淋球菌膜抗原CppB基因的克隆及在大肠杆菌和减毒鼠伤寒沙门菌中的表达

将PCR扩增的淋球菌CppB膜蛋白基因区段,分别克隆在游离蛋白表达载体pKK223-3和融合蛋白表达载体pWR450-1上,以点杂交证实了克隆子。控制合适表达条件,在大肠杆菌中获高效表达,免疫印迹证实其可被淋病患者血清特异识别,将融合蛋白表达质粒转入减毒鼠伤寒沙门氏菌中也获表达,为淋病口服活疫苗的制备奠定了基础。     

淋球菌膜抗原CppB基因的克隆及在大肠杆菌和减霉鼠伤寒沙门菌中？…

将ＰＣＲ扩增的淋球菌ＣｐｐＢ膜蛋白的基因区段，分别克隆在游离蛋白表达载体ｐＫＫ２２３－３和融合蛋白表达载全ｐＷＲ４５０－１上，以点杂交证实了克隆子。控制合适表达条件，在大肠杆菌中获高效表达，免疫印迹证实其可被淋病患者血清特异识别，将融合蛋白表达质粒转入减毒鼠伤寒沙门氏菌中也获表达，为淋病口服活疫苗的制备奠定了基础。     

表达大肠杆菌LT—B抗原的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌株…

本文探讨了重组菌株Ｘ４０７２（ＰＭＧ２０７）的侵袭性。利用Ｈｅｌａ细胞观察Ｘ４０７２（ＰＭＧ２０７）对上皮细胞的粘附力和侵袭力。镜检法发现用Ｘ４０７２（ＰＭＧ２０７）感染细胞后有５０％细胞被感染；活菌计数法发现１０．５３％活菌进入细胞内在，在１小时即开始繁殖生长，４小时增殖约６．１倍。用Ｘ４０７２（ＰＭＧ２０７）径口感染ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，证明该菌株能侵袭肠系膜淋巴结及脾脏，心血及肝无侵袭。主要在肠     

表达GFP的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌体内感染抗原呈递细胞的动态变化

目的：阐明重组减毒鼠伤寒沙门氏菌在体内早期感染抗原呈递细胞(APC)的动态变化规律。方法：用一定剂量的表达绿色荧光蛋白(GFP)的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550(pY．AG-FP)口服接种BALB／c小鼠。3d后，取腹腔巨噬细胞培养24h，用荧光显微镜观察。另以该细菌静脉注射小鼠，于感染后3、6和12h，制备脾脏、肝脏低浮密度细胞。用流式细胞术检测巨噬细胞和树突状细胞的感染率。结果：巨噬细胞感染X4550(pYAGFP)的百分率，腹腔中约为50％，肝脏和脾脏中约为20％～40％。树突状细胞感染X4550(pYAGF、P)的百分率，脾脏中约为4％～10％，肝脏中约为10％～20％。巨噬细胞的吞噬能力明显高于树突状细胞。结论：感染早期，重组减毒鼠伤寒沙门氏菌在体内已被APC所摄取，为诱导有效的免疫应答提供了先决条件。     

甲肝减毒活疫苗口服免疫动物后的抗体反应

用PLAG微粒包裹甲肝减毒活疫苗制成微球口服免疫恒河猴及昆明种小鼠,用EIA法对HAV-IgM、HAV-IgG、HAV-IgA等抗体进行检测,以筛选一种方便易行的免疫途径。结果表明:恒河猴抗体应答于第3周出现,高峰期在5~6周,达1261mIU/mL,随后逐渐下降,口服加强免疫后,抗体回升,野毒株攻击后,抗体再度回升达1244mIU/mL。初次免疫HAV-IgM滴度为1∶4000,加强免疫后滴度为1∶1000,野毒株攻击后下降为1∶100。对照组仅在野毒株攻击后测到HAV-IgM。小鼠免疫2周后有HAV-IgG抗体产生,4周达高峰,S-IgA抗体1周开始测到,4周达高峰并持续两周后开始下降。微粒包裹疫苗免疫灵长类动物后所诱导产生的抗体应答,对野毒株攻击的保护效果明显。小鼠免疫结果与报道相似,但抗体反应出现的时间较免疫恒河猴的时间有所提前。     

携带 EGFPC3 质粒的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌在小鼠体内的表达

目的 构建重组减毒鼠伤寒沙门氏菌X8786/pEGFP-C3,检测增强型绿色荧光蛋白C3(EGFP-C3)在小鼠体内荧光表达.方法 将质粒pEGFP-C3电转化到减毒鼠伤寒沙门菌SL8786,构建重组减毒鼠伤寒沙门菌X8786(pEGFP-C3),分别灌胃饲服昆明种小鼠,流式细胞仪检测脾脏细胞荧光表达,利用荧光显微镜检测小鼠组织荧光表达.结果 在体外稳定试验中,重组菌经LB固体及液体培养基连续传15代后,单个菌落和菌液均呈绿色;流式细胞仪结果证实,体外情况下,减毒鼠伤寒沙门菌可以将pEGFP-C3转入小鼠腹腔灌洗巨噬细胞,并在其中表达.在体内稳定试验中,经昆明种小鼠连续传代10次,从肝脏、脾脏中分离的细菌经LB固体培养仍为绿色,证明构建的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌是稳定的.用免疫剂量的重组细菌接种昆明种小鼠后,观察1个月未见有异常现象,同时剖检后也未见脏器有眼观病变.免疫一定时间后,在小鼠肝脏、脾脏、肾脏、胸腺、十二指肠、肌肉等组织有荧光表达.结论 表达EGFP-C3的重组鼠伤寒沙门氏菌的成功构建为减毒沙门氏菌作为活载体的基因工程疫苗研制提供一个优良模型.     

表达幽门螺杆菌hpaA重组减毒鼠伤寒沙门氏菌的构建和鉴定

目的：构建表达幽门螺杆菌（H.pylori)hpaA的重组减毒鼠伤寒沙门低 疫苗菌。方法：用基因工程的方法将hpaA基因克隆入原核表达质粒pTrc99A,并进行了基因测序。重组质粒经鉴定后再导入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL3261,提取重组疫苗菌质粒,PCR和酶切鉴定,筛选阳性克隆。用SDS－PAGE电泳和Western blot进行HpaA表达和鉴定。结果：经PCR和酶切证实,构建了含hpaA的重组原核表达质粒pTrc99A-hpaA,并将后者成功转化了减毒鼠伤寒沙门氏菌。HpaA能在疫苗菌中以二聚体形式表达,HpaA量约占全菌体蛋白量的17％,Westem blot证实其有免疫原性。结论：构建了表达H.pylori hpaA的重组减毒鼠伤寒沙门氏疫苗菌,为探索制备H.pylori口服活疫苗尊定了基础。     

鼠伤寒沙门氏菌SOD不同途径免疫小鼠的效果观察

目的：观察用鼠伤寒沙门氏菌SOD作为抗原,由不同途径免疫小鼠的抗体产生情况。方法：Balb/c小鼠按免疫途径分为4组--腹腔注射、灌胃、滴鼻与肌注组,各组抗原量相同。于末次免疫后第10、15、20和30天采血,第30天时杀鼠取肠液,用间接ELISA法检测IgA及IgG效价。结果：黏膜外途径免疫小鼠以IgG应答为主;黏膜途径免疫则可建立较好的局部粘膜应答,其中滴鼻组还可引起较好的全身性应答。结论：小鼠可以通过黏膜免疫建立有效的抗鼠伤寒沙门氏菌SOD免疫力。     

恶性疟原虫抗原基因在鼠伤寒沙门氏菌中的表达及免疫原性的初步鉴定

将人工合成的恶性疟原虫杂合７４肽抗原基因克隆到表达载体ｐＷＲ４５０－１中，获得了重组质粒ｐＷＲＣ，将其先转化到减毒伤寒沙门氏菌ＬＢ５０００修饰后，再转化到ＳＬ３２６１，得到重组减毒鼠伤寒沙门氏菌ＳＬ３２６１（ｐＷＲＣ）。ｐＷＲＣ在ＳＬ３２６１中以β－半乳糖苷酶－杂合多肽抗原Ｃ融合蛋白（ＧＺ－Ｃ）形式表达，表达量约占菌体蛋白总量的１１．３％．Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ及免疫双扩散显示ＧＺ－Ｃ可与兔抗ＧＺ－Ｃ抗原的免疫血清发生特异反应。ＧＺ－Ｃ识别兔抗ＧＺ－Ｃ及鼠抗恶性疟原虫抗血清的ＥＬＩＳＡ滴度分别为１：３２００及１：５１２０。初步结果表明ＳＬ３２６１（ｐＷＲＣ）表达的ＧＺ－Ｃ具有抗原性。连续传代ＳＬ３２６１（ｐＷＲＣ）未见质粒ｐＷＲＣ丢失及对宿主有明显的毒性。     

人乳头瘤病毒HPV6b重组减毒沙门菌粘膜免疫的效果测定

为观察人乳头瘤病毒 6b型 (HPV6b )的重组减毒沙门菌载体疫苗粘膜免疫小鼠的免疫效果及探讨研制治疗尖锐湿疣的治疗性粘膜疫苗的机制 ,我们用构建的HPV6b重组减毒沙门菌粘膜免疫BALB/c小鼠 ,检测了阴道冲洗液中特异的SIgA、血清中IgG、T淋巴细胞增殖以及载体疫苗在机体内的稳定性。结果表明 ,粘膜免疫后 ,实验组与对照组相比较 ,阴道冲洗液中抗HPV6bL1的SIgA差异显著 ,实验组血清中抗HPV6bL1IgG水平低 ,T淋巴细胞增殖明显 ,疫苗在小鼠体内持续存在4 0d以上。研究结果提示我们所构建的重组减毒沙门菌粘膜免疫小鼠后 ,阴道粘膜局部能分泌特异的抗人乳头瘤病毒HPV6bSIgA ,也能激发细胞免疫 ,且此疫苗在小鼠体内能稳定存在。     

DNA疫苗的运送载体——减毒霍乱沙门氏菌

霍乱沙门氏菌是人兽共患病原菌,遗传背景清楚,利用它作为载体表达外源抗原基因已得到较广泛的研究并取得了一定的效果。本文从沙门氏菌的侵入途径、减毒重组菌对基因疫苗的呈递及诱发免疫应答的机制、作为载体的优势以及免疫存在的问题等方面就减毒霍乱沙门氏菌作为运送DNA疫苗的载体作简要概述。     

Cross-Protective Immune Responses Elicited by Live Attenuated Influenza Vaccines

The desired effect of vaccination is to elicit protective immune responses against infection with pathogenic agents. An inactivated influenza vaccine is able to induce the neutralizing antibodies directed primarily against two surface antigens, hemagglutinin and neuraminidase. These two antigens undergo frequent antigenic drift and hence necessitate the annual update of a new vaccine strain. Besides the antigenic drift, the unpredictable emergence of the pandemic influenza strain, as seen in the 2009 pandemic H1N1, underscores the development of a new influenza vaccine that elicits broadly protective immunity against the diverse influenza strains. Cold-adapted live attenuated influenza vaccines (CAIVs) are advocated as a more appropriate strategy for cross-protection than inactivated vaccines and extensive studies have been conducted to address the issues in animal models. Here, we briefly describe experimental and clinical evidence for cross-protection by the CAIVs against antigenically distant strains and discuss possible explanations for cross-protective immune responses afforded by CAIVs. Potential barriers to the achievement of a universal influenza vaccine are also discussed, which will provide useful guidelines for future research on designing an ideal influenza vaccine with broad protection without causing pathogenic effects such as autoimmunity or attrition of protective immunity against homologous infection.     

Effects of Killed and Live Attenuated Influenza Vaccine on Symptoms and Specific Airway Conductance in Asthmatics and Healthy Subjects

Killed and live influenza virus vaccines were given to asthmatics and healthy subjects to investigate symptoms and alterations in their respiratory performance after vaccination. Polyvalent killed influenza virus vaccine was given to 16 asthmatics and live attenuated influenza virus vaccine to 23 asthmatics and 21 healthy subjects. Fourteen of the 16 asthmatics vaccinated with the killed vaccine displayed a significant rise in serum antibody level as measured by a single radial haemolysis in gel (SRH test). 11 of the 23 asthmatics and 14 of the 21 healthy subjects vaccinated with the live attenuated vaccine displayed a significant rise in the SRH test. Among the subjects with no measurable initial antibodies and with a significant rise in the SRH test, one asthmatic vaccinated with the killed vaccine experienced symptoms of common cold with fever and dyspnoea 1 week after vaccination. Three asthmatics and four healthy subjects vaccinated with live attenuated vaccine experienced mild symptoms, mainly rhinorrhoea, cough and sore throat 2 to 3 days after vaccination. No alterations in specific airway conductance in asthmatics or in healthy subjects were observed. We conclude that both killed and live attenuated influenza virus vaccines are tolerated well by asthmatics and appear to be safe for asthma patients.     

表达鼠精子Cyritestin蛋白的减毒沙门氏菌疫苗株的构建及其鉴定

目的 构建表达鼠精子eyritestin蛋白的可口服减毒沙让氏菌活疫苗株。方法 应用质粒TAZ83／13，将之进行双酶切获得含有成熟cyritestin蛋白cDNA序列的酶切片段。将其插入表达载体yA3149中，构建重组质粒pCFL。将该重组质粒转入鼠沙门氏伤寒杆菌疫苗株X4632和X4550中，以获得重组菌株X4632（pCFL)和X4550（pCFL)。结果 该两种无抗药性的重组菌株在体外营养选择压力下，可较稳定地携带重组质粒传代繁殖。X4550(pCFL)在体内可较稳定地害居于Peyer‘s结，肠系膜淋巴结和脾脏；X4632（pCFL)可较稳定地定居于Peyer‘s结。二者均可表达被抗cyritestin单抗（mAb)识别的重组cyritestin蛋白。口服该疫苗菌株无明显的毒性作用。结论 X4632（pCFL),X4550（pCFL)疫苗株的构建，为研究以cyritestin为靶抗原的精子抗原避孕疫苗打下了基础。     

表达胃癌MG7-Ag模拟表位的减毒鼠伤寒杆菌疫苗的研制和初步鉴定

目的 研制可表达胃癌MG7－Ag模拟表位的减毒鼠伤寒杆菌疫苗。方法 将NcoI位点和MG7－Ag模拟表位编码序列的互补序列设计到上游引物的5′端。以含有HBcAg全序列的质粒p1.2Ⅱ为模板，通过PCR扩增，获得MG7－Ag模拟表位与HBcAg的融合基因。将目的基因插入载体pUCm-T，经酶切鉴定和序列测定证实后，再亚克隆至与减毒鼠伤寒杆菌X4550互补的质粒pYA3341中，再以此重组质粒转化减毒鼠伤寒杆菌X4550。结果 序列测定证实，PCR产物为胃癌MG7－Ag模拟表位与HBcAg的融合基因片段；最终得到含有目的基因片段的重组表达载体pYA3341。重组质粒在X4550中的表达产物，经Western blot表明，在相对分子质量（Mr)约在22000处有1条可与抗MG7 mAb特异性结合的多肽表位。结论 成功地研制可表达胃癌MG7－Ag模拟表位减毒鼠伤寒杆菌疫苗，为进一步研究其在胃癌免疫治疗中的作用奠定了基础。     

深圳市福田区2009-2010年疑似预防接种异常反应监测分析

目的分析深圳市福田区疑似预防接种异常反应（AEFI）的发生特征。方法通过国家网络信息系统收集AEFI个案资料,采用描述性方法对相关指标进行分析。结果2009-2010年报告AEFI 394例,其中≤2岁儿童占65.74%,男女性别比为1.28∶1。接种后1 d内发生占79.44%。AFFI分类诊断中,一般反应占59.14%,异常反应占22.59%,偶合症占18.27%。临床诊断前3位为：发热、红肿、硬结,过敏性皮疹,无菌性脓肿,分别占57.11%、19.54%、5.08%。394例AEFI预后良好,未出现后遗症或死亡病例。发生AEFI前3位的疫苗为麻疹减毒活疫苗、全细胞百白破疫苗、甲型流感（裂解）疫苗,分别为69例（17.51%）、63例（15.99%）、57例（14.47%）。不同疫苗AEFI报告发生率在28.53/100万剂～1 495.00/100万剂。结论辖区AEFI监测敏感性和质量都较之前有明显的提高,各项监测指标均达到了国家方案要求,但AEFI报告发生率与WHO报道的预期发生率还有一定差距,说明监测工作仍有待提高。