重组DNA技术及其在医学领域中的应用

重组DNA技术属于遗传工程分子水平的遗传操作,是一种按照人的意志定向改变生物遗传性状的技术。广义的遗传工程包括细胞水平的遗传操作(称为细胞工程)和分子水平的遗传操作(称为重组DNA技术)。狭义的遗传工程就是重组DNA技术。重组DNA技术,是在体外重新组合DNA分子(脱氧核糖核酸),并使其在适当的细胞中增殖的遗传操作,这种操作可将特定的基因组合到载体上,并使其在受体细胞中增殖和表达。因此,它不受亲缘关系限制,为分子遗传学和育种学以及医学遗传学研究开辟了崭新途径。1 重组DNA技术基本过程1.1 用人工方法取得或合成目的基因 基因是含特定遗传信息的核苷酸序列,是遗传物质的最小功能单位,基因可被分离出来。例如,从大肠杆菌中可将乳精发酵基因分离出来。先利用两种有差异的亲缘关系相近的温和噬菌体分别感染两类大肠杆菌,噬菌体的DNA可与大肠杆菌的染色体发生整合。整合位置恰好都在含乳糖发酵基因DNA片段,但方向相反,整合到大肠杆菌中的噬菌体DNA得到复制,用紫外线刺激大肠杆菌,使带乳糖发酵基因的噬菌体,DNA可以从大肠杆菌染色体中脱出,形成带乳糖发酵基因的噬菌体。两种亲缘关系相近的温和噬菌体,通过加热使其DNA片段双链分开,形成单链DNA。进一步将两种噬菌体DNA单链混合在     

动物线粒体基因重排

线粒体基因重排是否与重组有关一直存在争议,虽然在天然动物种群中从未明确发现重组的线粒体DNA单倍型,但多数动物却含有线粒体基因重组所需的酶,且在患者和雄性个体的肌肉组织中也常检测到低水平重排的线粒体DNA分子.因此重组对于线粒体DNA复制和修复可能是必须的.随着大规模基因组测序能力不断提高,基因结构比较作为分子系统学分析的工具已在越来越多的领域中得到应用,各分类阶元线粒体基因组结构的阐明已成为一种有效的系统发育信息的来源.线粒体基因重排机理的阐明对于人线粒体DNA相关疾病及动物的系统发育研究具有重要意义.     

人上皮细胞黏附分子shRNA表达载体的构建及鉴定

目的以人上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,Ep CAM)基因为靶基因,构建shRNA重组表达载体。方法根据Gen Bank中Ep CAM序列(BC014785.1)的mRNA设计4组shRNA序列,插入p SGU6/GFP/Neo载体,构建重组载体,转化至Top10感受态细胞,经卡那霉素筛选并挑取阳性克隆,进行PCR鉴定及DNA测序分析。结果 PCR鉴定及DNA测序结果显示重组载体Ep CAM-p SGU6/GFP/Neo-shRNA构建成功。结论成功构建了干扰人Ep CAM基因的重组表达载体,为研究Ep CAM分子的生物学功能打下基础。     

采用集合转化的方法构建HIV-1蛋白酶区和反转录酶区T-A克隆载体

DNA重组技术是将两个或多个单独的DNA片段连接起来产生一个能在特定宿主中自主复制的DNA分子。重组DNA分子最简单的构建方法是将基因片段克隆到质粒或噬菌体等克隆载体上。常用的质粒载体有pBR322、pUC和pGEM等。这些载体含有不同的多克隆位点,适于将含有不同酶切位点的DNA片段连接起来[1]。     

第十五届国际遗传学大会介绍

1983年12月12～21日在印度新德里召开了第十五届国际遗传学会议。3个大会发言的中心议题是遗传工程、生物技术学与其广泛应用以及遗传与社会。32个讨论会的专题是DNA复制和修复、重组DNA技术(两次)、生物化学与分子多态现象、神经遗传学、昆虫媒介遗传学,遗传重组、基因顺序与基因合成、植物和动     

DNA损伤修复基因与辐射损伤及肿瘤的相关性

DNA分子是生命体的遗传物质基础，也是辐射损伤的重要靶分子。细胞受到照射，DNA分子将产生多种类型的损伤，包括碱基错配、修饰、脱嘌呤或脱嘧啶位点形成、DNA单链、双链断裂以及DNA蛋白质交联等。如得不到及时有效修复，或发生错误修复。使损伤积累至一定程度就可导致疾病。然而，生物体内存在着DNA损伤修复系统，其中DNA损伤修复基因起着重要的作用。DNA损伤修复基因泛指那些编码产物在功能上参与DNA损伤识别和修复的基因；它们的编码产物包括DNA修复酶和参与DNA损伤识别及修复调节的一些元件。在它们的共同作用下，细胞主要通过碱基切除修复（BER）、核酸切除修复（NER）、错配修复（MMR）和重组修复（RR）等方式来修复DNA损伤。当然，一种DNA损伤可以通过多种修复途径来修复。一种修复途径也可以参与多种DNA损伤的处理。     

感受态细胞的制备

在基因重组过程中 ,当某一外源DNA与载体在体外连接成重组DNA分子后 ,一般不能凭自己的能力进入受体菌 ,而是需要帮助才能穿过细胞的内、外膜进入细胞内 ,随着受体菌的生长、增殖 ,重组DNA分子才得以复制、扩增。因此 ,在这一转化过程中 ,为获得大量的重组DNA分子 ,选择合适的受体菌后 ,应对其进行特殊处理 ,使之成为感受态细胞(CompetentCell) ,即具备接受外源DNA的能力。达到这种目的的方法有两类 :化学法和物理法。最初人们用简单的盐溶液鸡尾酒法洗涤大肠杆菌使其处于感受状态 ,DNA可以进入细胞。现在大多数细菌的转化方法都以…     

核化线粒体的进化加速作用与转基因人模型分析

生物分子钟的应用在当代生物研究领域具有十分重要的意义。然而，分子钟仅能用于粗略估计不同种群生物间的进化时程，间接表明进化可能不是或不仅仅是由于中性突变通过遗传渐变所造成；相反，染色体DNA与外源性DNA之间，以及染色体DNA相互之间的大量基因重组，则可能是推动进化进程的更大动力之一。鉴于人体内的线粒体DNA是一种外源性环状DNA，人类可认为是一种天然发生的整合了外源性线粒体DNA的转基因物种。本文引入转基因人分析法并应用这一方法探讨与人类进化过程相关的基因重组。通过对人、小鼠、大鼠进行核化线粒体组学分析，发现人类染色体基因组含有大量与线粒体DNA同源的核酸片段；人体基因组内核化线粒体基因在重组数与总碱基长度上均较小鼠和大鼠高出数倍。人体内大量存在的线粒体DNA介导的基因重组可能在促进人类进化中发挥了一定的作用。     

聚合酶链反应—单链构型多态性研究进展

随着DNA重组、核酸分子杂交、分子克隆和DNA序列测定等分子生物学技术的相继问世,生命科学也全面深入到探索基因结构和功能及相互关系作用方法,借以解释生命活动的规律,尤其在医学领域基因突变在人类疾病的作用得到空前重视,众多基因的突变与疾病的关系得到确定,尤为显著的是与遗传性和肿瘤性疾患相关的基因。因此,检测基因突变的工作已在基础及临床医学中得到广泛开展和应用。     

基因工程抗体的研究进展及临床应用

自从1975年,Kohler和Milstein发现的杂交瘤技术以来,单克隆抗体技术已被广泛地应用于疾病的诊断及治疗中.鼠杂交瘤是单克隆抗体的第一个可靠来源,但是临床反复应用会导致抗鼠免疫反应.临床上理想的抗体应该是完全人源化的,而人源单抗的生产在技术上难以克服融合率低、建株难、不稳定、产量低、人体不能随意免疫等问题.20世纪80年代中期,随着基因工程技术的发展以及抗体分子遗传学的深入研究,应用基因工程技术来改造现有优良的鼠单抗的基因,减少抗体中的鼠源成分,尽量保留原有抗体的特异性,此技术主要是将免疫球蛋白基因结构与功能同DNA重组技术有机结合起来,在基因的水平上将免疫球蛋白分子进行重组后导入转染细胞后表达,基因工程抗体是继多克隆抗体和单克隆抗体之后的第三代抗体.本文主要介绍基因工程抗体的进展情况及临床应用.     

遗传工程简介

<正> 遗传工程或基因工程,是在无细胞系统中,将不同的DNA片段(cDNA或基因DNA与载体DNA)连接成重组的DNA分子,然后将重组分子转入合适的宿主中,成为宿主基因组的一个整体份系或独立地在宿主细胞内进行复制。由此可知,遗传工程的核心是分子的无性繁殖。在自然界,遗传信息的交换一般只限于同种生物体之间。遗传工程技术的出现打破了遗传信息交换的壁障,能使不同种生物体之间甚至在高等生物与低等生物之间进行遗传信息的传递,因而可以按照人类的希望,在短期内定向地改变生物特性并创造新物种,以造福人类。基因工程是否可造成严重危害的争论曾     

生长激素基因片段三种克隆方法的比较

在探讨单纯性生长激素缺乏症发病机理的研究中，运用三种不同的DNA重组克隆技术对人生长激素基因片段进行克隆与分析，比较三种方法各自的优缺点，为DNA分子克隆选择较适合的方法。     

蛋氨酸酶基因重组腺病毒载体构建

目的构建蛋氨酸酶基因重组腺病毒载体.方法运用Cre-LoxP重组酶系统,通过DNA重组技术,将L-蛋氨酸-γ裂解酶基因(L-Methioneγ-Lyase Gene)与供体载体pDNR-CMV重组,获得含有Metase重组基因的供体载体pDNR-Metase-CMV.将pDNR-Metase-CMV片段与真核腺病毒载体PLP-Ade-X-CMV进行重组,获得pLP-Ade-Metase-CMV重组分子.结果获得了重组腺病毒载体pLP-Ade-Metase-CMV,并证实该重组腺病毒载体中有Metase Gene.结论采用LoxP/Cre体外重组法成功地构建了含蛋氨酸酶基因的真核表达重组腺病毒载体.     

染色质重塑基因ARID1A在妇科肿瘤中的研究进展

<正>在真核细胞中,遗传信息储存于染色质,这是一种由DNA、组蛋白及非组蛋白通过高度浓缩机制而形成的复杂结构,但在DNA复制、修复、重组及转录等过程中需动态变化以促使相关因子与DNA结合,这种作用称为染色质重塑。而染色质重塑包括DNA复制、转录、修复、甲基化和重组,对于细胞核活动至关重要,染色质重塑复合物的分子基因型改变是癌症发病的一个新机制。其中染色质重塑基因ARID1A在多种人类癌     

CD59基因的亚克隆

目的"构建pUC18-α珠蛋白DNA-CD59cDNA重组分子. 方法"采用人心肌组织作为RNA的来源,经RT-PCR扩增得到CD59基因的cDNA片段.以pUC18质粒为载体;人α-珠蛋白DNA为启动子,并提供polyA+尾巴;以编码全部CD59蛋白质的核苷酸序列的cDNA作为目标基因,三者拼接成重组分子. 结果"经酶切鉴定,重组分子拼接成功. 结论"该重组分子可作为转基因构件,经微注射输入供体动物受精卵细胞内,建立人CD59转基因动物模型.     

基因治疗与神经外科

20世纪后半叶被称为是生命科学的时代 ,这是由于随着 195 3年 DNA双螺旋结构的发现和 196 2年 DNA遗传密码的解译 ,致使分子生物学和基因工程学的技术有了革命性的进步 ,生命现象的本质逐步被探明。另一方面 ,随着疾病的病因和病理生理学在分子水平以及基因水平的解明 ,使得疾病的基因治疗被提上议事日程。其后随着以病毒载体为首的各种基因导入法的逐步开发 ,使基因治疗在临床应用中被注目。本文就基因治疗在神经外科领域的研究和发展经过以及目前取得的成果和对未来的展望作一综述。1　基因的发现与基因重组所谓基因就是不同长度的 DN…     

梅毒螺旋体0751基因的克隆、表达及鉴定

目的 构建梅毒螺旋体0751基因的原核表达质粒,诱导重组蛋白表达及进行免疫学鉴定.方法 以梅毒螺旋体基因组DNA为模板,PCR扩增梅毒螺旋体0751基因,构建其重组原核表达载体,并采用Western-blot方法初步鉴定该蛋白的特异性.结果 成功扩增出梅毒螺旋体0751基因,该基因在大肠杆菌表达系统中得到表达,并且特异性识别梅毒患者血清.结论 在大肠杆菌中成功表达梅毒螺旋体0751基因,为梅毒螺旋体的诊断提供了新的特异性抗原.     

HBV转录激活蛋白HBx、MHBs^178 MHBs^t155真核重组载体构建

目的 分别构建人乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白、羧基端截断的中分子表面蛋白MHBs^178、MHBs^t155编码基因的真核重组表达载体，以便进一步研究其转录激活功能及对宿主细胞信号传导通路的影响。方法 设计合成3对寡核苷酸引物，以adr亚型HBV质粒pHBV DNA为模板，采用PCR法分别扩增HBVX基因、MHBs^178和MHBs^t155编码基因片段；用HindⅢ，Kpn Ⅰ双酶切HBV X基因；用HindⅢ和Barn HⅠ双酶切MHBs^178与MHBs^t155编码基因片段后，分别定向插入到真核表达载体pcDNA3．1相应酶切位点，转化宿主菌JM109，提取质粒，分别用上述内切酶酶切及DNA测序鉴定重组质粒。结果 酶切重组体显示所切下的片段大小均与预计相符，测序结果与文献报道序列及预计结果一致。结论 成功构建了HBV X基因、羧基端截断的HBV中分子表面蛋白MHBs^178、MHBs^t155编码基因的真核重组表达载体，为进一步研究HBV转录激活蛋白HBx、MHBs^178 MHBs^t155对宿主细胞信号转导通路的影响奠定基础。     

新基因HA117最佳siRNA的筛选及重组腺病毒构建

目的 验证pSOS-HUS筛选目的 基因最佳siRNA的效果,应用pSOS-HUS筛选新基因HA117最佳siRNA,构建携带HA117基因最佳siRNA转录模板DNA的重组腺病毒.方法 构建携带HA117基因及其siRNA模板DNA链的双克隆质粒.把双克隆质粒分别转染293细胞,通过镜下观察、流式细胞仪检测比较绿色荧光表达强度,RT-PCR检测HA117基因mRNA表达,筛选鉴定基因HA117最佳siRNA.构建HA117基因RNA干扰重组腺病毒.结果 从5对模板DNA链中筛选出最有效片段HAi5,构建携带HAi5的重组腺病毒.结论 载体pSOS-HUS可快捷有效地筛选目的 基因的最佳siRNA;在5对模板DNA中,HAi5转录的siRNA对新基因HA117干扰效果最强;成功构建携带HAi5的重组腺病毒.     

重组质粒在原核细胞中的转化

基因重组技术中的转化是一个把DNA重组分子用人工的方法导入受体细胞的单元操作过程 ,无论在理论上还是在方式上与自然界中细菌的转化均有不同。它把重组体导入受体菌 ,并改变受体菌的遗传性状 ,常用的方法有Ca2 +诱导转化、PEG介导的原生质体转化、电穿孔法等。 1970年 ,Mandel和Higa发现CaCl2 处理过的大肠杆菌能吸收λ噬菌体DNA ,不久Cohen等人用同样的方法实现质粒DNA转化大肠杆菌〔1〕。 1983年 ,Hanahan使用DMSO(二甲基亚砜 )和DTT(二硫苏糖醇 )诱导产生感受态细胞 ,大大提高了大肠杆菌的转化效率〔2〕。转化过程中首先是D…