异硫氰酸苄酯诱导脑胶质瘤U-87MG细胞凋亡及其机制的研究

目的探讨异硫氰酸苄酯(benzyl Isothiocyanate,BITC)对人脑胶质瘤细胞系U-87 MG凋亡的诱导作用及其机制。方法 BITC作用U-87 MG细胞后,应用MTS法检测BITC对肿瘤细胞生长的影响,应用流式细胞术检测BITC对肿瘤细胞凋亡的作用和肿瘤细胞内活性氧(ROS)含量的变化,Western blot法检测细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Survivin、caspase-3和caspase-8的变化,RT-PCR检测Bcl-2和Survivin基因的mRNA表达,最后检测信号转导分子JNK和转录因子AP-1转录活性的变化。结果 BITC对脑胶质瘤细胞U-87 MG具有明显的抑制作用,其IC 150值为15.2μmol·L-,流式细胞术检测显示10和20μmol·L-1的BITC作用24 h后凋亡率分别为29.3%和68.6%(P<0.05),2和5μmol·L-1BITC作用肿瘤细胞24h后,ROS产生分别为对照组的3.76倍和6.07倍(P<0.05),促凋亡蛋白caspase-3和caspase-8表达上调,抑制凋亡蛋白Bcl-2和Survivin表达下调,Bcl-2 mRNA表达分别是对照组的32.7%和19.2%(P<0.05),Survivin mRNA表达分别是对照组的41.3%和22.7%(P<0.05),JNK磷酸化水平上调,AP-1转录活性分别是对照组的42.5%和26.7%(P<0.05)。结论 BITC可抑制脑肿瘤细胞U-87 MG的生长,可能与细胞氧化损伤和调节细胞内的凋亡相关转录因子和信号通路有关。     

异硫氰酸苄酯对脑胶质瘤U-87 MG细胞活性氧的诱导作用及其机制研究

目的 探讨异硫氰酸苄酯(benzyl isothiocyanate,BITC)对人脑胶质瘤细胞系U-87 MG的活性氧(ROS)的诱导作用及其机制。方法 应用MTS法检测BITC对肿瘤细胞生长的影响,2和5 μmol·L^?1 BITC作用U-87 MG细胞后,应用流式细胞术检测肿瘤细胞内活性氧(ROS)含量的变化,生化法检测GSH以及氧化应激相关的线粒体呼吸链复合体Ⅲ、过氧化物歧化酶(SOD)和醌还原酶(quinone reductase,QR)的活性变化,Western blotting法和报告基因技术检测p38-MAPK和相关转录因子ARE的转录活性变化。结果 BITC对脑胶质瘤细胞U-87 MG具有明显的抑制作用,其IC50值为15.2 μmol·L^?1,2和5 μmol·L^?1 BITC作用肿瘤细胞24 h后,ROS产生分别为对照组的376.3%和607.5%(P<0.05),GSH水平分别为对照组的71.3%和44.9%(P<0.05),SOD活性分别为对照组的63.5%和21.8%(P<0.05),QR活性分别为对照组的55.2%和26.7%(P<0.05),呼吸链复合体III活性分别为对照组的48.5%和37.6%(P<0.05),p38-MAPK的磷酸化水平显著上升,ARE的转录活性分别为对照组的141.1%和215.2%(P<0.05)。结论 BITC可诱导脑肿瘤细胞U-87 MG中ROS产生,可能与调节胞内的氧化应激相关基因表达有关。     

三氧化二砷复合物抑制人脑胶质瘤U87细胞生长的机制研究

目的 研究三氧化二砷复合物对人脑胶质瘤U87细胞凋亡的影响,并进一步探讨其作用机制。方法 采用激光共聚焦技术研究三氧化二砷各复合物进入细胞的方式;采用细胞划痕愈合试验观察其对U87细胞迁移能力的影响;采用血管形成试验观察其对新生血管形成能力的影响;流式细胞仪检测各组细胞周期及细胞凋亡;免疫蛋白印迹法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和caspase-3的表达情况。结果 三氧化二砷复合物主要通过内吞方式进入细胞,能显著抑制U87细胞的迁移以及新生血管的形成;其可诱导U87细胞周期阻滞于G2/M期,促进细胞发生凋亡;三氧化二砷复合物促进Bax和caspase-3的表达,抑制Bcl-2的表达。结论 三氧化二砷复合物对U87细胞的抑制作用机制可能是通过内吞方式进入细胞后,上调Bax的表达,下调Bcl-2的表达,最终诱导细胞发生凋亡。     

顺铂诱导脑胶质瘤U87细胞的PD-L1表达及耐药机制的研究

目的 研究PD-L1的表达对U87细胞的顺铂(cisplatin,CDDP)耐药性的影响。方法 建立U87对CDDP耐药细胞株(U87/CDDP),用不同浓度的CDDP处理24 h后,CCK-8检测U87/CDDP细胞活力以验证耐药性。成功建立U87/CDDP细胞株后转染PD-L1 shRNA,用CCK-8、BrdU染色、流式细胞仪检测U87/CDDP细胞的增殖和凋亡。并分别用qRT-PCR检测PD-L1、Bax、caspase-3、Survivin mRNA的表达,Western blotting检测PD-L1、Bax、caspase-3、cleaved-caspase-3和P53蛋白的表达。结果CCK-8结果表明,U87/CDDP细胞成功建立。用相同浓度的CDDP处理24 h后,转染PD-L1 shRNA的U87/CDDP细胞的细胞增殖率比未转染的U87/CDDP细胞低,细胞凋亡率高。同时,与对照组细胞相比,在转染PD-L1 shRNA并给予CDDP处理的U87/CDDP细胞中,Bax、caspase-3 mRNA和Bax、cleaved-caspase-3和P53蛋白的表达显著增加,PD-L1、Survivin mRNA和PD-L1蛋白的表达显著降低。结论 通过抑制U87细胞中PD-L1的表达可以逆转脑胶质瘤U87细胞对CDDP的耐药性。     

苦参碱对神经胶质瘤U87细胞增殖和侵袭的抑制作用研究

目的研究苦参碱对神经胶质瘤U87细胞增殖和侵袭的影响,探讨其作用机制。方法采用MTT法和Transwell侵袭实验分别检测苦参碱对U87细胞的增殖能力和侵袭能力。采用Western blotting法和qPCR法检测苦参碱对U87细胞的COX2蛋白和mRNA表达情况。结果药物作用24 h时,与对照组比较,随着苦参碱浓度(5、50、100μg/mL)的增加,苦参碱对U87细胞生长的抑制率不断地增加;相同浓度下,苦参碱对U87细胞增殖率在24、48、72 h时逐渐出现显著性差异(P0.05)。对照组通过的细胞数量明显多于苦参碱100μg/mL组,两组比较差异具有统计学意义(P0.01)。与对照组比较,随着苦参碱浓度的增加,COX-2的蛋白和mRNA表达水平明显降低,差异有统计学意义(P0.05、0.01)。结论苦参碱通过降低COX-2的蛋白和m RNA表达来抑制U87细胞的增殖和侵袭。     

稳定表达EGFRvIII的U87MG细胞株的建立与鉴定

目的:构建稳定表达表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)的U87MG细胞株。方法:采用电转染方法将pcD-NA4/TO-EGFRvⅢ质粒导入U87MG细胞,加入zeocin筛选,进一步将细胞有限稀释并克隆化培养以建立稳定的转染细胞株。应用RT-PCR、Western blot及细胞免疫荧光染色方法鉴定稳定表达EGFRvⅢ基因的细胞株。结果:经RT-PCR鉴定发现V6号和V24号单克隆细胞株EGFRvⅢ基因mRNA水平高表达,进一步Western blot及细胞免疫荧光染色方法鉴定发现V6号细胞株EGFRvⅢ蛋白水平高表达。结论:成功建立了稳定表达EGFRvⅢ的U87MG细胞株,为进一步的抗肿瘤治疗及其机制研究提供基础。     

人U87-MG脑胶质瘤细胞裸鼠原位移植模型的建立

目的应用不同数量U87-MG细胞接种裸鼠脑内,建立裸鼠脑胶质瘤模型,观察其生长特性。方法采用立体定向技术,分别将3.0×10~(10)·L~(-1)、4.0×10~(10)·L~(-1)、5.0×10~(10)·L~(-1)浓度的人脑胶质瘤细胞U87-MG单细胞悬液,接种于18只♂裸鼠的右侧尾状核区,每只接种体积为5μL,另取6只裸鼠作为对照,接种同体积Hanks液。观察不同接种量实验鼠的生存状态、成瘤情况及脏器转移灶、带瘤生存期,测量肿瘤的最大径,计算肿瘤体积,将获取的全脑标本制作病理切片,行HE染色和免疫组化检查。结果各接种量的实验组成瘤率均为100%,未见颅外转移病灶,3组裸鼠的平均生存时间分别为(46.50±3.27)d、(38.50±3.28)d、(30.67±3.51)d;病理学检查符合人脑胶质瘤细胞的形态学特征和免疫表型;免疫组化GFAP和S-100蛋白呈阳性表达。结论立体定向脑内定量注射U87-MG细胞制备的人脑胶质瘤裸鼠原位移植模型成瘤率高、颅内生长稳定、颅外远隔部位转移率低,与人脑胶质瘤病理学及形态学特征相似,能为研究胶质瘤的发生、发病机制、生物学特性以及探寻有效的治疗措施提供可靠的动物模型。     

U87胶质瘤细胞p53基因全场cDNA克隆及序列分析

目的克隆U87胶质瘤细胞p53基因编码序列,并对其序列进行分析。方法根据NCBI GenBank中p53 cDNA序列设计引物,利用RT-PCR技术从U87胶质瘤细胞总RNA中对p53基因编码序列进行克隆;并通过DNAMAN软件将克隆序列与NCBI GenBank中序列进行比对,分析U87细胞中p53基因编码序列特点。结果经测序验证,成功克隆了p53基因编码序列,通过序列比对发现U87细胞中p53基因72位密码子为精氨酸残基。结论成功克隆了U87细胞中p53基因编码序列,分析发现U87细胞中p53基因表达产生的是72位密码子为含精氨酸残基的p53野生型蛋白,为进一步研究U87细胞中p53基因功能特性及其与胶质瘤的相关性奠定了基础。     

数字全息显微镜观察哇巴因对人胶质瘤U87-MG细胞的影响

目的　应用数字全息显微镜观察哇巴因（ouabain）对人胶质瘤U87-MG 细胞的影响。方法　不同浓度ouabain（0.05、0.5、2.5、25 μM）干预U87-MG 细胞,24 h 后使用光学显微镜观察细胞形态学改变,MTT 法检测细胞活力,数字全息显微镜观察ouabain 作用后细胞的动态变化和运动能力改变。结果　与Control 组比较,ouabain 明显减低细胞活力［0.05 μM（75.92±3.21）%,0.5μM（49.61±3.95）%,2.5 μM（42.74±3.21）%,25 μM（32.86±2.00）% vs. Contro（l 100±0.01）%;P<0.01］,减少细胞数量［0.05 μM（170.7±4.7）,0.5 μM（162.3±4.4）,2.5 μM（142.0±2.6）,25 μM（110.3±1.2）vs. Contro（l 193.7±2.6）;P<0.05或P<0.01］,并降低细胞运动能力［0.05 μM（809.0±19.8）μm,0.5 μM（626.9±23.5）μm,2.5 μM（476.7±22.9）μm,25 μM（386.5±19.6）μm vs. Control（ 959.7±18.9）μm;P<0.01］,且呈浓度依赖性。结论　ouabain可抑制人胶质瘤U87-MG细胞的生长、降低肿瘤细胞运动能力并最终引起细胞死亡,数字全息显微镜可起到良好的评价作用。     

小白菊内酯对U-87 MG细胞增殖和凋亡的影响及其机制研究

目的考察小白菊内酯对于人脑恶性胶质瘤细胞U-87 MG细胞系的增殖、细胞周期及凋亡的影响,并探讨其作用机制.方法采用CCK-8比色法和克隆形成检测法检测小白菊内酯对U-87 MG的增殖抑制作用;采用碘化丙啶(PI)染色后的流式细胞仪检测小白菊内酯处理前后对细胞周期、凋亡的影响;采用qPCR以及Western blotting法研究药物处理后U-87 MG细胞的Caspase 3、Bax、Cyclin D1的表达变化以及P53-Ser392蛋白质磷酸化激活.结果小白菊内酯可明显抑制U-87 MG的细胞增殖、克隆形成数量及克隆大小.处理48 h后,U-87 MG细胞的S期、G2/M期受到了阻滞,G0/G1期细胞比例明显减少,同时细胞的凋亡也明显增多.Caspase 3、Bax基因的mRNA及蛋白表达明显上升,而Cyclin D1基因的mRNA表达明显下降.同时P53-Ser392残基的磷酸化水平也明显上升.结论 小白菊内酯可通过调节P53基因的Ser392残基磷酸化抑制其下游的细胞凋亡、细胞周期途径上Caspase 3、Bax、Cyclin D1的基因表达,影响细胞周期及凋亡,从而抑制肿瘤细胞的增殖.     

小白菊内酯对U-87 MG迁移、侵袭的影响及其机制研究

目的研究小白菊内酯对恶性人脑胶质瘤细胞系U-87 MG细胞迁移、侵袭的抑制作用,并探讨其作用机制。方法采用CCK-8比色检测法筛选小白菊内酯处理细胞的IC50浓度;采用细胞划痕实验观察小白菊内酯处理0、12、48 h后U-87 MG细胞的迁移情况,并且测量48 h后迁移的距离;采用Transwell实验观察穿膜细胞数,判断细胞的侵袭能力;并采用q PCR以及Western blotting法研究了小白菊内酯处理后,U-87 MG细胞的SNAIL、E-Cadherin的表达变化,以及GSK3β-Ser9蛋白质磷酸化变化。结果 CCK-8比色检测法筛选的小白菊内酯IC50浓度为39μmol/L。与对照组比较,在小白菊内酯处理48 h后,U-87 MG细胞迁移的距离和穿膜细胞数都明显减少,且与浓度呈正相关(P0.01);与对照组比较,小白菊内酯处理的U-87 MG细胞内SNAIL基因表达下降,同时E-Cadherin表达上调,且表达差异明显(P0.05);GSK3β-Ser9残基磷酸化水平下降。结论小白菊内酯能够抑制U-87 MG细胞的迁移、侵袭,可能是通过下调GSK3β磷酸化从而抑制了SNAIL蛋白表达入核,从而促进了E-Cadherin蛋白的表达而引起的。     

Bcl-2 and Bcl-xL in Peroxide-Resistant A549 and U87MG Cells

Overexpression of the bcl-2 and the related bcl-x_L protoonco-geneproteins enhance cell survival by inhibiting apoptosis inducedby many agents including oxidants. Whether these proteins contributeto survival in oxidant-resistant cells is not known. The currentstudy assessed the expression of bcl-2 and bcl-x_L proteins inhuman glioblastoma U87MG cells and human lung adenocar-cinomaA549 cells selected for resistance to 0, 50, 100, 200, and 400µM H₂O₂ by exposure to this oxidant one time each passagefor 9 months. When examined 7 to 32 days after cessation ofperoxide exposure (times when peroxide resistance was maintained),bcl-2 protein levels were significantly increased in most peroxide-resistantU87MG cells. However, the increase was not dose dependent andwas not accompanied by an increase in mRNA levels. A549 cellsdid not express significant levels of bcl-2 protein, althoughbcl-2 mRNA was detectable. A549 cells expressed large amountsof bcl-x_L and immunohistochemistry demonstrated extensive localizationof this protein around the nucleus. However, expression of thisprotein was not altered in peroxide-resistant lines nor wasbcl-2 protein increased to a measurable level. U87MG cells alsoexpressed bcl-x_L but it was not altered in peroxide-resistantcells. Although the increased bcl-2 protein in peroxide-resistantU87MG cells may contribute to their oxidant tolerance, the lackof a dose-response relationship, the failure to induce bcl-x_Lprotein, and the absence of any bcl-2 or bcl-x_L protein inductionin peroxide-resistant A549 cells suggest these genes are notprimary factors in oxidant resistance.     

葛根素对人骨肿瘤细胞株 MG63 的增殖抑制和诱导凋亡作用

目的 探讨葛根素对人骨肉瘤细胞株MG63的作用及其机制。方法 取对数生长期的MG63细胞分别用不同浓度的葛根素处理(0,25,50,100 mmol·L^-1)。细胞培养48 h后,利用MTT检测MG63细胞增殖水平;流式细胞术检测细胞凋亡水平,RT-PCR检测PI3K、AKT、Bax、Bcl-2、p53 和 p21 mRNA水平。Western blotting 检测PI3K、AKT、Bax、 Bcl-2、p53和p21表达水平。结果 葛根素浓度依赖性的诱导MG63细胞增殖抑制、凋亡和 Bax 表达,减少PI3K、AKT、Bcl-2、p53和p21表达。结论 葛根素可通过抑制PI3K/AKT/p53信号通路而诱导MG63细胞增殖抑制和凋亡。     

Desmethylanhydroicaritin isolated from Sophora flavescens,shows antitumor activities in U87MG cells via inhibiting the proliferation,migration and invasion

This study is the first report of the antitumor activities of desmethylanhydroicaritin (DMAI) isolated from Sophora flavescens on U87MG cells. Human glioblastoma is one of the most aggressive malignant type of brain tumors and highly diffuses to around normal brain tissues. DMAI showed anti-proliferation effects on U87MG cells at the concentration of 30 μM, however did not affect to HEK-293 cells. DMAI induced anti-proliferation effects via ERK/MAPK, PI3 K/Akt/mTOR signal pathway and G2/M phase cell cycle arrest. DMAI led to morphological change and inhibition of filapodia formation through regulation of Rac 1 and Cdc 42. In addition, migration and invasion of U87MG cells were inhibited by DMAI via down-regulation of matrix metalloproteinase (MMP) −2 and MMP −9 expressions and activities. Our results suggest that DMAI has a potential as a therapeutic agent against glioblastoma cells.     

格列卫诱导癌蛋白半乳凝集素-3通过溶酶体降解并促进胶质母细胞瘤U87细胞的凋亡

目的 探讨格列卫诱导胶质母细胞瘤细胞株U87细胞凋亡及其促进癌蛋白半乳凝集素-3（Gal-3）降解的分子机制.方法 利用细胞免疫染色法和提取细胞溶酶体的方法观察格列卫处理细胞后溶酶体中Gal-3蛋白量的变化;U87细胞分别用格列卫和/或STS及溶酶体抑制剂ConA处理后,用Western blot方法检测细胞中Gal-3蛋白量的改变;SubG1法检测U87细胞在格列卫及STS单药处理和联合处理时各组细胞凋亡率.结果 格列卫处理U87细胞使Gal-3蛋白进入溶酶体并发生蛋白的降解;格列卫能够诱导U87细胞发生凋亡,与STS联合使用有协同诱导U87细胞凋亡的作用.结论 格列卫能够诱导U87细胞株中Gal-3通过溶酶体降解,并使肿瘤细胞对凋亡诱导剂的敏感性增加.     

携带凋亡素基因的重组腺病毒对人肺鳞癌细胞SK-MES-1、人肺腺癌细胞NCI-H1299凋亡的影响

目的:研究携带凋亡素基因VP3的重组腺病毒载体Adxsi-GFP-VP3对人肺鳞癌细胞SK-MES-1、人肺腺癌细胞NCI-H1299的凋亡的影响。方法:取对数生长期SK-MES-1、NCI-H1299细胞,各分为重组腺病毒(Adxsi-GFP-VP3)组、空病毒(Adxsi-GFP)组和细胞对照(磷酸盐缓冲液)组,依次记为A、B、C组。采用逆转录-聚合酶链反应和Western blot法检测A、B组细胞转染48、72 h的VP3 mRNA和Apoptin表达情况,透射电镜观察A组细胞转染72 h的超微结构变化。采用MTT法检测3组细胞转染24、48、72、96 h的细胞增殖活性;流式细胞术检测细胞转染后24、48、72 h的凋亡率及细胞周期变化。结果:与B组比较,A组SK-MES-1、NCI-H1299细胞转染48 h后有VP3 mRNA表达,转染72 h后有Apoptin表达。A组转染72 h后SK-MES-1、NCI-H1299细胞均出现细胞凋亡的超微结构改变。与B、C组比较,A组SK-MES-1、NCI-H1299细胞增殖活性降低、细胞凋亡率增加,且与转染时间呈正相关;转染72 h S期的SK-MES-1、NCI-H1299细胞比例降低、G2/M期细胞比例增加。以上差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:Adxsi-GFP-VP3能有效诱导SK-MES-1、NCI-H1299细胞凋亡。