炎症反应及细胞内钙浓度异常升高在脓毒症发展中的作用分析

探讨炎症反应及细胞内钙浓度异常升高(钙超载)在脓毒症发展中的作用。构建血管内皮细胞损伤模型,后使用基质相互作用分子1(Stim1)抑制表达载体、Tlr4抑制表达载体转染细胞,再通过脂多糖活化Toll样受体4(Tlr4)抑制表达载体转染12 h,脂多糖刺激6 h,使用核转录因子-κB(NF-κB)抑制剂PDTC 以及Tlr4抑制表达载体转染1 h、12 h。结果显示脂多糖刺激人脐静脉内皮细胞后Tlr4、髓质分化蛋白2、NF-κB mRNA相对表达量明显高于刺激前(P<0.05)。Stim1抑制表达载体转染可显著逆转脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞外钙离子内流。Tlr4抑制表达载体+脂多糖组、Tlr4及Stim1抑制表达载体+脂多糖组钙离子浓度明显低于脂多糖组(P<0.05)。 实验表明,下调Tlr4、NF-κB、Stim1表达可显著抑制脂多糖诱导的血管内皮细胞炎症反应和钙超载,缓解脓毒症病情进展。     

血管内皮生长因子基因体外转染人脐静脉内皮细胞的实验研究

观察血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)基因转染对人脐静脉内皮细胞的生物学作用,探讨其在人工血管抗血栓形成中应用的可行性.将真核表达质粒pCD-hVEGF165体外转染人脐静脉内皮细胞.原位杂交、免疫组化及ELISA法检测VEGF基因的表达并描绘内皮细胞生长曲线.结果发现VEGF基因转染能明显促进内皮细胞的分裂增殖.提示VEGF基因有可能作为增强人工血管抗血栓能力的有效候选基因.     

血管紧张素II通过下调血管内皮钙粘连蛋白抑制血管内皮细胞中紧密连接蛋白1的表达

目的：探索血管紧张素II(Ang II)引发微血管内皮通透性增加的具体机制。方法：大鼠主动脉内皮细胞原代培养鉴定,取4-7代细胞用于实验,将细胞分为对照组、Ang II组、Ang II+缬沙坦组。采用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-q PCR）、蛋白质印迹（Western blot）法检测细胞中紧密连接（ZO-1）、血管内皮钙粘连蛋白（VE-cadherin）的表达,免疫荧光染色检测细胞中ZO-1蛋白的分布。通过向内皮细胞转染过表达VE-cadherin质粒,检测过表达VE-cadherin对Ang II诱导的ZO-1蛋白表达和蛋白分布改变的影响。结果：相比于对照组,Ang II组内皮细胞ZO-1和VE-cadherin在mRNA和蛋白水平的表达均显著减少（P<0.01）,且ZO-1蛋白在细胞周边分布的趋势显著降低。在Ang II干预的内皮细胞中过表达VE-cadherin后,内皮细胞ZO-1蛋白表达增加（P<0.01）,细胞周边分布趋势显著增强。结论：Ang II通过下调VE-cadherin抑制血管内皮细胞中ZO-1蛋白的表达,从而破坏内皮细胞间的紧密连接,这可能是An...     

血管内皮生长因子基因体外转染人脐静脉内皮细胞的实验研究

观察血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF)基因转染对人脐静脉内皮细胞的生物学作用,探讨其在人工血管抗血栓形成中应用的可行性。将真核表达质粒pCD－hVEGF165体外转染人脐静脉内皮细胞。原位杂交、免疫组化及ELISA法检测VEGF基因的表达并描绘内皮细胞生长曲线。结果发现：VEGF基因转染能明显促进内皮细胞的分裂增殖。提示VEGF基因有可能作为增强人工血管抗血栓能力的有效候选基因。     

血管内皮生长因子在内皮细胞的稳定表达促进一氧化氮分泌

目的：建立稳定表达血管内皮生长因子的人脐静脉内皮细胞系，研究转染后对内皮细胞生长和一氧化氮分泌的影响。方法：将真核表达载体PCD2－VEGF121，用阳离脂质介导，转染人脐静内皮细胞系细胞，分别用RT－PCR、免疫组化，Miles实验检测血管内皮生长因子的转录，蛋白质的表达及其生长物学活性，检测转染后内皮细胞生长状况和培养基中一氧化氮水平，结果：RT－PCR检测出了转录血内皮生长因子的稳定转染细胞克隆，该单克隆细胞的免疫组化检测血管内皮生长因子蛋白质表达结果呈阳性，Miles实验表明其表达产物具有生物学活性，而作为对照的转空白质粒细胞和未转染细胞上述实验结果皆为阴性；转染后内皮细胞生长明显加快，一氧化氮水平在48h和72h时明显增高，结论：成功建立了稳定表达血管内皮生长因子的内皮细胞系，血管内皮生长因子转染可促进内皮细胞生长和一氧化氮分泌。     

低氧诱导因子促内皮祖细胞活性的可行性研究

目的探讨在体外低氧诱导因子-1α(HIF-1α)促血管内皮祖细胞(EPCs)成血管活性的可行性.方法密度梯度法分离人外周血EPCs,电穿孔技术转染HIF-1α质粒至EPCs,RT-PCR法观察未转染/转染质粒在转染后3、12、20、72 h,HIF-1α及下游靶基因血管内皮生长因子(VEGF)mRNA表达含量的变化;免疫组化法检测常氧中转染前后HIF-1α蛋白表达、VEGF受体Flk-1蛋白表达在不同组质粒转染后的差异;ELISA法测定各组质粒转染后VEGF在培养基上清中释放含量及VEGF依赖性一氧化氮合成酶(eNOS)含量的改变.结果HIF-1α基因有效转染入EPCs;HIF-1αmRNA在未转染时即有表达,在HIF-1α质粒转染后3、12、20、72 h,含量较未转染时增加(P＜0.05);HIF-1α过表达诱导VEGF表达上调(P＜0.05).Flk-1蛋白在常氧下有一定含量,在HIF-1α质粒转染后Flk-1蛋白表达进一步增加.VEGF释放含量在HIF-1α过表达组显著增加(P＜0.05);HIF-1α诱导eNOS含量增加,并与时间、VEGF刺激量成正比.结论HIF-1α质粒在体外能有效的转染入EPCs,促进其下游靶基因及受体表达,引起相应的功能学改变,促EPCs向内皮细胞分化、扩增,可进一步应用于基因治疗.     

VEGF对内皮抑素诱导的血管内皮细胞凋亡的抑制作用

目的 探讨血管内皮生长因子(VEGF)对内皮抑素(ES)诱导的血管内皮细胞凋亡的抑制作用.方法 构建携带ES基因的重组腺病毒Ad-ES感染脐静脉内皮细胞ECV-304,用RT-PCR及Western blot检测ES的转录和表达;实验组为Ad-ES+VEGF组,空白对照组为空载重组腺病毒Ad-Track组,阴性对照组为...     

脓毒症性肾损伤大鼠血管内皮钙粘蛋白的表达

目的观察大鼠脓毒症肾损伤血管内皮钙粘蛋白(VE-cadherin)在肾组织表达水平及血清中的变化特点,初步探讨VE-cadherin在大鼠脓毒症性肾损伤发生中的作用。方法健康成年SD大鼠45只,随机数字表法分成对照组、脓毒症肾损伤12 h组、脓毒症肾损伤24 h组,每组15只。对照组尾静脉注射生理盐水5 m L/kg,脓毒症组尾静脉注射脂多糖(LPS)7.5 mg/kg造模。应用HE染色观察肾组织形态;免疫印迹法检测肾组织中VE-cadherin蛋白表达;实时荧光定量PCR检测肾组织VE-cadherin mRNA表达;酶联免疫吸附法检测血清中VE-cadherin、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF-α)浓度。结果三组大鼠肾脏组织VE-cadherin mRNA、VE-cadherin蛋白和血清VEcadherin水平,12 h及24 h组均显著低于对照组,差异有统计学意义(F=243.2、156.6、209.6,P0.05)。三组大鼠血清IL-6、TNF-α、BUN、sCr水平,12 h及24 h组显著高于对照组,差异有统计学意义(F=249.7、144.5、180.7、717.9,P均0.05)。与脓毒症肾损伤12 h组相比,24 h组大鼠肾组织VE-cadherin mRNA水平、VE-cadherin蛋白水平、血清VE-cadherin水平显著低于12 h组,血清IL-6、TNF-α、BUN、sCr水平显著高于12 h组,差异均有统计学意义(P0.05)。结论脓毒症时炎症反应诱导VE-cadherin在肾组织表达下调,血管内皮细胞受损从而增加肾脏血管内皮细胞的通透性,导致肾损伤发生。     

VEGF165-tPA双基因真核表达载体的构建和体外表达

目的构建人血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)和人组织型纤溶酶原激活因子(tPA)双基因的新型真核表达载体pIRES-VEGF165-tPA,并通过转染人脐静脉内皮细胞系EA.hy926细胞,验证载体的体外表达情况。方法将目的基因片段VEGF165和tPA插入到真核表达载体pIRES质粒中,体外瞬时转染人脐静脉内皮细胞系EA.hy926细胞,通过实时荧光定量RT-PCR和Western blot分别检测mRNA和蛋白水平的表达。结果成功构建pIRES-VEGF165-tPA双基因真核表达载体,测序结果与预期相符;荧光计数显示体外瞬时转染人脐静脉内皮细胞系EA.hy926细胞的转染效率约为(15.6±3.1)%;实时荧光定量RT-PCR和Western blot证实转染pIRES-VEGF165-tPA质粒组细胞在mRNA和蛋白水平的表达均高于各对照组(均P<0.01)。结论成功构建pIRES-VEGF165-tPA双基因真核表达载体,并且实现其在人脐静脉内皮细胞系EA.hy926细胞中的表达,为进一步探索其在机械瓣膜抗凝方面的作用奠定了基础。     

转化生长因子β1对内皮细胞屏障功能的影响

目的观察转化生长因子β1（TGF-β1）对体外培养人脐静脉内皮细胞株EA.hy926屏障功能的影响并探讨其作用机制。方法体外培养EA.hy926脐静脉内皮细胞株,实验分为两组,对照组培养液中加入PBS;TGF-β1处理组培养液中添加0.01mg/L的TGF-β1。将细胞在多聚脂滤膜上培养,测量细胞跨上皮电阻（TER）的变化。免疫荧光检测两组血管内皮钙黏蛋白（VE-cadherin）、α-连环蛋白、血管内皮细胞生长因子（VEGF）和纤维连接蛋白的表达变化;RT-PCR检测两组VE-cadherin和VEGF表达的变化。结果TGF-β1处理后TER降低,两组处理前后TER差值比较有统计学意义（t=3.294,P〈0.01）;TGF-β1处理组VE-cadherin和α-连环蛋白表达减少,内皮细胞黏附连接被破坏;而VEGF和纤维连接蛋白表达增多,基底膜增厚。结论TGF-β1可引起内皮细胞屏障功能的破坏,其机制可能与VEGF的表达上调有关。     

人前列腺干细胞抗原基因PSCA的扩增及真核表达

目的：从人前列腺癌细胞系中扩增获得目的基因前列腺干细胞抗原（PSCA）,构建真核表达载体并进行真核表达。方法：从人前列腺癌细胞系LNCaP中扩增目的基因PSCA,构建真核表达质粒plRES-neo—PSCA-His,脂质体法转染小鼠黑色素瘤B16细胞,用RT—PCR及免疫荧光和流式细胞仪分别检测B16细胞中人PSCA基因的mRNA和蛋白表达。结果：得到372bp人PSCA目的基因片段,序列测定证实与GenBank上登录的序列一致。结论：成功构建pIRES—neo—PSCA—His质粒并验证其真核表达,为PSCA在前列腺癌免疫治疗研究中的应用奠定了基础。     

Construction of Porcine CCK pDNA and Its Expression in COS-7 Cells

CCK correlates with the generation and progression of pancreatic cancer. The research aims to construct eukaryotic expression plasmid pIRES2-EGFP/CCK (CCK pDNA) and transiently express it in COS-7 cells. Total RNA was extracted from porcine intestinal mucosa. RT-PCR was used to amplify the aimed segments CCKcDNA which was then digested with EcoR1 and BamH1 and inserted into a eukaryotic expression plasmid pIRES2-EGFP to construct CCK pDNA. The con- structed plasmid was transfected into COS-7 cells by lepofectamineTM2000-mediated transfer method. The expression of CCK in transfected COS-7 cells was detected 24, 48 and 72 h post-transfection with fluorescence microscopy and the expression level of CCK mRNA in transfected COS-7 cells was assayed by using RT-PCR. The results showed CCK pDNA was successfully constructed and expressed transiently in COS-7 cells. Green fluorescent protein could be detected in the COS-7 cells transfected with porcine CCK pDNA 24 h post-transfection. At 48th h post-transfection, the number of positive cells was increased significantly and much brighter green fluorescence could be detected. And 72 h post-transfection, the green fluorescence of positive cells became even stronger, while no green fluorescence was detected in the control group. The expression of CCK mRNA in the cells was detectable by using RT-PCR. In COS-7 cells transfected with CCK pDNA a high level of porcine CCK mRNA was detected while no expression of porcine CCKmRNA was found in the cells trans- fected with null plasmid. It was concluded CCK pDNA was expressed successfully in COS-7 cells, which lays a foundation for further research on the relationship between CCK and tumor.     

人caspase-1真核表达载体的构建及表达

目的构建人caspase-1真核表达载体,观察其在人肝癌细胞HepG2中的表达。方法分离人外周血淋巴细胞,LPS刺激提取细胞总RNA,RT-PCR方法分别扩增caspase-1两片段S1、S2,利用重叠延伸PCR方法（SOE）获得caspase-1全长序列,将其克隆入pIRES2-EGFP载体,进行菌落PCR、限制性酶谱分析、DNA序列测定。通过jetPEI方法转染HepG2肝癌细胞,倒置相差荧光显微镜下观察其表达情况,RT-PCR分析caspase-1的表达水平。结果份外周淋巴细胞中经RT-PCR分别扩增出365bp和883bp片段,纯化后的PCR产物通过SOE扩增得到一1234bp的条带,与预期序列长度一致。SOE产物与pIRES2-EGFP经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后连接,菌落PCR鉴定获得数个阳性克隆,质粒经EcoRⅠ和BamHⅠ限制性酶谱分析酶解出1234bp条带,DNA序列分析证实重组载体中的DNA序列与GenBank中人caspase-1序列完全一致。将该载体转染至HepG2细胞中,经RT-PCR证实,与转染pIRES2-EGFP空载体的对照组细胞相比,caspase-1水平明显升高。结论本研究成功构建人caspase-1表达载体pIRES2-EGFP-caspase-1,该载体能够在人肝癌细胞中高效表达外源基因。     

基于同源重组和反向PCR扩增技术构建BRD7溴区结构域缺失突变体

目的：利用同源重组和反向PCR扩增技术构建溴区包含蛋白7 (bromodomain-containing protein 7,BRD7)的溴区结构域(bromodomain)缺失的真核表达载体。方法：设计一对反向PCR引物,以预先构建好的pIRES2-EGFP-3Flag/BRD7质粒为模板,利用高保真酶的高保真性和较长的延伸能力,反向扩增出BRD7溴区结构域缺失突变体(pIRES2-EGFP-3Flag/BRD7△brd)的线性DNA片段,然后转化大肠杆菌,利用大肠杆菌同源重组修复能力即可自身环化,而不需要经连接酶连接或其他处理即可得到pIRES2-EGFP-3Flag/BRD7△brd重组表达质粒,通过测序和Western印迹进一步对该缺失突变体的序列和蛋白质表达性能进行验证。结果：通过酶切鉴定、测序和Western印迹证实pIRES2-EGFP-3Flag/BRD7△brd构建成功。结论：利用PCR反向扩增和同源重组技术,可以简便快速地构建pIRES2-EGFP-3Flag/BRD7△brd突变体,实验成本较低,并且发现质粒模板浓度会影响载体的同源重组效率,这种改进的技术可广泛应用到基因突变体的构建。     

Notch 1 对舌麟状细胞癌Tca8113细胞表皮生长因子受体表达的影响及其意义

目的：将编码Notch 1胞內域（NICD）转染人舌麟状细胞癌（舌麟癌）Tca8113细胞,探讨Notch 1在Tca8113细胞中的作用及其对表皮生长因子受体（EGFR）表达的影响。方法：采用脂质体法将编码NICD的pRAMIC-IRES2-EGFP目的质粒和pIRES2-EGFP对照质粒分别转染人舌麟癌Tca8113细胞,实验分为目的质粒pRAMIC-IRES2-EGFP转染组、对照质粒pIRES2-EGFP转染组和非转染组。采用RT-PCR法、Western blotting法和免疫细胞化学法观察细胞中Notch 1mRNA及蛋白和EGFR mRNA及蛋白表达水平,MTT法检测Tca8113细胞的增殖活性并计算细胞存活率。结果：转染后,与非转染组和对照质粒pIRES2-EGFP转染组比较,pRAMIC-IRES2-EGFP目的质粒转染组Notch 1 mRNA和蛋白表达水平明显升高（P<0.05）,而EGFR mRNA和蛋白表达水平明显降低（P<0.05）,细胞存活率明显降低（P<0.05）。与非转染组比较,对照质粒pIRES2-EGFR转染组Notch 1 mRNA和蛋白表达水平、EGFR mRNA和蛋白表达水平及细胞存活率差异无统计学意义（P>0.05）。结论：Notch 1对舌麟癌Tca8113细胞增殖的影响可能与EGFR的表达下调有关。     

一种新的荧光示踪的钠离子-葡萄糖协同转运蛋白2活性测定方法的建立

目的：建立一种新的荧光标记的钠离子-葡萄糖协同转运蛋白2（sodium-glucose cotransporter 2,SGLT2）葡萄糖转运的测定方法。方法：合成人全长SGLT2 cDNA,构建pIRES2-EGFP-SGLT2重组质粒,酶切鉴定并测序验证其构建的正确性。瞬时转染HEK293细胞后,构建SGLT2高表达细胞株;采用激光共聚焦扫描显微镜、流式细胞仪检测其转染效率及转录活性,Western Blot 法检测目的蛋白SGLT2表达情况。以荧光标记的脱氧葡萄糖2-NBDG作为示踪剂,应用流式细胞术检测SGLT2对葡萄糖的转运活性。 结果：构建的pIRES2-EGFP-SGLT2质粒经酶切鉴定、测序证明质粒构建正确。该质粒转染HEK293细胞后,与未转染组相比,转染组细胞绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）表达明显增加（P<0.01）。与空载体pIRES2-EGFP转染组相比,重组质粒转染组SGLT2蛋白表达明显增加（P<0.05）;而未转染组与空载体转染组SGLT2蛋白表达无明显差异。SGLT2转运试验结果显示,转染组细胞对2-NBDG的钠离子依赖性摄取率较未转染组明显升高（P<0.01）。结论：成功构建并应用SGLT2真核表达质粒,建立了一种新的荧光示踪的SGLT2葡萄糖转运活性的测定方法。     

pIRES2-EGFP-hVEGF165真核表达载体的构建及在心肌细胞内的表达

目的：构建plRES2-EGFP-hVEGF165真核表达质粒并在心肌细胞内表达．方法：应用限制性内切酶将目的片段VEGFl65克隆入含有增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因的真核表达质粒plRES2-EGFP中．转染心肌细胞后，应用荧光显微镜检测EGFP的表达，以免疫组化法检测血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在体及离体表达．结果：构建了真核共表达载体plRES2-EGFP-hVEGF165．转染心肌细胞后，荧光显微镜观察可见EGFP的表达，免疫组化染色证实细胞内有VEGF的表达．结论：外源性hVEGF165基因可在心肌细胞内稳定表达．     

CSF2A融合基因真核表达载体的构建及其对EBV+肿瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的: 构建爱泼斯坦-巴尔(EB)病毒(EBV)潜伏膜蛋白2A(LMP2A)基因与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)融合基因(CSF2A)重组真核表达载体,探讨CSF2A融合蛋白对EBV阳性(EBV⁺)肿瘤细胞增殖和凋亡的影响。方法: 根据重叠延伸原理,将LMP2A与GM-CSF在编码(Gly4Ser)3多肽的DNA基因片段连接下进行重组。采用DNA重组技术将融合基因片段连接于pIRES2-eGFP真核表达载体上,行酶切电泳分析和DNA测序鉴定重组质粒。设pIRES2-CSF2A重组质粒转染组为实验组,pIRES2-LMP2A质粒转染组和pIRES2-eGFP空质粒转染组为对照组,分别转染树突状细胞(DC)。采用RT-PCR和Western blotting法检测细胞中CSF2A基因和蛋白表达;MTT和Hochest法检测各组EBV⁺肿瘤细胞增殖抑制率和细胞凋亡形态学。结果: 酶切实验和序列测定,CSF2A融合基因正确插入pIRES2-eGFP质粒,并成功获得重组真核表达载体pIRES2-CSF2A。转染pIRES2-CSF2A至DC后,检测到CSF2A蛋白的表达。MTT法检测,pIRES2-CSF2A质粒转染组细胞增殖抑制率高于对照组(P<0.05或P<0.01),且呈时间依赖性;Hochest检测,细胞出现凋亡形态学改变并产生凋亡小体。pIRES2-CSF2A质粒转染组作用于EBV⁺肿瘤细胞48h时凋亡细胞明显增多。结论: 重组真核表达载体pIRES2-CSF2A可有效转染DC,并明显抑制EBV⁺CNE2细胞增殖且促进其凋亡。     

人B7-H4基因转染细胞株的构建及其对T细胞的作用

目的克隆人B7-H4基因,构建人B7-H4基因转染细胞株并初步研究其对T细胞的作用。方法通过RT-PCR的方法获得人B7-H4分子的基因,将目的片段双酶切(EcoRⅠ和BamHⅠ)后与pIRES2-EGFP真核表达载体连接,构建重组真核表达载体pIRES2-EGFP-B7-H4并进行鉴定;脂质体转染法将重组载体导入L929细胞,经G418加压筛选并通过流式细胞术和RT-PCR检测表达载体是否转入L929细胞中,通过检测活化T细胞上CD25,CD69的表达及T细胞增殖实验对B7-H4转基因细胞的生物学功能进行初步研究。结果从外周血活化单核细胞中扩增出目的基因,构建重组表达载体pIRES2-EGFP-B7-H4并将其转染至L929细胞,构建了一株稳定表达人B7-H4分子的基因转染细胞株,对其生物学功能的研究显示B7-H4分子可以下调活化T细胞上CD25,CD69的表达,并且对T细胞的活化增殖起到抑制作用(P<0.05)。结论成功构建了稳定表达B7-H4分子的基因转染细胞株,为进一步研制B7-H4分子的单克隆抗体提供了有效的免疫原。     

加强型黄色荧光蛋白和VEGF双基因载体在肝细胞共转染表达

【目的】构建携带加强型黄色荧光素蛋白 (EYFP)和人类血管内皮生长因子 (VEGF)的双基因真核表达载体pIRES EYFP/VEGF12 1,用EYFP作标记基因 ,研究外源性VEGF12 1基因在大鼠原代培养肝细胞转染表达 ,为实时监测VEGF12 1基因修饰肝细胞移植后状态提供基础。【方法】将 pcDNA3VEGF12 1中VEGF12 1定向克隆到 pIRES EYFP ,构建重组质粒 pIRES EYFP/VEGF12 1,经酶切、PCR扩增和部分DNA序列分析证实后 ,转染大鼠原代培养肝细胞 ,用荧光显微镜等观察转染表达。【结果】酶切、PCR扩增和部分DNA序列分析等证明pIRES EYFP/VEGF12 1质粒成功构建 ,转染大鼠原代培养肝细胞后 ,可以通过荧光显微镜观察到黄绿色荧光。【结论】构建了 pIRES EYFP/VEGF12 1质粒 ,为实时监测外源性VEGF12 1基因转染表达和VEGF基因修饰肝细胞的基因治疗奠定基础。