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日本血吸虫菲律宾株26kDa抗原的表达、纯化与应用 总被引:1,自引:0,他引:1
利用亲和层析和Western-blot等分子生物学技术,表达、纯化、鉴定了重组日本血吸虫菲律宾株26kDa抗原(rSjp26GST),并比较了其与日本血吸虫大陆株26kDa抗原(rSjc26GST)基因cDNA序列的异同,分析了其应用前景。分别以质粒pGEX和血吸虫大陆株总RNA为模板,经PCR或逆转录PCR(RT-PCR)扩增出的Sjp26GST和Sjc26GSTcDNA,其片段长度均为654bp。通过双脱氧测序结果显示两者碱基排列顺序相同。用大肠杆菌(E.coli)表达载体在E.coli中高效表达Sjp26GST,rSjp26GST占菌体总蛋白的25%。用谷胱甘肽(GSH)亲和层析柱一步纯化法,得到纯品Sjp26GST,将其作为靶抗原用Western-blot检测血吸虫大陆株感染者和感染小鼠血清及用Sjc26GST免疫的小鼠血清,反应均为阳性。本研究提示Sjp26GST与Sjc26GST在DNA序列、氨基酸顺序和抗原性等方面高度同源,Sjp26GST在研制日本血吸虫疫苗方面具有一定应用价值 相似文献
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以重组质粒pSj26为模板,PCR扩增出编码26kDa谷胱甘肽S-转移酶(Sj26GST)的cDNA,双酶切后克隆到pBV220DNA,构建pBV220-Sj26温控表达载体,CaCl2法转化大肠杆菌DH5α,氨苄青霉素筛选转化子,酶切图谱分析及PCR鉴定阳性克隆。阳性克隆菌在30℃培养,42℃温控表达Sj26。测定表达产物GST活性,并用rSj26抗原免疫的鼠血清及日本血吸虫感染鼠血清进行Dot 相似文献
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日本血吸虫26kDa谷胱甘肽S-转移酶基因真核表达载体的构建及序列测定 总被引:4,自引:0,他引:4
目的 扩增日本血吸虫26kDa谷胱甘肽S-转移酶(Sj26GST)基因片段,构建其重组真核表达载体,以研制SjGST核酸疫苗。方法 根据已知基因序列设计一对引物,运用RT-PCR技术扩增Sj26GST目的基因片段,将其克隆到pcDNA3质粒中,并经酶切、PCR鉴定,测序证实。结果 获得GST-pcDNA3重组克隆。结论:本实验获得Sj26GST重组克隆,为进一步研制核酸疫苗创造了条件。 相似文献
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日本血吸虫基因工程BCG多价疫苗的研究 总被引:3,自引:0,他引:3
用日本血吸虫(Sj)成虫提取的总RNA逆转录合成cDNA第一链,并设计合成引物,经PCR扩增,扩增出26kDa的编码区基因,并进行了测序,结果表明Sj中国大陆株(SjC)、Sj菲律滨株(SjP)26kDa GST基因核苷酸同源性99.8%。然后,构建了大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒PBCG-Sj26Ⅰ ̄Ⅳ。再将其依次分别转化大肠杆菌、耻垢分枝杆菌和BCG中,筛选出重组耻垢分枝杆菌疫苗和重组BCG多 相似文献
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日本血吸虫疫苗候选分子的基因克隆,表达及特性鉴定 总被引:1,自引:0,他引:1
本研究用日本血吸虫(Sj)成虫原抗原免疫的兔血清从日本血清吸虫中国大陆株成虫cDNA库筛选出Sj22.6基因克隆;用根据曼氏血吸虫23kDa膜抗原(Sm23(的编码基因设计的引物,以PCR法从日本血吸虫成虫cDNA库扩增出Sj23基因;用根据日本血吸虫菲律宾株的磷酸丙糖异构酶(SjTPI)基因设计的引物,以RT-PCR从日本血吸虫中国大陆株成虫mRNA扩增出SjTPI基因;并测得了上述3个基因的核 相似文献
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日本血吸虫成虫26kD谷胱甘肽S-转移酶是成虫代谢过程中一个关键酶。为研究制备日本血吸虫重组疫苗,根据日本血吸虫菲律宾株成虫Sj26kDGST完整编码区序列设计引物,以日本血吸虫中国大陆株成虫26kDGSTmRNA模板,采用逆转 聚合酶链反应技术,扩增了其26kDGST完整编码区cDNA将cDNA重组于pBluescriptSK质粒上,转化大肠杆菌,重组体经限制酶解图谱鉴定,用双脱氧链末端终止法对 相似文献
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日本血吸虫26kDa谷胱甘肽S—转移酶DNA疫苗的研究及其保 … 总被引:11,自引:0,他引:11
本文对大陆株日本血吸虫26kDa谷胱甘肽S-转移酶(Sj26GST)的DNA疫苗进行研究,并观察了其免疫保护效果。分别构建含Sj26GST基因的重组质粒pCD-Sj26和pBK-Sj26,采用脂质体介导的基因转移将pCD-Sj26和pBK-Sj26分别导入NIH3T3成纤维细胞,用免疫荧光法(IFA)证实Sj26GST在真核细胞中的表达。分别将pCD-Sj26和pBK-Sj26及pBK-CMV肌注 相似文献
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日本血吸虫 26 kDa 谷胱甘肽S-转移酶DNA疫苗的研究及其保护性免疫效果观察 总被引:13,自引:1,他引:13
本文对大陆株日本血吸虫26kDa谷胱甘肽S-转移酶(Sj26GST)的DNA疫苗进行研究,并观察了其免疫保护效果。分别构建含Sj26GST基因的重组质粒pCD-Sj26和pBK-Sj26,采用脂质体介导的基因转移将pCD-Sj26和pBK-Sj26分别导入NIH3T3成纤维细胞,用免疫荧光法(IFA)证实Sj26GST在真核细胞中的表达。分别将pCD-Sj26和pBK-Sj26及pBK-CMV肌注BALB/c小鼠。免疫3次后,免疫鼠产生一定水平的抗血吸虫抗体。用日本血吸虫尾蚴攻击感染免疫小鼠,结果pCD-Sj26和pBK-Sj26免疫鼠减虫率分别为37.19%和44.44%,肝组织减卵率为73.80%和47.20%,每对成虫产卵减少56.88%和15.67%。实验结果表明,日本血吸虫Sj26DNA疫苗免疫小鼠后能诱生一定水平的抗血吸虫抗体,免疫鼠可形成一定水平的保护性免疫力,预防血吸虫尾蚴感染。同时可减轻宿主肝组织血吸虫卵所致的病理损害作用 相似文献
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日本血吸虫(中国大陆株基因工程疫苗的研究) 总被引:1,自引:0,他引:1
本文报道应用PCR技术或RT-PCR技术从日本血吸虫成虫cDNA文库或成虫mRNA中扩增到Sj28GST、C-Sj- paramyosin、H-Sj23、Sj14、sJ22.6和Sj.TP16个编码日本血吸虫中国大陆株抗原的基因,并把它们克隆入适合载体中,在大肠杆菌系统和蚕核型多角体病毒(BmNPV)系统中进行表达。免疫学检测证明这6种基因重组抗原都具有较好的抗原性。我们进一步应用4种比较成熟的基 相似文献
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目的 了解重组的日本血吸虫中国大陆株脂肪酸结合蛋白(rSj-FABPc)的特性及预测其抗原表位。方法 以PCR方法从Sj-cDNA文库中扩增Sj-FABPc基因片段,并亚克隆于载体pGEM-T,对其核苷酸序列进行测定。以GOLDKEY软件和Swiss-Model数据库分析Sj-FABPc的核苷酸序列和其编码的蛋白质特性,预测重组抗原的表位。结果 核酸序列分析证明,克隆基因确为Sj-FABPc,并由 相似文献
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重组日本血吸虫中国大陆株磷酸丙糖异构酶蛋白质表达、纯化及特性分析 总被引:6,自引:0,他引:6
磷酸丙糖异构酶(TPI)是已被公认的血吸虫病疫苗候选分子之一,本研究将日本血吸虫中国大陆株TPI分子基因DNA片段定向克隆到表达载体pGEX-4T-3(编码26kDa的GST蛋白)中,构建重组表达质粒,然后转化大肠杆菌BL21感受态细胞,阳性克隆用IPTG诱导,阳性菌株可表达分子量约55kDa的融合蛋白(GST-TPI),此融合蛋白可与GlutathioneSepharose4B结合成复合物,用凝血酶切割融合蛋白复合物,获得分子量约28kDa的重组表达TPI分子。重组TPI分子具有磷酸丙糖异构酶活性,并能被日本血吸虫重感染兔血清,血吸虫病人血清所识别。重组TPI免疫家兔产生抗体的效价最高可达1∶25600,该血清抗体能识别日本血吸虫中国大陆株成虫抗原中分子量约28kDa的蛋白条带。 相似文献
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目的探讨日本血吸虫中国大陆株26kDa基因重组蛋白对宿主肝虫卵肉芽肿形成的影响。方法将 ICR雄性小鼠分成 2组,1组经 rSjc26GST免疫,另 1组为对照。免疫结束后第 5天,2组小鼠均感染日本血吸虫尾蚴 40条±1条/鼠,于 6周后剖杀,取肝组织进行观察。结果免疫组与对照组肝表面虫卵结节数分别为5.69±1.19和20.47±1.83,前者比后者减少72.20%;肝肉芽肿平均直径免疫组为 140.00 μm±38.24 μm,与对照组245.72 μm±32.73 μm相比,减少43.02%;同时免疫组小鼠体内特异性抗rSjc26GST抗体水平明显高于对照组。结论rSjc26GST对日本血吸虫具有明显的抗病效果。 相似文献
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日本血吸虫26 kDa基因重组蛋白免疫小鼠抗体内血吸虫生殖的作用 总被引:9,自引:0,他引:9
目的:探讨日本血吸虫26kDa基因重组蛋白(rSjc26GST)抗日本血吸虫生殖作用及其免疫机制。方法:小鼠经rSjc26GST免疫,攻击感染日本血吸虫尾蚴40±1条,于6wk后解剖检虫体,计算虫数与肝组织和脾组织内的虫卵数,并对虫体主要生殖器官作透射电镜超微结构的观察。结果:证明rSjc26GST具有明确的抗生殖免疫作用。与对照组相比,免疫鼠减虫率为30.0%,肝组织和脾组织内虫卵减少率分别为57.1%与79.9%,透射电镜观察显示免疫鼠体内雌虫的卵黄腺及雄虫的睾丸组织均产生不同程度的抑制作用,主要表现为卵黄细胞胞质中卵黄球、卵黄滴、脂滴和睾丸组织中精细胞、支持细胞胞质中的脂滴数量均有明显减少。结论:rSjc26GST有抗日本血吸虫生殖的作用,使虫体生殖器官受到损害 相似文献
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血吸虫成虫31/32kDa蛋白除具有公认的免疫学诊断价值外,作为疫苗抗原的候选分子也有潜在价值[1]。我们对编码大陆株日本血吸虫32kDa天冬酰胺肽链酶(Sj32)进行了克隆、测序鉴定、构建真核表达载体,并在小鼠骨骼肌细胞得到表达,为该抗原的DNA疫苗研究打下了基础。 材料与方法Sj32cDNA的克隆、鉴定日本血吸虫成虫RNA的分离纯化,cDNA合成等参见文献[2]。根据文献[3]报道的核苷酸序列,设计并合成引物,P1:5CTCGGATCCAAGAGAAATAATGTTTTATTC3P… 相似文献
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日本血吸虫(中国大陆株)FABPc重组抗原高效融合表达,纯化及 … 总被引:1,自引:1,他引:0
目的 构建Sj-FABPc表达克隆,获得大量纯化rSj-FABPc重组(日本血吸虫脂肪酸结合蛋白)抗原,了解其作为侯选疫苗抗原的潜能。方法 以PCR法从Sj-cDNA库中扩增出目的基因片段后亚克隆入表达载体pGEX-6P-1进行融合表达,经Glutathione Sepharose ^TM 4B亲和层析柱和PreScission^TM Protease酶切后纯化出rSj-FABPc,Western 相似文献
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日本血吸虫重组抗原基因的高效表达和特性鉴定 总被引:3,自引:3,他引:3
为了获得有效的保护性抗原分子,我们对已构建的日本血吸虫成虫cDNA库的免疫筛选中所获得的阳性克隆λSj514的。DNA插入片段进行PCR扩增,扩增产物亚克隆入高表达载体pGEX-1λt,得到高效表达克隆pGSj24。经诱导表达生产出约20kDa的分离表达产物,该特异性蛋白可被日本血吸虫免疫血清、感染兔血清和病人血清特异地识别,而且具有较强的免疫原性,可刺激动物产生较强的抗体反应。 相似文献
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日本血吸虫(中国大陆株)22.6kDa重组抗原对小鼠免疫保护性的?… 总被引:1,自引:2,他引:1
为研究日本血吸虫22.6kDa抗原的免疫保护性。方法:将其编码cDNA经PCR扩增后亚克隆入载体重粒pGEX-1λt进行表达,并重组抗原免疫了一批昆明鼠。结论:证明重组的日本血吸虫22.6kDa抗原可诱导宿主抗血吸虫感染的部分保护力。 相似文献
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日本血吸虫谷胱甘肽-S-转移酶基因和产毒大肠杆菌纤毛抗原基因的联合表达 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:编码日本血吸虫26kDaGST和产毒大肠杆菌纤毛抗原K99基因的联合表达。方法:PCR扩增的K99基因克隆入pUC18载体,再将限制性酶切获得的GST基因克隆入pUC18-K99重组质粒。限制性酶切和琼脂糖凝胶电泳选择连接方向正确的重组质粒用于重组蛋白的表达。共表达产物采用SDS-PAGE、Westernblotting、反向IHA、ELISA和透视电镜观察进行分析鉴定。结果:共表达产物的分子量约50kDa,存在于宿主菌体表面的纤毛中,GST抗血清和K99抗血清均可识别共表达产物,提示共表达产物既有GST表位,又有K99抗原表位。结论:日本血吸虫26kDaGST和产毒大肠杆菌K99基因共表达获得成功。 相似文献
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金标抗rSjc26GST多克隆抗体斑点免疫金渗滤法检测?… 总被引:5,自引:1,他引:4
目的 探索一种简捷的检查血吸虫循环抗原的方法。方法 应用抗日本血吸虫重组谷胱甘肽-S-转移酶(rSjc26GST)的多克隆抗体标记胶体金,建立检测日本血吸虫病患者血清循环抗原的双抗体夹心斑点免疫金渗滤法(S-DIGFA),并以S-ELISA作对比。结果 用S-DIGFA和S-ELISA平行检测95例慢性血吸虫病患者,阳性检出率分别为81.05%和82.11%;正常人血清180份,两者的假阳性率分别 相似文献
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裸露DNA疫苗pCDSJ32的构建,鉴定及在小鼠骨骼肌细胞的表达 总被引:10,自引:1,他引:10
应用基因工程技术,对本室已经克隆的日本血吸虫成虫32kDa蛋白分子的cDNA片段进行了PCR扩增,扩增产物亚克隆入高效真核表达载体pCD,构建成功裸露DNA疫苗pCDSj32。pCDSj32在BALB/c小鼠骨骼肌细胞得到表达。表达产物可被小鼠抗32kDa蛋白分子单抗识别。 相似文献