肺癌相关抗原的血清学筛选与鉴定

目的:筛选和鉴定肺癌肿瘤相关抗原,为肺癌早期诊断提供血清学标志物,并为研制肺癌疫苗提供候选抗原.方法:5份异体肺癌患者血清采用重组cDNA表达文库的血清学分析(SEREX)技术对肺癌cDNA表达文库筛选;对阳性克隆插入片段进行测序、生物信息学分析.结果:①筛选出70个阳性克隆,插入片段大小为300～2 800 bp.②测序:70个阳性克隆代表63个不同的基因.③生物信息学分析:1个基因与肺癌的发生、发展关系密切;34个基因报道与细胞的分化、代谢及信号转导等有关系,与其他肿瘤的发生、发展有关;26个基因的生理功能未见文献报道;2个插入片段未发现有同源基因,推测可能为新发现的基因.结论:使用SEREX技术成功鉴定了一组肺癌相关的肿瘤抗原.     

卵巢癌相关抗原cDNA表达文库的筛选

目的：从卵巢癌腹腔积液肿瘤细胞cDNA表达文库中筛选卵巢癌相关抗原。方法：采用SEREX方法从卵巢癌腹腔积液肿瘤细胞构建的cDNA表达文库中筛选阳性克隆。血清学筛选出的阳性克隆与SSH所得的差异表达基因探针进行杂交,最终得到特异性较高的阳性克隆。对这些克隆进行酶切鉴定、测序分析。结果：经二轮血清学筛选和DotBlot杂交,最终得到55个在血清中有相应IgG和（或）IgM自身抗体的卵巢癌差异表达的候选肿瘤抗原克隆。经核苷酸测序、序列分析和相似性比对,结果表明这55个EST片段代表45个基因,可分为6类：①3个与已知卵巢癌相关基因相似的基因,如BARD1等;②15个与其它肿瘤相关基因相似的基因,如TM4SF1等;③6个在一些特殊组织中表达的基因,如FXR1（fragileX-relatedgene1,脆性X染色体相关基因1）等;④8个与一些特殊功能蛋白基因相似的基因,如TIZ;⑤5个与胚胎来源的基因相似的基因,如PKHD1等;⑥8个在GenBank中无相似序列的新基因,如OV-189等。结论：SEREX方法与SSH方法相结合筛选肿瘤抗原的技术路线是一种行之有效的、能筛选具有较高特异性肿瘤抗原的策略。本研究为进一步研究这些抗原在卵巢癌的发生、发展及诊断方面的应用奠定了基础。     

应用SEREX技术筛选与鉴定鼻咽癌相关抗原

目的:应用SEREX技术筛选与鉴定鼻咽癌相关抗原,为鼻咽癌的早期诊断、免疫治疗和预后监测提供候选的生物学指标和理论基础。方法:从鼻咽癌新鲜活检组织中提取mRNA,构建cDNA表达文库。用鼻咽癌患者的血清筛选所构建的cDNA表达文库,获得的阳性克隆经扩增后提取噬菌粒DNA进行测序。所得序列与GenBank数据库中已知基因进行同源比较,分析其生物学特性。结果:所构建的cDNA原始文库含1×106个重组体,蓝白斑试验显示重组率为93%。用鼻咽癌血清对表达文库进行筛选,共获得21个阳性克隆,分别代表14个不同的cDNA插入片段。12个插入片段的DNA序列分别与基因库上的基因有不同程度的同源性,其中6个基因与鼻咽癌或其它肿瘤的发生、发展关系密切;另6个基因的生理功能未见文献报道。2个插入片段未发现有同源基因,推测可能为新发现的基因。结论:SEREX技术是目前筛选肿瘤抗原最简便、有效的手段之一。本文研究发现的抗原将为鼻咽癌的研究提供进一步的理论基础。     

系统性红斑狼疮血管炎相关自身抗原的血清学筛选

目的 通过重组cDNA表达文库的血清学分析(SEREX)技术获得系统性红斑狼疮(SLE)血管炎相关自身抗体所对应自身抗原的cDNA序列.方法 收集SLE病人血清作为筛选血清,采用SEREX技术筛选人微血管内皮细胞(HMVEC)cDNA文库.结果 通过两轮筛选获得11个阳性克隆.通过生物信息学分析发现这11个阳性克隆cDNA序列编码三种不同的自身抗原,分别为SSA、SSB和YB-1.其中YB-1尚未被报道过与SLE血管炎相关.结论 首次发现YB-1与SLE血管炎相关.通过SEREX技术,我们可能找到有助于SLE诊断、治疗和判断预后的自身抗原.     

SEREX方法鉴定胃癌肿瘤相关抗原基因

目的采用重组cDNA表达文库血清学分析法(SEREX法)寻找胃癌相关肿瘤抗原的编码基因.方法抽提胃癌细胞株SGC7901和1例胃癌组织标本PolyA+RNA,分别构建2个胃癌cDNA表达文库,用含有抗体的胃癌患者血清对2个文库进行筛选,并对筛选所得到的阳性克隆进行测序和生物信息学分析.结果经测定2个原始文库滴度分别为1.6×106pfu和2.5×106pfu,重组率为95%和98%.2个文库经3轮筛选共获得14个胃癌肿瘤相关抗原编码基因,其中一个为未知基因.13个已知基因编码产物包括代谢酶、RNA转录和翻译调控蛋白、蛋白代谢相关分子、自身免疫疾病相关抗原及未知功能蛋白分子.结论胃癌相关肿瘤抗原编码基因的筛选和鉴定,为胃癌的临床诊断和特异性免疫治疗提供了靶点,有助于对胃癌发生机制的深入理解.     

肺癌候选抗原的血清反应分析及其联合检测的应用

目的：通过重组cDNA表达文库血清学分析（SER-EX）技术筛选鉴定的5种肺癌候选抗原的血清学反应及其联合检测分析,对其能否作为肺癌早期诊断的血清学标志物进行评价,并提供一个肺癌早期诊断的新方向.方法：采用重组克隆抗原表达技术扩增5种肺癌候选抗原[分别是X5：二羟基苯甲酸内脂结合蛋白1配偶体（POB1）;X18：DNA拓扑异构酶Ⅱα（Top2A）;X44：中枢神经系肽酶Ⅰ（TPP1）;X48：热休克蛋白90а（HSP90а）;X52：真核翻译延长因子1γ（eukaryotic translation elongation factor 1 gamma）],免疫印迹法检测肺癌患者血清、正常人血清中自身抗体的反应,流行病学方法对其检测结果进行评价.结果：POB1,Top2A,HSP90а3个肺癌候选抗原克隆在肺癌患者血清和正常人血清中的相应IgG抗体阳性率差别有统计学意义（P〈0.05）;3个阳性反应抗原抗体反应联合分析时,能够在保持特异度等基本不变的前提下,明显提高诊断肺癌的灵敏度,具有较大的临床诊断价值.结论：3个抗原可作为肺癌的早期诊断的候选标志物,为肺癌的早期诊断提供了一个新的方向.     

中华眼镜蛇毒腺cDNA表达文库的建立和分析

目的: 为研究开发眼镜蛇毒药用基因工程产品,筛选克隆及表达相关药用功能基因,构建中华眼镜蛇毒腺cDNA表达文库. 方法:一步法提取总RNA,Oligo(dT)纤维素层析柱纯化mRNA,逆转录PCR合成双链cDNA,分级分离除去小片段后,收集大于500 bp的cDNA片段,取10 ng cDNA与质粒载体pSPORT1连接、转化. 结果:获得克隆总数为2×105的眼镜蛇毒腺cDNA表达文库,重组率97%. 利用PCR技术从该文库扩增了心脏毒素-3(CTX-3)和磷脂酶A2(PLA2)基因的cDNA. 通过对文库克隆的序列测定和初步生物信息学分析,获得24个中华眼镜蛇毒腺EST序列. 结论:所建立的毒腺cDNA表达文库质量较高,可用于进一步筛选、克隆蛇毒药用功能新基因.     

SEREX方法鉴定胃癌肿瘤相关抗原基因

目的采用重组CDNA表达文库血清学分析法(SEREX法)寻找胃癌相关肿瘤抗原的编码基因。方法抽提胃癌细胞株SGC7901和1例胃癌组织标本PolyA+RNA,分别构建2个胃癌cDNA表达文库,用含有抗体的胃癌患者血清对2个文库进行筛选,并对筛选所得到的阳性克隆进行测序和生物信息学分析。结果经测定2个原始文库滴度分别为1.6×106pfu和2.5×106pfu,重组率为95%和98%。2个文库经3轮筛选共获得14个胃癌肿瘤相关抗原编码基因,其中一个为未知基因。13个已知基因编码产物包括代谢酶、RNA转录和翻译调控蛋白、蛋白代谢相关分子、自身免疫疾病相关抗原及未知功能蛋白分子。结论　胃癌相关肿瘤抗原编码基因的筛选和鉴定,为胃癌的临床诊断和特异性免疫治疗提供了靶点,有助于对胃癌发生机制的深入理解。     

SEREX方法筛选人胎盘抗原

目的 筛选并获得来自人胎盘有潜在应用价值的抗原.方法 基于血清学筛选重组cDNA表达文库(serological analysis of recombinant cDNA expression library,SEREX)技术,制备人绒毛组织免疫的兔血清,利用该免疫血清筛选人胎盘组织cDNA表达文库,通过两轮筛选得到免疫反应阳性的单克隆重组噬菌体并测序,并对所得到的序列进行生物信息学分析.结果 经过两轮筛选共得到69个阳性反应克隆,序列分析发现它们代表12种不同的基因序列,其中功能已知基因9个,功能未知基因3个,进一步分析发现绒毛膜生长催乳激素基因(CSH1和CSH2)有57个阳性反应克隆.占总数的82.6%,可能是一个具有重要功能的抗原基因.所筛选到的其他基因与胚胎生长发育相关.结论 SEREX技术筛选胎盘抗原是行之有效的,本实验筛选出的抗原基因对研究胚胎生长发育具有一定的意义.     

原发型肝癌组织cDNA文库的构建及抗原基因的筛选

目的 构建人原发型肝癌组织cDNA文库,以SEREX方法从cDNA文库中筛选肝癌抗原基因.方法 采用确诊的原发型肝癌患者新鲜手术切除癌组织构建cDNA文库,测定原始文库滴度,进行蓝白筛选以确定文库的重组率.以肝癌患者的血清,采用血清学方法筛选所构建的cDNA文库,阳性克隆经PCR检测鉴定后进行序列分析.结果 成功构建了混合原发型肝癌cDNA文库经测定原始文库滴度为7.42X106pfu/mL,含3.96×106个重组子,重组率为93%,扩增文库滴度为3.92×109pfu/mL,cDNA插入片段大小在0.5～3.0 kb之间.文库经3轮血清学筛选共获得31个阳性克隆,分别代表了24个独立的cDNA插入片段(抗原基因).其中17个与已知基因高度同源,另外7个基因与GenBank中已知基因的部分同源,其中有3个是新基因.利用SMART技术构建了高质量的人原发型肝癌组织cDNA表达文库,有利于以cDNA文库为基础的进一步的实验研究.结论 应用SEREX技术初步筛选原发型肝癌组织cDNA文库,共得到17个原发型肝癌相关抗原基因,其中有3个是新基因,可能为原发型肝癌的免疫学研究提供新的研究分子.     

NPC相关抗原的血清学分析

目的:对重组克隆表达抗原血清学分析(SEREX)法筛选出的鼻咽癌(NPC)系列肿瘤抗原进行特异性检测,判断新检测出的NPC抗原的相应抗体在NPC病人血清及正常人血清中的阳性率,为NPC抗原对NPC的免疫诊断、免疫治疗积累基础资料。方法:运用噬菌体转染-蛋白印迹、免疫组织化学技术,检测3种NPC肿瘤抗原(GX-NPC-1,GX-NPC-2,GX-NPC-4)在20个NPC病人及15个正常人血清中的阳性表达率。结果:3种NPC肿瘤抗原在NPC病人血清中的阳性表达率分别为55%(11/20)、55%(11/20)、50%(10/20);正常人各为33.3%(5/15)、26.7%(4/15)、6.7%(1/15),经统计学分析,前两种肿瘤抗原在NPC及正常人血清中的表达差异无统计学意义,而GX-NPC-4在两种血清中的表达差异有统计学意义(P<0.01)。结论:3种NPC肿瘤抗原中GX-NPC-4抗原在NPC患者的血清中的表达率明显增高,可能为NPC特异性抗原,值得进一步研究。     

Detection and analysis of anti-latent membrane protein 2A antibodies in the sera of patients with Epstein-Barr virus associated malignancies

Background Epstein-Barr virus (EBV) associated malignancies with a Type Ⅱ latency gene expression pattern, such as Hodgkin‘s disease, and nasopharyngeal carcinoma (NPC) , frequently express the EBV antigen latent membrane protein 2A (LMP2A). We expected to establish a highly expressing LMP2A yeast cell strain and get the high quality LMP2A protein, which was used for detection, analysis and characterization of its antibodies in various patients‘ sera of EBV associated malignancies. Methods The plasmid pPICZαA-LMP2A containing the full length of LMP2A cDNA was constructed and transformed to Pichia pastoris GS115 to express LMP2A protein. After fermentation and purification, the LMP2A protein was used as an antigen to detect anti-LMP2A antibodies (Abs) in the sera of patients with EBVassociated malignancies in enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) or Western-blot. Results LMP2A was expressed successfully with an expected molecular weight of approximately 54 kD and Abs to LMP2A were strikingly specific to NPC. Two-thirds or more sera from NPC patients were positive for antiLMP2A immunoglobulin G (IgG) Abs. The antibodies were absent from the sera of other EBV-associated diseases except a small fraction of the gastric carcinoma. Comparing anti-viral capsid Ags (VCA) IgA and LMP2A IgA titers in the sera from 76 NPC patients, only 55% were positive for anti-LMP2A IgA Abs while 70% were positive for anti-VCA IgA. However, we found that 3 sera negative for VCA IgA were positive for LMP2A IgA. Conclusion The results suggested the potential significance of LMP2A specific Abs for the diagnosis of EBVassociated malignancies, especially NPC.     

人鼻咽癌组织中转录因子相关基因的差异表达分析

目的 用cDNA微阵列膜比较鼻咽癌组织及正常组织的基因表达谱,研究鼻咽癌组织中转录因子相关基因的差异表达,为进一步探讨差异表达基因的调控机制奠定基础.方法 24例鼻咽癌组织总RNA和正常对照总RNA(24例正常鼻咽组织RNA等质量混合)分别经逆转录探针标记与微阵列膜杂交.然后用Pathway4.0软件分析杂交结果,并用RT-PCR反应验证微阵列杂交结果.结果 在1625个鼻咽癌差异表达基因中,共有转录因子相关基因35个,12个基因表达上调,23个基因表达下调.结论 在鼻咽癌组织中,多个转录因子相关基因的表达水平发生了变化,这些转录因子在鼻咽癌组织的基因表达调控中发挥重要作用.     

CR2和MXLIP在低分化鼻咽癌组织中的差异表达

目的 为了解低分化鼻咽癌组织与非癌症组织之间的基因表达差异,进一步找出有明显差异表达的基因作为诊断鼻咽癌新的分子标志.方法 实验通过14 112个点的cDNA基因表达谱芯片,比较20例低分化鼻咽癌组织和15例鼻咽慢性炎症组织之间的表达差异,并通过荧光实时定量PCR对50例鼻咽癌组织进行验证.结果 基因芯片的分析结果显示,9个基因（q〈0.01）至少在17例（85%）鼻咽癌组织中有2倍差异表达,包括8个下调基因（TAOK3,SLC16A2,PRB4,AMY2B,B3GALT4,MSMB,RPS27,CR2）和1个上调基因（MXLIP）.进一步研究表明,选用CR2和MXLIP对50例低分化鼻咽癌组织荧光实时定量PCR分析与3例鼻咽慢性炎症组织进行比较,与芯片实验结果相同,CR2在41例（82%）鼻咽癌组织中下调,MXLIP在42例（84%）鼻咽癌组织中上调.结论 我们认为这两个基因可以作为诊断低分化鼻咽癌新的标志基因.     

衰老标记蛋白-30--一种新的肝细胞癌相关抗原

目的：寻找人肝细胞癌（ＨＣＣ）特异抗原。方法：应用重组克隆表达抗原的血清学鉴定技术（ＳＥＲＥＸ）,用病人自身血清从广西肝细胞癌ＣＤＮＡ文库中选出编码ＨＣＣ肿瘤抗原的基因克隆,用肝癌患者及其他人血清检验ＨＣＣ肿瘤抗原原肝癌的特异性,测定抗原ＤＮＡ序列并一基因库核对寻找其同源结构。结果：其中一种ＨＣＣ肿瘤抗原与衰老标记蛋白－２０（ＳＭＰ－３０）是同源结构。相应抗体主要只见于ＨＣＣ病人,在２０例其它５种     

用原代细胞培养和人全基因表达谱芯片筛选鼻咽癌差异表达基因

目的 利用细胞的原代培养技术及人全基因表达谱芯片技术初步筛选出鼻咽癌差异表达基因,以发现与鼻咽癌发生、发展相关的新的候选基因.方法 分别用1例鼻咽癌细胞株C666及5例鼻咽癌培养出的原代细胞和3例鼻咽正常上皮的原代细胞,进行基因表达谱分析,并以荧光定量PCR及免疫组织化学验证芯片结果.结果 原代培养的鼻咽癌细胞和鼻咽正常上皮细胞通过细胞角蛋白的免疫细胞化学染色、EBER1原位杂交和EBV-DNA荧光定量PCR证实;鼻咽癌原代细胞和鼻咽正常上皮原代细胞的基因表达谱有显著差异;4例以上共同表达的差异基因有493个,包括上调基因264个,下调基因229个.荧光定量PCR及免疫组织化学结果和芯片结果一致.结论 用原代培养细胞及人类全基因组基因芯片构建基因表达谱能够准确、高效地筛选出鼻咽癌相关的差异表达基因,该基因表达谱的建立为研究鼻咽癌分子生物学机制、鼻咽癌的分子分型和分子诊断提供了重要的分子依据.     

转染人pIgR的小鼠鼻咽上皮细胞在EBV感染前后基因表达谱差异

目的 应用cDNA阵列技术研究转染人多聚免疫球蛋白受体(hpIgR)的二亚硝基哌嗪(n，n′-dinitrosoperazine，DNP)转化的小鼠鼻咽上皮(TMNE)细胞系在：EBV感染前后基因表达谱差异，探索EBV在鼻咽癌发病过程中的作用及鼻咽癌的发病机制。方法提取转染hpIgR的TMNE细胞在EBV感染前后的总：RNA，逆转录成α-^32p-dATP标记的cDNA探针，与Atlas^TM mouse cancer array 1．2阵列膜进行杂交。利用AtlaslmageTM软件分析基因表达差异。结果 共有25个基因表达水平发生了改变．有23个基因表达上调，2个基因表达下调。结论 EBV感染可使转染细胞的多个基因表达发生改变，这些基因可能与鼻咽癌的发生、发展有关。     

鼻咽癌患者血清中自身抗体的初步检测

目的:探讨鼻咽癌患者血清中是否存在抗鼻咽癌自身抗原的抗体,为寻找鼻咽癌新的肿瘤标志物提供依据.方法:制备Epstein-Barr病毒阴性的鼻咽癌细胞株CNE1细胞板,酶联免疫吸附实验(ELISA)分析其与32例鼻咽癌患者血清和54例正常血清反应的差异性;提取CNEl总蛋白,Western印迹分析其与鼻咽癌患者血清反应是否存在特异性的蛋白质.结果:ELISA分析显示鼻咽癌患者血清平均滴度(0.904±0.032)明显高于正常人血清平均滴度(0.736±0.028)(P＜0.01);Western印迹分析发现鼻咽癌患者血清与正常人血清相比,部分阳性条带一致,但条带强度增加,还发现出现了部分新的阳性条带,这些条带可能属于鼻咽癌相关抗原或鼻咽癌特异性抗原.结论:鼻咽癌患者血清中存在抗鼻咽癌自身抗原的抗体,这些抗体并非针对Epstein-Barr病毒,为寻找鼻咽癌血清肿瘤标志物提供了依据.     

3号染色体短臂21-22区域63个新基因在鼻咽癌组织中的差异表达

目的寻找与鼻咽癌发病密切相关的未知基闪。方法对63个定位于3号染色体短臂21-22 D3S1609-D3S1295区域的单拷贝并代表未知基因的EST簇进行网上克隆，在获取基因大片段或全长cDNA序列的基础上，应用半定量逆转录．聚合酶链反应检测63个未知基因在4种鼻咽癌细胞铢、32例鼻咽部低分化鳞状细胞癌组织和16例鼻咽部慢性炎症组织中的表达状况。结果49个未知基因在鼻咽癌组织和鼻咽部慢性炎症组织问的表达水平无显著性差异；8个未知基因在鼻咽癌和鼻咽部慢性炎症组织中均不表达；2个未知基因在鼻咽癌组织中表达明显增强；4个未知基因在鼻咽癌组织中表达明显减弱，其中Hs．27566基因在鼻咽癌细胞和组织中均显著低表达或不表达。结论在染色体3p21-22D3S1609．D3S1295区域构建了63个未知基因在鼻咽癌的表达差异谱：筛选出6个在鼻咽癌组织中差异表达的未知基因。