日本血吸虫菲律宾株26kDa抗原的表达、纯化与应用

利用亲和层析和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ等分子生物学技术，表达、纯化、鉴定了重组日本血吸虫菲律宾株２６ｋＤａ抗原（ｒＳｊｐ２６ＧＳＴ），并比较了其与日本血吸虫大陆株２６ｋＤａ抗原（ｒＳｊｃ２６ＧＳＴ）基因ｃＤＮＡ序列的异同，分析了其应用前景。分别以质粒ｐＧＥＸ和血吸虫大陆株总ＲＮＡ为模板，经ＰＣＲ或逆转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增出的Ｓｊｐ２６ＧＳＴ和Ｓｊｃ２６ＧＳＴｃＤＮＡ，其片段长度均为６５４ｂｐ。通过双脱氧测序结果显示两者碱基排列顺序相同。用大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）表达载体在Ｅ．ｃｏｌｉ中高效表达Ｓｊｐ２６ＧＳＴ，ｒＳｊｐ２６ＧＳＴ占菌体总蛋白的２５％。用谷胱甘肽（ＧＳＨ）亲和层析柱一步纯化法，得到纯品Ｓｊｐ２６ＧＳＴ，将其作为靶抗原用Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测血吸虫大陆株感染者和感染小鼠血清及用Ｓｊｃ２６ＧＳＴ免疫的小鼠血清，反应均为阳性。本研究提示Ｓｊｐ２６ＧＳＴ与Ｓｊｃ２６ＧＳＴ在ＤＮＡ序列、氨基酸顺序和抗原性等方面高度同源，Ｓｊｐ２６ＧＳＴ在研制日本血吸虫疫苗方面具有一定应用价值     

日本血吸虫26kDa谷胱甘肽S—转移酶在大肠杆菌的温控高？…

以重组质粒ｐＳｊ２６为模板，ＰＣＲ扩增出编码２６ｋＤａ谷胱甘肽Ｓ－转移酶（Ｓｊ２６ＧＳＴ）的ｃＤＮＡ，双酶切后克隆到ｐＢＶ２２０ＤＮＡ，构建ｐＢＶ２２０－Ｓｊ２６温控表达载体，ＣａＣｌ２法转化大肠杆菌ＤＨ５α，氨苄青霉素筛选转化子，酶切图谱分析及ＰＣＲ鉴定阳性克隆。阳性克隆菌在３０℃培养，４２℃温控表达Ｓｊ２６。测定表达产物ＧＳＴ活性，并用ｒＳｊ２６抗原免疫的鼠血清及日本血吸虫感染鼠血清进行Ｄｏｔ     

日本血吸虫26kDa谷胱甘肽S-转移酶基因真核表达载体的构建及序列测定

目的 扩增日本血吸虫２６ｋＤａ谷胱甘肽Ｓ－转移酶（Ｓｊ２６ＧＳＴ）基因片段，构建其重组真核表达载体，以研制ＳｊＧＳＴ核酸疫苗。方法 根据已知基因序列设计一对引物，运用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增Ｓｊ２６ＧＳＴ目的基因片段，将其克隆到ｐｃＤＮＡ３质粒中，并经酶切、ＰＣＲ鉴定，测序证实。结果 获得ＧＳＴ－ｐｃＤＮＡ３重组克隆。结论：本实验获得Ｓｊ２６ＧＳＴ重组克隆，为进一步研制核酸疫苗创造了条件。     

日本血吸虫基因工程BCG多价疫苗的研究

用日本血吸虫（Ｓｊ）成虫提取的总ＲＮＡ逆转录合成ｃＤＮＡ第一链，并设计合成引物，经ＰＣＲ扩增，扩增出２６ｋＤａ的编码区基因，并进行了测序，结果表明Ｓｊ中国大陆株（ＳｊＣ）、Ｓｊ菲律滨株（ＳｊＰ）２６ｋＤａ ＧＳＴ基因核苷酸同源性９９．８％。然后，构建了大肠杆菌－分枝杆菌穿梭表达质粒ＰＢＣＧ－Ｓｊ２６Ⅰ￣Ⅳ。再将其依次分别转化大肠杆菌、耻垢分枝杆菌和ＢＣＧ中，筛选出重组耻垢分枝杆菌疫苗和重组ＢＣＧ多     

日本血吸虫疫苗候选分子的基因克隆,表达及特性鉴定

本研究用日本血吸虫（Ｓｊ）成虫原抗原免疫的兔血清从日本血清吸虫中国大陆株成虫ｃＤＮＡ库筛选出Ｓｊ２２．６基因克隆；用根据曼氏血吸虫２３ｋＤａ膜抗原（Ｓｍ２３（的编码基因设计的引物，以ＰＣＲ法从日本血吸虫成虫ｃＤＮＡ库扩增出Ｓｊ２３基因；用根据日本血吸虫菲律宾株的磷酸丙糖异构酶（ＳｊＴＰＩ）基因设计的引物，以ＲＴ－ＰＣＲ从日本血吸虫中国大陆株成虫ｍＲＮＡ扩增出ＳｊＴＰＩ基因；并测得了上述３个基因的核     

日本血吸虫中国大陆株成虫谷胱甘肽S—转移酶cDNA克隆及其核苷酸？…

日本血吸虫成虫２６ｋＤ谷胱甘肽Ｓ－转移酶是成虫代谢过程中一个关键酶。为研究制备日本血吸虫重组疫苗，根据日本血吸虫菲律宾株成虫Ｓｊ２６ｋＤＧＳＴ完整编码区序列设计引物，以日本血吸虫中国大陆株成虫２６ｋＤＧＳＴｍＲＮＡ模板，采用逆转 聚合酶链反应技术，扩增了其２６ｋＤＧＳＴ完整编码区ｃＤＮＡ将ｃＤＮＡ重组于ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ质粒上，转化大肠杆菌，重组体经限制酶解图谱鉴定，用双脱氧链末端终止法对     

日本血吸虫26kDa谷胱甘肽S—转移酶DNA疫苗的研究及其保 …

本文对大陆株日本血吸虫２６ｋＤａ谷胱甘肽Ｓ－转移酶（Ｓｊ２６ＧＳＴ）的ＤＮＡ疫苗进行研究，并观察了其免疫保护效果。分别构建含Ｓｊ２６ＧＳＴ基因的重组质粒ｐＣＤ－Ｓｊ２６和ｐＢＫ－Ｓｊ２６，采用脂质体介导的基因转移将ｐＣＤ－Ｓｊ２６和ｐＢＫ－Ｓｊ２６分别导入ＮＩＨ３Ｔ３成纤维细胞，用免疫荧光法（ＩＦＡ）证实Ｓｊ２６ＧＳＴ在真核细胞中的表达。分别将ｐＣＤ－Ｓｊ２６和ｐＢＫ－Ｓｊ２６及ｐＢＫ－ＣＭＶ肌注     

日本血吸虫 26 kDa 谷胱甘肽S-转移酶DNA疫苗的研究及其保护性免疫效果观察

本文对大陆株日本血吸虫２６ｋＤａ谷胱甘肽Ｓ－转移酶（Ｓｊ２６ＧＳＴ）的ＤＮＡ疫苗进行研究，并观察了其免疫保护效果。分别构建含Ｓｊ２６ＧＳＴ基因的重组质粒ｐＣＤ－Ｓｊ２６和ｐＢＫ－Ｓｊ２６，采用脂质体介导的基因转移将ｐＣＤ－Ｓｊ２６和ｐＢＫ－Ｓｊ２６分别导入ＮＩＨ３Ｔ３成纤维细胞，用免疫荧光法（ＩＦＡ）证实Ｓｊ２６ＧＳＴ在真核细胞中的表达。分别将ｐＣＤ－Ｓｊ２６和ｐＢＫ－Ｓｊ２６及ｐＢＫ－ＣＭＶ肌注ＢＡＬＢ／ｃ小鼠。免疫３次后，免疫鼠产生一定水平的抗血吸虫抗体。用日本血吸虫尾蚴攻击感染免疫小鼠，结果ｐＣＤ－Ｓｊ２６和ｐＢＫ－Ｓｊ２６免疫鼠减虫率分别为３７．１９％和４４．４４％，肝组织减卵率为７３．８０％和４７．２０％，每对成虫产卵减少５６．８８％和１５．６７％。实验结果表明，日本血吸虫Ｓｊ２６ＤＮＡ疫苗免疫小鼠后能诱生一定水平的抗血吸虫抗体，免疫鼠可形成一定水平的保护性免疫力，预防血吸虫尾蚴感染。同时可减轻宿主肝组织血吸虫卵所致的病理损害作用     

日本血吸虫（中国大陆株基因工程疫苗的研究）

本文报道应用ＰＣＲ技术或ＲＴ－ＰＣＲ技术从日本血吸虫成虫ｃＤＮＡ文库或成虫ｍＲＮＡ中扩增到Ｓｊ２８ＧＳＴ、Ｃ－Ｓｊ－ ｐａｒａｍｙｏｓｉｎ、Ｈ－Ｓｊ２３、Ｓｊ１４、ｓＪ２２．６和Ｓｊ．ＴＰ１６个编码日本血吸虫中国大陆株抗原的基因，并把它们克隆入适合载体中，在大肠杆菌系统和蚕核型多角体病毒（ＢｍＮＰＶ）系统中进行表达。免疫学检测证明这６种基因重组抗原都具有较好的抗原性。我们进一步应用４种比较成熟的基     

日本血吸虫中国大陆株重组脂肪酸结合蛋白(sj-FABPc)的特性和抗原表位的分析

目的 了解重组的日本血吸虫中国大陆株脂肪酸结合蛋白（ｒＳｊ－ＦＡＢＰｃ）的特性及预测其抗原表位。方法 以ＰＣＲ方法从Ｓｊ－ｃＤＮＡ文库中扩增Ｓｊ－ＦＡＢＰｃ基因片段,并亚克隆于载体ｐＧＥＭ－Ｔ,对其核苷酸序列进行测定。以ＧＯＬＤＫＥＹ软件和Ｓｗｉｓｓ－Ｍｏｄｅｌ数据库分析Ｓｊ－ＦＡＢＰｃ的核苷酸序列和其编码的蛋白质特性,预测重组抗原的表位。结果 核酸序列分析证明,克隆基因确为Ｓｊ－ＦＡＢＰｃ,并由     

重组日本血吸虫中国大陆株磷酸丙糖异构酶蛋白质表达、纯化及特性分析

磷酸丙糖异构酶（ＴＰＩ）是已被公认的血吸虫病疫苗候选分子之一,本研究将日本血吸虫中国大陆株ＴＰＩ分子基因ＤＮＡ片段定向克隆到表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－３（编码２６ｋＤａ的ＧＳＴ蛋白）中,构建重组表达质粒,然后转化大肠杆菌ＢＬ２１感受态细胞,阳性克隆用ＩＰＴＧ诱导,阳性菌株可表达分子量约５５ｋＤａ的融合蛋白（ＧＳＴ－ＴＰＩ）,此融合蛋白可与ＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅＳｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ结合成复合物,用凝血酶切割融合蛋白复合物,获得分子量约２８ｋＤａ的重组表达ＴＰＩ分子。重组ＴＰＩ分子具有磷酸丙糖异构酶活性,并能被日本血吸虫重感染兔血清,血吸虫病人血清所识别。重组ＴＰＩ免疫家兔产生抗体的效价最高可达１∶２５６００,该血清抗体能识别日本血吸虫中国大陆株成虫抗原中分子量约２８ｋＤａ的蛋白条带。     

日本血吸虫中国大陆株 26kDa基因重组蛋白(rSjc26GST)对宿主肝肉芽肿形成的影响

目的探讨日本血吸虫中国大陆株２６ｋＤａ基因重组蛋白对宿主肝虫卵肉芽肿形成的影响。方法将 ＩＣＲ雄性小鼠分成 ２组,１组经 ｒＳｊｃ２６ＧＳＴ免疫,另 １组为对照。免疫结束后第 ５天,２组小鼠均感染日本血吸虫尾蚴 ４０条±１条／鼠,于 ６周后剖杀,取肝组织进行观察。结果免疫组与对照组肝表面虫卵结节数分别为５．６９±１．１９和２０．４７±１．８３,前者比后者减少７２．２０％;肝肉芽肿平均直径免疫组为 １４０．００ μｍ±３８．２４ μｍ,与对照组２４５．７２ μｍ±３２．７３ μｍ相比,减少４３．０２％;同时免疫组小鼠体内特异性抗ｒＳｊｃ２６ＧＳＴ抗体水平明显高于对照组。结论ｒＳｊｃ２６ＧＳＴ对日本血吸虫具有明显的抗病效果。     

日本血吸虫26 kDa基因重组蛋白免疫小鼠抗体内血吸虫生殖的作用

目的：探讨日本血吸虫２６ｋＤａ基因重组蛋白（ｒＳｊｃ２６ＧＳＴ）抗日本血吸虫生殖作用及其免疫机制。方法：小鼠经ｒＳｊｃ２６ＧＳＴ免疫,攻击感染日本血吸虫尾蚴４０±１条,于６ｗｋ后解剖检虫体,计算虫数与肝组织和脾组织内的虫卵数,并对虫体主要生殖器官作透射电镜超微结构的观察。结果：证明ｒＳｊｃ２６ＧＳＴ具有明确的抗生殖免疫作用。与对照组相比,免疫鼠减虫率为３０．０％,肝组织和脾组织内虫卵减少率分别为５７．１％与７９．９％,透射电镜观察显示免疫鼠体内雌虫的卵黄腺及雄虫的睾丸组织均产生不同程度的抑制作用,主要表现为卵黄细胞胞质中卵黄球、卵黄滴、脂滴和睾丸组织中精细胞、支持细胞胞质中的脂滴数量均有明显减少。结论：ｒＳｊｃ２６ＧＳＴ有抗日本血吸虫生殖的作用,使虫体生殖器官受到损害     

编码大陆株日本血吸虫天冬酰胺肽链酶cDNA的克隆及其在BALB/c小鼠体内的表达

血吸虫成虫３１／３２ｋＤａ蛋白除具有公认的免疫学诊断价值外,作为疫苗抗原的候选分子也有潜在价值［１］。我们对编码大陆株日本血吸虫３２ｋＤａ天冬酰胺肽链酶（Ｓｊ３２）进行了克隆、测序鉴定、构建真核表达载体,并在小鼠骨骼肌细胞得到表达,为该抗原的ＤＮＡ疫苗研究打下了基础。　　材料与方法Ｓｊ３２ｃＤＮＡ的克隆、鉴定日本血吸虫成虫ＲＮＡ的分离纯化,ｃＤＮＡ合成等参见文献［２］。根据文献［３］报道的核苷酸序列,设计并合成引物,Ｐ１：５ＣＴＣＧＧＡＴＣＣＡＡＧＡＧＡＡＡＴＡＡＴＧＴＴＴＴＡＴＴＣ３Ｐ…     

日本血吸虫（中国大陆株）FABPc重组抗原高效融合表达,纯化及 …

目的 构建Ｓｊ－ＦＡＢＰｃ表达克隆,获得大量纯化ｒＳｊ－ＦＡＢＰｃ重组（日本血吸虫脂肪酸结合蛋白）抗原,了解其作为侯选疫苗抗原的潜能。方法 以ＰＣＲ法从Ｓｊ－ｃＤＮＡ库中扩增出目的基因片段后亚克隆入表达载体ｐＧＥＸ－６Ｐ－１进行融合表达,经Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＾ＴＭ ４Ｂ亲和层析柱和ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ＾ＴＭ Ｐｒｏｔｅａｓｅ酶切后纯化出ｒＳｊ－ＦＡＢＰｃ,Ｗｅｓｔｅｒｎ     

日本血吸虫重组抗原基因的高效表达和特性鉴定

为了获得有效的保护性抗原分子，我们对已构建的日本血吸虫成虫ｃＤＮＡ库的免疫筛选中所获得的阳性克隆λＳｊ５１４的。ＤＮＡ插入片段进行ＰＣＲ扩增，扩增产物亚克隆入高表达载体ｐＧＥＸ－１λｔ，得到高效表达克隆ｐＧＳｊ２４。经诱导表达生产出约２０ｋＤａ的分离表达产物，该特异性蛋白可被日本血吸虫免疫血清、感染兔血清和病人血清特异地识别，而且具有较强的免疫原性，可刺激动物产生较强的抗体反应。     

日本血吸虫（中国大陆株）22.6kDa重组抗原对小鼠免疫保护性的？…

为研究日本血吸虫２２．６ｋＤａ抗原的免疫保护性。方法：将其编码ｃＤＮＡ经ＰＣＲ扩增后亚克隆入载体重粒ｐＧＥＸ－１λｔ进行表达，并重组抗原免疫了一批昆明鼠。结论：证明重组的日本血吸虫２２．６ｋＤａ抗原可诱导宿主抗血吸虫感染的部分保护力。     

日本血吸虫谷胱甘肽-S-转移酶基因和产毒大肠杆菌纤毛抗原基因的联合表达

目的：编码日本血吸虫２６ｋＤａＧＳＴ和产毒大肠杆菌纤毛抗原Ｋ９９基因的联合表达。方法：ＰＣＲ扩增的Ｋ９９基因克隆入ｐＵＣ１８载体,再将限制性酶切获得的ＧＳＴ基因克隆入ｐＵＣ１８－Ｋ９９重组质粒。限制性酶切和琼脂糖凝胶电泳选择连接方向正确的重组质粒用于重组蛋白的表达。共表达产物采用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ、反向ＩＨＡ、ＥＬＩＳＡ和透视电镜观察进行分析鉴定。结果：共表达产物的分子量约５０ｋＤａ,存在于宿主菌体表面的纤毛中,ＧＳＴ抗血清和Ｋ９９抗血清均可识别共表达产物,提示共表达产物既有ＧＳＴ表位,又有Ｋ９９抗原表位。结论：日本血吸虫２６ｋＤａＧＳＴ和产毒大肠杆菌Ｋ９９基因共表达获得成功。     

金标抗rSjc26GST多克隆抗体斑点免疫金渗滤法检测？…

目的 探索一种简捷的检查血吸虫循环抗原的方法。方法 应用抗日本血吸虫重组谷胱甘肽－Ｓ－转移酶（ｒＳｊｃ２６ＧＳＴ）的多克隆抗体标记胶体金，建立检测日本血吸虫病患者血清循环抗原的双抗体夹心斑点免疫金渗滤法（Ｓ－ＤＩＧＦＡ），并以Ｓ－ＥＬＩＳＡ作对比。结果 用Ｓ－ＤＩＧＦＡ和Ｓ－ＥＬＩＳＡ平行检测９５例慢性血吸虫病患者，阳性检出率分别为８１．０５％和８２．１１％；正常人血清１８０份，两者的假阳性率分别     

裸露DNA疫苗pCDSJ32的构建,鉴定及在小鼠骨骼肌细胞的表达

应用基因工程技术，对本室已经克隆的日本血吸虫成虫３２ｋＤａ蛋白分子的ｃＤＮＡ片段进行了ＰＣＲ扩增，扩增产物亚克隆入高效真核表达载体ｐＣＤ，构建成功裸露ＤＮＡ疫苗ｐＣＤＳｊ３２。ｐＣＤＳｊ３２在ＢＡＬＢ／ｃ小鼠骨骼肌细胞得到表达。表达产物可被小鼠抗３２ｋＤａ蛋白分子单抗识别。