应用荧光定量PCR检测食品中沙门菌

目的应用荧光定量PCR技术检测食品中沙门菌,为病原监测和快速诊断提供实验依据。方法选择沙门菌invA基因设计引物,应用SYBRGreen I染料建立荧光定量PCR法。分别对61株沙门菌、14株非沙门菌以及食品模拟标本、市售禽蛋制品进行检测,观察方法的特异性、敏感性和可行性。结果建立的荧光定量PCR法检测所有沙门菌均出现了特异的熔解曲线,扩增产物的熔点值79.6℃左右;目标菌DNA的扩增产物循环数（Ct值）为20,空白对照及非沙门菌的Ct值大于30,非沙门菌均未出现特异的熔解曲线。每反应最低检测的沙门菌数是31 CFU;对食品中人工污染的沙门菌的检测,最低检测量是1 CFU,检测时间为7～8 h,与培养法比较,阳性符合率100%;对市售的369份禽蛋制品进行检测,阳性结果 19份,而细菌培养法检测阳性结果为12份。结论基于SYBRGreen I染料建立的荧光定量PCR检测沙门菌是敏感、特异、省时、省力的方法,适用于沙门菌快速检测。     

TaqMan MGB探针法实时荧光定量PCR快速检测支原体的研究

目的:建立特异、敏感、快速检测支原体的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法。方法:针对支原体16S rRNA基因的保守区设计特异性引物和探针,建立支原体TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方检测方法,验证方法的特异性、敏感性和稳定性。对2008～2010年期间在北京采集的680份小型猪、小鼠、大鼠样本中的支原体进行检测,同时进行分离培养和常规PCR检测。结果:建立的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法对支原体的检测具有高度的特异性,对空肠弯曲菌、支气管鲍特杆菌、肺炎克雷伯杆菌、侵肺巴斯德氏菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、乙型溶血性链球菌均无交叉反应,检测的灵敏度达9.2拷贝。标准曲线显示各浓度范围内具有良好的线性关系,相关系数为0.999,斜率为-3.328,TaqManMGB探针实时荧光定量PCR效率为100%。对680份动物样本进行检测,结果TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR和常规PCR均能检出77份支原体阳性样本,但分离培养未能检出支原体阳性样本。结果显示,建立的TaqMan MGB探针实时荧光定量PCR方法比细菌分离培养方法更敏感,能够直接从动物样本中检出支...     

双重实时荧光定量PCR技术检测中药制剂中沙门氏菌和大肠埃希菌

目的: 建立双重实时荧光定量 PCR( multiplex quantitative real-time PCR,multiplex q PCR) 快速检测中药制剂中沙门氏菌和大肠埃希菌 2 种常见控制菌的方法。方法: 筛选两种目标菌株的特异性引物与探针,扩增沙门氏菌的 inv A 基因和大肠埃希菌的 uid A 基因,优化反应体系,建立双重荧光定量 PCR 方法。结果: 两对引物探针对沙门氏菌和大肠埃希菌均有较好地扩增效率,人工污染中药制剂中沙门氏菌的检出限为 10¹CFU·m L^{- 1},大肠埃希菌的检出限为 10¹CFU·m L^{- 1}。结论: 本研究建立的双重实时荧光定量 PCR 方法具有特异性强、重复性好,灵敏度高等特点、适用于中药制剂中沙门氏菌和大肠埃希菌的快速检测。     

SYBR Green Ⅰ荧光检测法测定双链DNA含量

目的 建立对双链DNA（dsDNA）进行定量的方法。方法 将SYBR Green I与不同浓度dsDNA混合后检测荧光强度并建立荧光强度与dsDNA浓度的标准曲线，同时检测RNA、单链DNA（ssDNA）、蛋白质以及实验中常见的其他物质对dsDNA定量结果的影响。结果 当dsDNA浓度为50～2 000 ng·mL 1时，荧光强度与dsDNA浓度有良好的线性关系（Y=11.375X－266.13，r=0.999 76）。并且定量结果不易受到ssDNA、RNA、蛋白质或其他物质的干扰。结论 用荧光染料SYBR Green I对dsDNA进行定量具有特异性好、灵敏度高、能实现高通量等优点，是一种理想的核酸定量方法。     

SYBR Green Ⅰ荧光检测法测定双链DNA含量

目的 建立对双链DNA(dsDNA)进行定量的方法.方法 将SYBR Green Ⅰ与不同浓度dsDNA混合后检测荧光强度并建立荧光强度与dsDNA浓度的标准曲线,同时检测RNA、单链DNA(ssDNA)、蛋白质以及实验中常见的其他物质对dsDNA定量结果的影响.结果 当dsDNA浓度为50～2 000 ng·mL-1时,荧光强度与dsDNA浓度有良好的线性关系(Y=11.375X-266.13,r=0.999 76).并且定量结果不易受到ssDNA、RNA、蛋白质或其他物质的干扰.结论 用荧光染料SYBR Green Ⅰ对dsDNA进行定量具有特异性好、灵敏度高、能实现高通量等优点,是一种理想的核酸定量方法.     

实时荧光定量PCR法检测门冬氨酸鸟氨酸原料药中毕赤酵母菌DNA残留量

目的 建立可定量检测门冬氨酸鸟氨酸原料药中毕赤酵母菌DNA残留量的实时荧光定量PCR方法。方法 采用宿主细胞残留DNA样本前处理试剂盒（磁珠法）提取毕赤酵母菌DNA,利用毕赤酵母残留DNA检测试剂盒（PCR-荧光探针法）进行扩增反应,绘制标准曲线,建立毕赤酵母菌DNA残留量的Real-time PCR检测方法,并验证其准确性和精密性。结果 毕赤酵母菌DNA质量浓度在0.03~300 pg·μL^-1内线性良好（r>0.99）,定量限为0.03 pg·μL^-1;应用该法对3批门冬氨酸鸟氨酸原料药进行测定,毕赤酵母菌DNA残留量均远低于每剂10 ng。结论 该方法可用于门冬氨酸鸟氨酸原料药中毕赤酵母菌DNA残留量的定量测定。     

实时荧光定量PCR检测沙门菌flor基因和sul2基因方法的建立

目的 建立一种flor基因和sul2基因的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法,为检测沙门菌的耐药性以及耐药基因分子流行病学调查奠定基础.方法 以氟苯尼考、复方磺胺甲噁唑抗性的沙门菌菌株为材料,根据GenBank中登陆的沙门菌flor和sul2基因序列,设计并合成引物,建立基于SYBR Green Ⅰ染料技术的Real-Time PCR检测体系,绘制出标准曲线并对其溶解曲线进行分析.结果 以pMD 18-T为载体构建的标准品的Ct值与样品的浓度的对数在一定范围内呈现良好的线性关系,两基因的检测域值较小,flor基因可以检测到102 copies/μL的样品,sul2基因可以检测到103 copies/μL的样品,经耐药性与基因表达量相关分析,耐药性较高的菌株其flor基因、sul2基因表达量也较高.结论 建立的检测沙门菌中flor因和sul2基因的荧光定量PCR方法具有很好的灵敏性、特异性和重复性,可以广泛用于临床中lor和sul2两种基因的检测以及沙门菌耐药分子流行病学的调查.     

SYBR Green实时荧光定量PCR技术平台的建立

目的建立SYBRGreen实时荧光定量PCR技术平台。方法通过摸索SYBRGreen工作液的配制方法,经典PCR检测HBVDNA方法转为SYBRGreen实时荧光定量PCR方法及建立大鼠TGF-bate1mRNA表达水平的SYBRGreen实时荧光定量PCR方法。结果SYBRGreenⅠ工作液,40×H2O溶液稳定性好,最佳反应浓度为1∶10000。HBVDNA的SYBRGreen实时荧光定量PCR方法,最佳的MgCl2反应浓度4.0mmol,引物浓度0.5μmol,81℃时收集荧光信号。定量分析用标准曲线斜率为-3.32,相关系数为-0.994,误差为0.016。大鼠TGF-bate1表达水平的SYBRGreen实时荧光定量PCR方法,TGF-bate1和Bate-actin的最佳MgCl2反应浓度均为3.5mmol,引物浓度前者为0.8μmol,后者为0.5μmol,在87℃时收集荧光信号。靶基因TGF-bate1mRNA的相对量用下述公式计算:(1+Etgf)Ct1/(1+Eact)Ct2。结论初步建成了可检测DNA和mRNA的SYBRGreen实时荧光定量PCR技术平台。     

实时荧光定量PCR分析细菌的组成及数量

目的采用实时荧光定量PCR的方法对酸奶中的乳酸杆菌和双歧杆菌进行检测。方法通过标准菌株的培养和标准曲线的构建,建立检测乳酸杆菌和双歧杆菌的实时荧光定量PCR的检测方法,对送检的4组样品进行检测。结果通过标准曲线的构建得到乳酸杆菌和双歧杆菌的标准曲线方程：乳酸杆菌：Y=-3.293x＋14.52;其r值为0.999;双歧杆菌为：Y=-3.464x＋17.42,其r值为0.998,不同品牌的酸奶中,乳酸杆菌和双歧杆菌的数量存在很大差异,由于保密原因,本文将酸奶品牌简称为1、2、3、4,1和2两个品牌的酸奶中乳酸杆菌和双歧杆菌的数量均高于3和4号两个品牌,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论实时荧光定量PCR可以准确的对样品中乳酸杆菌和双歧杆菌的数量进行检测。     

人博卡病毒荧光定量PCR方法(TaqMan探针法)的建立及其在血液制品污染情况调查中的应用

目的 开发快捷方便的检测人博卡病毒（human bocavirus,HBoV）方法,并调查华南地区血液制品和原料血浆中的污染情况。方法 建立HBoV的TaqMan探针实时荧光定量PCR方法,并对相关血液制品企业提供的单人份血浆和原料血浆样品、人血白蛋白、静脉注射免疫球蛋白（intravenous immunoglobulin,IVIG）、人纤维蛋白原、人凝血因子Ⅷ及人纤维蛋白胶-人纤维蛋白原中HBoV的污染情况进行检测。结果 HBoV-DNA在原料血浆和人凝血因子Ⅷ样本中的检测率分别为5.2%和5.0%,但在其他血液制品中则没有检出。结论 本研究建立的基于TaqMan探针HBoV的实时荧光定量PCR方法可以很好地检测出原料血浆及血液制品中的HBoV,对于血液制品的病毒安全有重要意义。     

罗山县某酒店猪伤寒沙门氏菌引起食物中毒的调查报告

目的：了解此次食物中毒的基本情况和引起食物中毒原因。方法对聚集性食物中毒患者和就餐酒店,进行流行病学调查,采集样本病原学检测及分析。结果在一份卤制品和3个粪便标本中检出了共同血清型为O6,7：Hc的猪沙门氏菌。结论确定了此次食物中毒的原因为食品受猪伤寒沙门氏菌污染。     

实时定量聚合酶链反应结合Taqman荧光探针JCV-P检测肾移植受者JC病毒

目的建立肾移植受者尿液和外周血JC病毒(JCV)感染实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测方法。方法针对JCV基因组设计特异性引物JCV-F和JCV-R,Taqman荧光探针JCV-P,探针的5′端标记有荧光基团,在除5′端外的任意一个位置上标记有淬灭基团;然后处理待测样本,进行PCR反应,建立重组质粒标准曲线,评价特异性、灵敏度、重复性。结果将检测阳性的扩增产物进行基因测序,测序结果经BLAST比对后证实JCV基因序列;利用上述方法对86份样本进行检测:20份JCV血清样本及20份JCV尿液样本检测均为阳性,有S型扩增曲线,动态范围测定显示103¹ 010拷贝/mL标准曲线具有良好的相关性;20份健康人尿液样本和20份血液样本及6份临床常见的其他病原体血液样本检测均为阴性,无S型扩增曲线。结论实时荧光定量PCR结合Taqman荧光探针JCV-P检测肾移植术后患者JCV方法可用于肾移植术后JCV感染的的早期诊断,对预防JCV感染造成的多瘤病毒相关性肾病(PVAN)和进行性多灶性脑白质病(PML)具有一定意义。     

实时荧光定量PCR方法应用于药品无菌快速检测的研究

目的 建立应用实时荧光定量PCR进行无菌快速检测的方法。方法 选取金黄色葡萄球菌及大肠埃希菌,用裂解试剂盒抽提细菌基因组DNA,进行实时荧光定量PCR检测,并应用叠氮溴化丙锭（PMA）抑制样品中死菌基因组DNA的PCR扩增。结果 PMA能有效去除样品中死菌干扰,针对16S rRNA基因保守序列进行扩增的荧光定量PCR方法具有较高的灵敏度。在金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌检测中,最低含菌量组与阴性对照组Ct值有明显差异（P〈0.05）,其最低检出限为2 CFU/PCR。在对人工污染药品的无菌检测中,该方法与药典检测方法结果一致。结论 进行无菌检查时,采用PMA去除样品中死菌基因组DNA干扰,以裂解试剂盒抽提细菌基因组后用荧光定量PCR分析样品中细菌污染,可将检测时间缩短到4 h左右,操作简单,灵敏性高,可应用于药品无菌检查的快速筛查。     

荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒DNA的研究

目的用荧光定量PCR对HBV-DNA载量进行实验性研究。方法扩增含有3个乙肝病毒基因组pBR322质粒中的乙肝病毒目的序列,并通过AT亚克隆至pBS-T载体中。经过筛选、鉴定及测序验证保证相对更高的拷贝数。对3个保守序列进行了常规PCR退火温度的优化和灵敏度的检测,建立荧光定量PCR反应体系从而制备标准曲线。结果曲线相关系数为99.5%,具有较高的可信度。负相关范围在5×10^3-5×10^9copies/μl。不论是批内还是批间其变异系数值均小于5%。结论荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒DNA可以灵敏度好,准确度高,应加大研究降低成本应用于检验应用。     

荧光探针法检测脏器硫化氢方法的建立及验证北大核心CSCD

目的快速制备并分离纯化硫化氢特异性荧光探针(Washington State Probe-5),建立动物组织中硫化氢的荧光探针测定法,并在癌性胸水模型中进行方法适用性验证。方法优化条件分离纯化WSP-5;对荧光探针反应液配制溶剂、DMSO加入体积、pH、反应液溶剂和反应液体积、样品前处理温度、研磨次数、研磨后静置时间等条件进行考察;以S-180腹水瘤细胞建立癌性胸水小鼠模型,测定小鼠各脏器中的硫化氢含量。结果以硅胶和葡聚糖凝胶为固定相,二氯甲烷-甲醇-甲酸(60∶1∶0.1,V/V/V)和二氯甲烷-甲醇(1∶1,V/V)为洗脱剂制备WSP-5纯品;动物组织样本和硫氢化钠标准溶液加入优化后的5倍量冰冷反应液,低温研磨、高速离心,上清液避光孵育12 h,测定荧光强度并计算硫化氢浓度;该方法检测限约0.6μmol·L^(-1),定量限1μmol·L^(-1),在硫氢化钠一定浓度范围内,浓度与荧光强度线性系数均大于0.99;在癌性胸水小鼠模型中,各脏器硫化氢含量随着注射癌细胞数量的增多均有不同程度的增加趋势。结论该方法操作简单、成本低、灵敏度高、特异性强,适合各类组织样本的高通量检测,可为硫化氢相关药效机制的深入研究和相关药物开发提供方法学参考。     

荧光定量RT-PCR滴度检测法在腮腺炎减毒活疫苗制造中的应用

目的:为促进荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)滴度检测法在腮腺炎减毒活疫苗制造中的实际应用提供参考。方法:建立滴度-ct值标准曲线回归方程;分别用微量细胞病变法和荧光定量RT-PCR滴度检测法对10批腮腺炎减毒活疫苗单次收获液及成品进行滴度检测,比较检测结果。结果:两种方法检测结果经配对t检验分析,P分别为0.743、0.868,差值均值分别在(-0.174,0.094)、(-0.113,0.153)之间,差异无统计学意义,可以认为等同。结论:荧光定量RT-PCR滴度检测法可用于腮腺炎减毒活疫苗制造过程中的单次收获液及成品滴度检测,有望进一步升级为《中国药典》方法。     

基于SBD-F的荧光增强型传感器用于复方氨基酸注射液中半胱氨酸的快速测定

目的：以7-氟苯呋咱-4-硫酸铵盐(SBD-F)为荧光增强型化学传感器,建立一种用于半胱氨酸定量检测的方法。方法：以SBD-F作为荧光探针,考察其对半胱氨酸的响应,并进行方法学验证。结果：该传感器对半胱氨酸具有较好的选择性和较高的稳定性,半胱氨酸在0.1～0.6 mg·mL^-1的浓度范围内与传感器荧光强度呈良好的线性关系(R²=0.988),方法检出限为0.009 mg·mL^-1(S/N=3),加标回收率为102.1%～103.8%。结论：本研究通过建立荧光增强型传感器实现了对复方氨基酸注射液18AA-Ⅶ中半胱氨酸的定量检测。     

重组毕赤酵母中Textilinin-1基因拷贝数的荧光定量PCR法检测

 目的 利用荧光定量PCR法检测重组毕赤酵母外源纤溶酶抑制剂Textilinin-1基因的拷贝数。方法 采用双标准曲线法,以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）基因为内源参照基因,分别利用含有GAPDH和Textilinin-1基因的质粒,进行荧光定量PCR反应,建立标准曲线。对重组毕赤酵母基因组进行荧光定量PCR反应,通过标准曲线计算出外源Textilinin-1基因在毕赤酵母基因组中的拷贝数。结果 GAPDH和Textilinin-1基因的扩增效率分别95.04%和96.36%,两条标准曲线的决定系数均为0.999,且均具有良好的重复性,共检测10个单菌落,均得到Textilinin-1基因拷贝数为2。结论 建立的方法能够鉴定重组毕赤酵母中Textilinin-1基因的拷贝数。     

实时定量PCR法测定乙肝病毒脱氧核糖核酸

目的：建立实时定量PCR法测定血清样品中乙肝病毒脱氧核糖核酸（HBV—DNA）含量。方法：用PEG-裂解-煮沸法从血清中提取核酸,制作成标准浓度曲线后,对100份患者样本进行实时荧光定量分析,并与ELISA（酶标法）结果作比较,再与CAP—CTM法（化学发光法）进行比较。结果：用SPSS（V．16）软件进行统计分析,得线性回归方程y=-3．212X＋44．90;r^2=0．9980;日内、日间平均误差为RSD〈2．15％：最低检测限是400copies／mL（拷贝数）：该法测得患者HBV—DNA的浓度与EUSA测出样品阳性发生率呈正相关,再与CAP—CTM作配对t检验,P〉0．05,两者无显著性差异。结论：新建的PCR检测法敏感度高,重现性好,线性范围较广,可用于进行临床血清样本中HBV—DNA的定量检测,这对评估HBV患者诊治效果有帮助。     

阳春砂的荧光定量PCR检测与鉴定

摘 要 目的： 分析研究阳春砂基因序列特征,建立基于DNA分子的快速甄别阳春砂的荧光定量PCR技术。方法: 收集阳春砂及同科其他样品,经专家鉴别后,提取DNA。根据阳春砂ITS序列两端相对保守区设计引物和探针,优化反应条件,建立阳春砂的荧光定量PCR检测方案。 结果:基于阳春砂ITS序列两端相对保守区设计了引物和探针,通过条件优化,建立的荧光定量PCR检测方法能成功对阳春砂样品进行检出,而同科其他非阳春砂样品无扩增曲线。结论: 阳春砂药材能够通过除传统专家鉴定方法以外的荧光定量PCR方法快速检出。