成熟DC,脐血诱导DC增殖比外周血效率高。     

1,25（OH）2维生素D3对人树突状细胞成熟及其介导免疫耐受的影响

本研究旨在探讨1,25(OH)2维生素D3〔1,25(OH)2Vit D3〕对人树突状细胞(DC)分化、成熟及功能的影响及其机制。在体外将人外周血单个核细胞诱导分化成DC,实验组加入1,25(OH)2Vit D31 nmol/L培养9 d,对照组加入等量无水乙醇,流式细胞仪检测DC表面共刺激因子表达水平。混合淋巴细胞培养后,用MTT法评估DC刺激同种异体T细胞增殖的能力。Western blot检测DC吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)蛋白表达。结果表明,与对照组相比,实验组DC表面标志CD80、CD83、CD86表达率低于对照组(P<0.05),CD1a高于对照组(P<0.05);CD80、CD83、CD86、CD1a表达率分别为(40.43±9.83)%、(20.04±4.73)%、(14.45±5.38)%,(58.48±10.72)%;对照组CD80、CD83、CD86、CD1a表达率分别为(29.36±13.34)%、(35.91±10.19)%、(27.15±11.64)、(72.20±12.79)%。实验组DC刺激同种异体T细胞增殖的能力受到抑制;DC表达IDO蛋白上调。结论:1,25(OH)2Vit D3抑制DC的成熟,通过上调DC的IDO蛋白表达抑制DC刺激同种异体T淋巴细胞增殖及介导免疫耐受。     

细菌脂多糖对人树突状细胞分化成熟及表达PD-L1的影响及意义

目的:探讨细菌脂多糖(LPS)对树突状细胞分化、成熟及表达PD-L1的影响。方法:获取人外周血单核细胞来源的树突状细胞(DC),加入不同浓度LPS,流式细胞仪分析CD11c、CD80、CD86及PD-L1表达变化,MTT法测定其刺激T细胞增殖能力,ELISA测定培养上清液IL-12的水平。结果:DC表达CD80/CD86在刺激浓度为10μg/mL时达高峰,后逐渐下降;PD-L1的表达与CD80/CD86一致;而在持续刺激组CD11c、CD80、CD86和PD-L1均呈低水平表达。短期刺激浓度为1.0μg/mL时,DC刺激T细胞增殖能力最强,高于或低于此浓度刺激能力均下降。持续刺激组刺激T细胞增殖的能力最弱。培养上清液中IL-12的水平与T细胞增殖能力一致。结论:高浓度LPS可抑制DC成熟,一定浓度持续刺激可抑制单核细胞向DC分化;PD-L1分子随着DC成熟表达增高,提示PD-L1表达有助于维持适度而有效的免疫应答。     

重组人p53腺病毒转染淋巴瘤源性树突状细胞的抗肿瘤免疫效应

本研究旨在探讨重组人p53腺病毒转染淋巴瘤源性树突状细胞的抗肿瘤免疫效应。采集初诊弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者肿大的淋巴结和外周血,分别分离单个核细胞,进行树突状细胞(DC)体外诱导培养,均分为实验组(rAd-p53-DC)、对照组(rAd-DC)和空白对照组。用重组人p53腺病毒(rAd-p53)转染2种来源的DC,流式细胞术检测DC免疫表型,Western blot鉴定P53蛋白的表达,ELISA法检测上清中的细胞因子IL-12的含量,用混合淋巴细胞反应(MLR)测定DC刺激同种异体淋巴细胞增殖能力,用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测经rAd-p53转染的两种来源DC的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应。结果表明,实验组DC的表型(CD1a除外)CD83、CD80、CD86和HLA-DR表达均较对照组及空白对照组明显增高(P<0.05)。实验组P53蛋白的表达上调,培养上清液中IL-12分泌水平较对照组及空白对照组明显增高(P<0.05)。实验组明显刺激自体淋巴细胞增殖,且刺激能力随rAd-p53-DC与淋巴细胞比例的增加而升高。对照组及空白对照组也能刺激同种自体淋巴细胞增殖,但较实验组差(P<0.05)。对靶细胞的细胞毒作用(CTL效应)检测显示,实验组介导同种异体的淋巴细胞杀伤率显著高于对照组及空白对照组(P<0.05),且淋巴结来源DC的CTL效应明显高于外周血来源DC(P<0.05)。结论:rAd-p53-DC为基础的肿瘤疫苗有可能在解决淋巴瘤的微小残留病、DC免疫耐受等问题方面发挥作用。     

树突细胞介导的独特型瘤苗的体外抗骨髓瘤作用

目的研究树突细胞（DC）介导的独特型瘤苗诱导骨髓瘤抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的抗肿瘤免疫反应。方法从多发性骨髓瘤（MM）患者外周血中分离获取DC前体细胞，使用GM-CSF、IL-4与TNF-α诱导分化促成熟。加入MM患者的M蛋白F（ab′），片段（Id），诱导MM肿瘤特异性CTL。光学显微镜下观察其培养过程中形态特征变化，电镜观察其超微结构，间接免疫荧光观察其表型特征，采用MTT法检测致敏DC促自体T淋巴细胞增殖的能力以及患者CTL对自体骨髓瘤细胞的特异性细胞毒杀伤作用。结果 GM-CSF、IL-4和TNF-α配伍可有效地从MM患者外周血单陔细胞中诱导出大量成熟的功能性DC。MM患者自体血清Id冲击致敏的成熟DC能够显著地提高T细胞的增殖能力，并且使幼稚T细胞活化成为肿瘤独特型CTL，各个剂量的CTLs均能够产牛针对自体MM细胞的抑制性杀伤反应。结论 在MM患者外周血中可获得典型的DC，使用负载了Id的DC疫苗能够诱导出有效的抗肿瘤免疫应答反应，以DC为基础的疫苗可能在MM免疫治疗中发挥重要的作用。     

慢性乙肝患者CD4~+ CD25~+ T细胞对外周血树突状细胞成熟的作用

目的探讨慢性乙型肝炎(CHB)患者CD4+CD25+Treg细胞对外周血树突状细胞成熟的影响。方法对2013年6月至2013年12月就诊的15例CHB患者和18例健康对照各抽取外周血20 ml,分离外周血单个核细胞(PBMC),于体外培养获得树突状细胞(DC)及免疫磁珠分选获得CD4+CD25+Treg细胞;分别将CD4+CD25+Treg细胞和CD4+CD25-T细胞与DC共培养后采用流式细胞仪检测DC表面标志CD83、CD80、CD86、HLA-DR的表达。结果健康对照组,加入Treg后,相比于DC对照组及DC与CD4+CD25-T细胞共培养组,DC的CD83、CD80、CD86表达下降,差异有统计学意义。CHB患者组,加入Treg后,相比于DC对照组,DC的CD83、CD80、CD86表达下降,差异均有统计学意义;与DC和CD4+CD25-T细胞共培养组相比,Treg对DC的CD83、CD80表达抑制率较高,差异有统计学意义。CHB患者组的Treg对DC的CD83、CD80、CD86表达抑制率均高于健康对照组,差异均有统计学意义。结论 CHB患者外周血Treg细胞能够抑制DC的成熟,抑制效应强于健康对照。     

结核性腹膜炎外周血树突细胞亚群的变化

[目的]探讨结核性腹膜炎外周血树突细胞亚群的变化.[方法]对本院胸科病房收治的65例结核性腹膜炎病人,采用流式细胞法测定外周血树突细胞（dendritic cells, DC）亚群DC1/DC2以及成熟DC/未成熟DC（DCm/DCim）的变化,并检测20名健康体检人员为对照.[结果]病例组外周血中DC1细胞比例明显增加,DC2细胞比例下降,DC1/DC2比值明显升高（P均〈0.05）.DCm比例明显下降（P〈0.01）,DCim比例明显增高（P〈0.05）.DCm/DCim比值明显下降（P〈0.01）.[结论]结核性腹膜炎外周血DC亚群明显变化,可能是自身免疫抑制反应,为寻找治疗突破点提供了一定的理论依据.     

树突状细胞介导的抗白血病效应的临床研究

肿瘤的免疫治疗作为恶性肿瘤综合治疗的重要组成部分，近年来受到了广泛的关注。树突状细胞(DC)是已知的功能最强的抗原呈递细胞，不仅能够激活自体的抗肿瘤免疫，同样能够提高异体免疫组织的抗肿瘤效应。为了探讨外周血来源的DC体外培养扩增和临床治疗的可行性和安全性，分析DC免疫治疗对于急性非淋巴细胞白血病自体骨髓移植患者长期生存的影响，利用CS3000Plus采集13例急性非淋巴细胞白血病自体骨髓移植后的病人的外周血单个核细胞，经过2周的体外培养后行DC免疫治疗，治疗后长期随访观察其无病生存时间。结果表明，无一例发现有与DC免疫治疗相关的严重不良反应；Kaplan-Meier生存分析结果为：DC组5年生存率为75．52％，非DC组5年生存率为45.71％，DC组在累计生存率上明显优于非DC组。结论：外周血来源的DC体外培养和临床治疗是安全可行的，急性非淋巴细胞白血病病人在自体骨髓移植术后应用DC免疫治疗延长了其无病生存时间，提高了长期生存率。     

韦格纳肉芽肿患者外周血免疫细胞TLR_4的表达

目的检测韦格纳肉芽肿(WG)患者外周血免疫细胞特别是树突状细胞(DC)上Toll样受体4(TLR4)的表达有无异常。方法流式细胞仪检测正常人及WG患者外周血免疫细胞表面TLR4蛋白的表达。结果 TLR4在WG患者外周血中性粒细胞(PMN)、单核细胞、BDCA3+DC、CD11c+DC和DC样单核细胞-CD14+CD16+单核细胞上的表达与正常人无显著差异,但在淋巴细胞上的表达显著高于正常人;活动期与非活动期患者、环磷酰胺和甲氨蝶呤治疗组患者TLR4的表达无显著差异。结论 TLR4在WG患者外周血DC、DC样单核细胞及免疫细胞的表达无明显异常。     

rhG-CSF体内诱导造血干细胞移植供者外周血T细胞免疫耐受的初步研究

本研究探讨rhG CSF体内应用诱导健康供者外周血T淋巴细胞免疫耐受的机制。对 15例病人进行了外周血干细胞移植 ,借助三色和四色荧光标记技术 ,对供者rhG CSF动员前后外周血T细胞上共刺激分子CD2 8的表达、树突状细胞 (DC)亚群以及CD8 CD2 8- 抑制性T细胞的变化进行了流式细胞术测定。结果显示 ,rhG CSF动员后外周血采集物中CD3 CD2 8 细胞的相对数显著升高 (P <0 .0 1) ,CD2 8表达的平均荧光强度明显降低 (P<0 .0 5 ) ;CD8 CD2 8 细胞的相对数也显著升高 (P <0 .0 1)。但在T细胞上CD2 8总体表达的相对荧光强度无变化 (P >0 .0 5 )。动员前外周血中DC2的含量明显低于正常骨髓 (P <0 .0 1) ,动员后采集物中DC2的数量较动员前和正常骨髓均有显著增加 (P <0 .0 1) ,DC的数量也显著增加 (P <0 .0 1) ,DC1 DC2比值倒置 (P <0 0 1) ,而DC1在动员前后无变化 (P >0 .0 5 )。CD8 CD2 8- 细胞占有核细胞的百分比较动员前明显增加 (P <0 0 5 )。结论 :rhG CSF体内应用后 ,采集物中DC2和CD8 CD2 8- 抑制性T细胞数量的增加可能是外周血T细胞免疫耐受产生的重要机制。     

外周血单核细胞来源树突状细胞体外扩增及诱导抗乳腺癌免疫的研究

目的研究外周血来源树突状细胞(DC)的体外扩增及诱导特异性抗乳腺癌细胞的免疫效应。方法(1)从外周血中分离单个核细胞后,获得单核细胞(monocyte,Mo)。粒-单集落刺激因子(GM-CSF)和白介素4(IL-4)诱导分化扩增培养7d后,应用流式细胞术进行表型分析。(2)诱导单核细胞分化的第3天加入人乳腺癌细胞株3A0的冻融抗原培养4d后,获得负载肿瘤抗原的成熟DC;将致敏DC与从外周血中分离的同种异体T淋巴细胞共培养3d,获得细胞毒T淋巴细胞(CTL);四甲基偶氮唑蓝法检测CTL及上清液对人乳腺癌细胞株3A0、人胚肾细胞株293T(对照细胞)、人肝癌细胞株HCCC-9810的细胞毒作用。结果(1)外周血来源Mo在GM-GSF和IL-4作用下,第7天后可分化生成成熟的DC,高表达DC特异性抗原CDla、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)HLA-DR、CD83。(2)DC可负载并递呈肿瘤抗原,激活同种异体T淋巴细胞,诱导肿瘤特异性CTL产生。不同浓度CTL及上清液对乳腺癌细胞3A0有特异性杀伤、抑制作用(P<0.05)。结论外周血中Mo可体外分化扩增为成熟的功能性DC,并诱导出特异性杀伤乳腺癌细胞的免疫效应。     

Reciprocal activating interaction between natural killer cells and dendritic cells

We analyzed the interaction between human peripheral blood natural killer (NK) cells and monocyte-derived immature dendritic cells (DC). Fresh NK cells were activated, as indicated by the induced expression of the CD69 antigen, and their cytolytic activity was strongly augmented by contact with lipopolysaccharide (LPS)-treated mature DC, or with immature DC in the presence of the maturation stimuli LPS, Mycobacterium tuberculosis or interferon (IFN)-alpha. Reciprocally, fresh NK cells cultured with immature DC in the presence of the maturation stimuli strongly enhanced DC maturation and interleukin (IL)-12 production. IL-2--activated NK cells directly induced maturation of DC and enhanced their ability to stimulate allogeneic naive CD4(+) T cells. The effects of NK cells were cell contact dependent, although the secretion of IFN-gamma and TNF also contributed to DC maturation. Within peripheral blood lymphocytes the reciprocal activating interaction with DC was restricted to NK cells, because the other lymphocyte subsets were neither induced to express CD69, nor induced to mature in contact with DC. These data demonstrated for the first time a bidirectional cross talk between NK cells and DC, in which NK cells activated by IL-2 or by mature DC induce DC maturation.     

49例肿瘤患者外周血树突状细胞亚群与细胞免疫功能的研究

目的 检测晚期肿瘤患者外周血树突状细胞数量和T细胞亚群的表达,评价肿瘤患者的免疫功能.方法 应用流式细胞术检测49例晚期肿瘤患者外周血树突状细胞亚群的数量,免疫表型分别为:髓样树突状细胞,CD85K+CD33+CD(16+14)-;浆细胞树突状细胞,CD85K+CD123+CD(16+14)-;以及T淋巴细胞亚群的表达...