密蒙花方对缺氧状态下脐静脉血管内皮细胞VEGF-VEGFR信号转导通路的影响

目的从血管内皮生长因子-血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor,VEGF-VEGFR)信号转导机制方面深入探讨密蒙花方抑制缺氧状态下人血管内皮细胞增殖的作用机制。方法采用人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vasculal endothelial cell,HUVEC)进行体外培养,利用二氯化钴(CoCl2)模拟缺氧状态,同时分别将10g·L-1、20g·L-1、40g·L-1密蒙花方水提液作用于缺氧状态下的HUVEC24h,采用水溶性四氮唑-8(WST-8)法检测密蒙花方对缺氧状态下HUVEC增殖的影响,采用Westernblot法检测密蒙花方对缺氧状态下HUVEC内血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、fms样酪氨酸激酶受体1(fms-like tyrosine kinase-1,Flt-1)、胎肝激酶-1/激酶插入区受体(fetal liver kinase-1/kinase insert domain-containing receptor,Flk-1/KDR)蛋白磷酸化水平的影响。采用免疫组织化学法检测HUVEC内细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)蛋白表达的情况。结果 WST-8法结果显示:缺氧组吸光度值为1.112±0.060,各密蒙花方组吸光度值分别为0.860±0.050、0.567±0.072、0.263±0.057,表明密蒙花方可有效抑制缺氧状态下HUVEC增殖(均为P<0.01)。Western blot结果显示:缺氧组HUVEC内VEGF、Flk-1/KDR蛋白磷酸化水平分别为1.922±0.048、1.341±0.054,较正常组升高,Flt-1蛋白磷酸化水平为1.265±0.065,较正常组降低,密蒙花方可使缺氧状态下HUVEC内VEGF、Flk-1/KDR蛋白磷酸化水平降低,Flt-1蛋白磷酸化水平升高,差异均有显著统计学意义(均为P<0.01)。免疫组织化学显示:正常组ICAM-1吸光度值161.416±4.905,缺氧组ICAM-1吸光度值为213.464±10.282,各密蒙花组ICAM-1吸光度值分别为186.841±9.039、171.862±8.202、165.053±6.088。密蒙花方可使缺氧状态下HUVEC内ICAM-1蛋白表达减少。结论下调细胞内VEGF、Flk-1/KDR蛋白磷酸化水平,上调细胞内Flt-1蛋白磷酸化水平,干预细胞内VEGF-VEGFR信号转导通路,是密蒙花方抑制缺氧状态下HUVEC增殖的作用机制之一。     

腺病毒介导的PEDF基因转移对脐静脉血管内皮细胞的作用

目的 研究腺病毒介导的色素上皮衍生因子(adenovirus pigment epithelium-derived factor,Ad-PEDF)对体外培养的血管内皮细胞增生及凋亡的作用.方法 采用MTT法观察PEDF基因对人脐静脉血管内皮细胞ECV304的体外细胞增生的影响.TUNEL染色、流式细胞仪AnnexinV/碘化丙啶双染法,检测腺病毒介导的PEDF基因作用后人脐静脉血管内皮细胞的凋亡.结果 Ad-PEDF(感染复数分别为25和50)作用72 h后,ECV304细胞数显著少于PBS组和Ad-LacZ组(P＜0.05);TUNEL染色,ECV304细胞出现典型的凋亡形态学改变.以感染复数为50的Ad-PEDF处理ECV304细胞72 h后,细胞凋亡率为(26.51±1.54)%,PBS组为(2.90±0.79)%,Ad-LacZ组为(3.28±0.73)%,Ad-PEDF组与Ad-LacZ组、PBS组相比差异均有显著统计学意义(P＜0.01).结论 腺病毒介导的PEDF基因可显著抑制人脐静脉血管内皮细胞ECV304的体外细胞增生,同时对人脐静脉血管内皮细胞的凋亡具有诱导作用.     

缺氧时视网膜血管内皮细胞缺氧诱导因子-1α及其mRNA的时序性表达

目的探讨在缺氧状态下视网膜血管内皮细胞缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)及其mRNA表达的时空规律.方法对分离的牛视网膜血管内皮细胞分别进行常规和CoCl2模拟缺氧培养,采用免疫组化和逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)检测不同缺氧时间HIF-1α及其mRNA的表达.结果正常对照组HIF-1α有极低表达,在缺氧1h时表达量显著上升,4h达到高峰,16h后下降.与对照组比较,各缺氧组HIF-1α的表达均有显著性差异(P＜0.01).但各缺氧组HIF-1αmRNA的表达无明显差异.结论视网膜血管内皮细胞在缺氧早期HIF-1 α表达有短暂、迅速的增加,但其mRNA的表达无明显变化,提示缺氧可以促进视网膜血管内皮细胞HIF-1α的表达,但不是在基因的转录水平.     

雷公藤红素对高糖环境下大鼠视网膜血管内皮细胞VEGF和PEDF表达的影响

目的观察雷公藤红素对高糖环境下大鼠视网膜血管内皮细胞VEGF和PEDF表达的影响。方法将体外培养的大鼠视网膜血管内皮细胞分为空白对照组、高糖组、高糖+雷公藤红素(0.05mg·L-1)组,进行相应处理后分别用免疫细胞化学及ELISA法检测细胞中VEGF和PEDF的表达。结果免疫细胞化学灰度值测定,空白组、高糖组及高糖+雷公藤红素组VEGF表达分别为74.40±4.19、110.12±7.32、78.11±5.81,PEDF表达量分别为124.65±6.01、88.73±7.84、93.31±5.67;ELISA结果显示空白组、高糖组及高糖+雷公藤红素组VEGF表达量分别为(155.21±13.36)ng·L-1、(237.69±19.41)ng·L-1、(168.57±26.32)ng·L-1,PEDF表达量分别为(251.37±17.95)ng·L-1、(178.35±25.36)ng·L-1、(191.58±31.37)ng·L-1,与正常对照组相比,高糖组VEGF表达增高(P<0.05),PEDF表达减少(P<0.05);与高糖组相比,高糖+雷公藤红素组VEGF表达减少(P<0.05),PEDF表达无明显差异性(P>0.05)。结论雷公藤红素能减少高糖环境下大鼠视网膜血管内皮细胞中VEGF表达,对PEDF表达的影响不明显。     

曲安奈德对缺氧条件下恒河猴脉络膜视网膜内皮细胞VEGF表达的影响

目的:研究曲安奈德对缺氧条件下恒河猴视网膜脉络膜内皮细胞VEGF表达的影响,探讨曲安奈德治疗视网膜脉络膜新生血管的作用机制。方法:采用免疫组化图像分析和半定量RT-PCR方法,检测曲安奈德对正常和缺氧条件下RF/6A细胞VEGF表达的影响。结果:缺氧条件下VEGF蛋白在细胞胞质中的染色强度明显增强,加入曲安奈德后VEGF蛋白在细胞胞质中的染色强度明显减弱,正常条件下的VEGF蛋白的A值为276.8±8.6;正常加药组的A值为137.1±10.2;缺氧条件下的A值为406.1±8.8;缺氧加药组的OD值244.2±12.8。半定量RT-PCR表明VEGFmRNA在正常对照组RF/6A细胞中的相对表达量为1.38±0.05;缺氧对照组RF/6A细胞中的相对表达量为5.41±0.06;正常加药组RF/6A细胞中的相对表达量为0.70±0.06;缺氧加药组RF/6A细胞中的相对表达量为4.23±0.05,以上两种方法,缺氧对照组与正常对照组比较、缺氧对照组与缺氧加药组比较、正常对照组与正常加药组比较差异均有显著性意义(P=0.000)。结论:缺氧状态下RF/6A细胞中VEGF的表达明显增高,曲安奈德能显著抑制正常和缺氧状态下RF/6A细胞中VEGF的表达。     

整合素连接激酶与缺氧状态下VEGF表达的实验研究

目的探讨缺氧状态下整合素连接激酶(ILK)的表达是否增高以及这种增高与血管内皮生长因子(VEGF)的表达上调是否相关。方法将恒河猴视网膜脉络膜血管内皮细胞(RF/6A)置于94%N2、5%CO2和1%O2的低氧环境,检测0、1、2、3、4hILK,HIF-1α和VEGF的mRNA及蛋白表达水平,进一步用LY294002抑制ILK的活性或RNA干扰抑制ILK的表达后再次检测缺氧4h上述3种因子的表达情况。结果在缺氧0hILK、HIF-1α和VEGF的mRNA及蛋白表达均较低,而缺氧1～4hILK、HIF-1α和VEGF的mRNA及蛋白表达均明显增高,但这种增高都会因为ILK的表达或活性受到抑制而被抑制。结论缺氧状态下在RF/6A细胞中ILK的表达增高,并且ILK的表达增高也会使HIF-1α和VEGF表达上调,说明ILK参与缺氧状态下RF/6A细胞VEGF的表达。     

密蒙花方防护糖尿病大鼠早期视网膜神经细胞损伤机制探讨

目的　探讨密蒙花方防治糖尿病视网膜病变大鼠早期视网膜神经细胞损伤的作用机制,为临床实践提供实验依据。方法　采用清洁级雄性Sprague-Dawley（SD） 大鼠120只,其中正常组30只,其余大鼠采用链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠动物模型,造模成功后随机分为模型组及密蒙花方组,密蒙花方组采用密蒙花方灌胃3个月,模型组用与密蒙花方组等容的蒸馏水灌胃。给药1个月后,采用TUNEL法检测大鼠视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells,RGCs）凋亡情况;分别在给药1个月、2个月、3个月后采用高效液相色谱法检测各组大鼠视网膜中谷氨酸含量;PCR以及Western blot法检测视网膜中Sigma-1R mRNA和蛋白表达情况。结果　给药1个月后,TUNEL法检测结果示,密蒙花方组RGCs凋亡数少于模型组。高效液相色谱法检测结果示,给药1个月、2个月、3个月后,模型组较正常组谷氨酸含量均增加（均为P＜0.01）,密蒙花方组谷氨酸含量较模型组均降低（均为P＜0.01）。给药3个月后,正常组、模型组和密蒙花方组视网膜Sigma-1R mRNA相对表达量分别为1.71±0.11、0.67±0.09和1.50±0.14,Sigma-1R蛋白相对表达量分别为0.39±0.02、0.16±0.02和0.30±0.01;与正常组相比,模型组Sigma-1R mRNA及蛋白水平均降低（均为P＜0.01）;与模型组相比,密蒙花方组Sigma-1R mRNA及蛋白水平均升高（均为P＜0.01）;密蒙花方组与正常组之间差异均无统计学意义（均为P>0.05）。结论　糖尿病视网膜病变早期即出现视网膜神经细胞的凋亡及损伤,密蒙花方可通过谷氨酸和Sigma-1R介导机制干预糖尿病大鼠早期视网膜神经细胞损伤,从而起到阻止糖尿病视网膜病变进一步发展的作用。     

血管内皮细胞生长因子抑制剂对视网膜血管内皮细胞自噬的促进作用

目的　观察血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）抑制剂对小鼠视网膜血管内皮细胞（retinal vascular endothelial cells,RVECs）自噬水平的影响。方法　将RVECs随机分为五组:正常对照组、缺氧对照组、自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）组、VEGF抑制剂（anti-VEGF）组和3-MA+anti-VEGF组。采用Western blot法检测RVECs中两种自噬标志蛋白微管相关蛋白1 轻链 3 （LC3）及Beclin-1的表达;计算绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）阳性斑点细胞占比;透射电子显微镜下观察细胞内形成的自噬体的超微结构。结果　正常对照组、缺氧对照组、3-MA组、anti-VEGF及3-MA+anti-VEGF组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ分别为0.182±0.125、0.587±0.101、0.309±0.151、0.914±0.037及0.585±0.098;Beclin-1分别为0.205±0.035、0.590±0.120、0.425±0.082、0.842±0.087及0.607±0.022;GFP阳性斑点细胞比例分别为17.107%±3.521%、90.278%±2.684%、82.591%±4.490%、94.798%±1.760%及89.472%±3.764%。与正常对照组相比,缺氧对照组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1蛋白表达增高,GFP阳性斑点细胞的比例增加（均为P<0.05）,同时自噬体增多。与缺氧对照组相比,3-MA组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1蛋白表达水平及GFP阳性斑点细胞比率降低（均为P<0.05）,同时自噬体减少;anti-VEGF组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1蛋白表达水平及GFP阳性斑点细胞比率升高（均为P<0.05）,同时自噬体增多。与anti-VEGF组相比,3-MA+anti-VEGF组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1蛋白表达水平及GFP阳性斑点细胞比率降低（均为P<0.05）,同时自噬体减少。结论　VEGF抑制剂对缺氧状态下视网膜血管内皮细胞的自噬水平有促进作用。     

缺氧条件下骨髓间充质干细胞对血管内皮细胞迁移和管腔形成的影响

目的:探讨缺氧条件下骨髓间充质干细胞(BMSCs)对血管内皮细胞迁移和管腔形成的影响。方法:制备3种细胞的条件培养基(CM),分别为对照组(血管内皮细胞培养基,VCM)、常氧条件下BMSCs的CM组(NCM)和缺氧条件下BMSCs的CM组(HCM)。分别用以上3种CM培养人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)和猴脉络膜-视网膜血管内皮细胞(RF/6A)6~24h后,观察血管内皮细胞迁移和管腔形成的能力。结果:相对于对照组和常氧组的CM,缺氧组即HCM作用下的血管内皮细胞的迁移数目和成管数量(包括成管总长度和分支数)均显著增加(均P<0.05)。在RF/6A细胞,对照组VCM、常氧组NCM和缺氧组HCM作用24h后,迁移的细胞数分别为19.00±3.61、32.33±3.06、114.00±11.53个(F=153.3,P<0.001);而HUVECs的3组细胞迁移个数则分别是76.00±9.54、122.00±18.68、307.70±25.97个(F=121.5,P<0.001)。RF/6A细胞经各组CM孵育6h后,成管数目分别为12.00±3.00、37.00±4.58、51.00±3.61个(F=81.7,P<0.0001);3组HUVECs细胞管腔形成的结果类似。结论:缺氧条件下BMSCs可促进血管内皮细胞的迁移和成管能力,这种机制可能在视网膜新生血管中发挥作用。     

缺氧诱导因子-1α与血管内皮生长因子在视网膜新生血管中的表达及相关性

目的:检测视网膜新生血管中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的表达,研究其与血管内皮生长因子(VEGF)表达的相关性。方法:以高浓度氧诱导C57BL/6J小鼠建立视网膜新生血管模型,取对照组和给氧组幼鼠眼球作荧光素血管灌注,病理切片及免疫组织化学检测,分别观察视网膜血管的改变,视网膜新生血管内皮细胞数目及HIF-1α,VEGF蛋白的表达。结果:给氧组视网膜可见大量新生血管形成,新生血管内皮细胞核数为(23.38±1.07)个,与对照组相比差异有极显著性(P<0.01)。HIF-1α蛋白表达在神经节细胞层和突破视网膜内界膜的新生血管。VEGF蛋白表达在内核层,神经节细胞层和突破视网膜内界膜的新生血管。两者表达呈显著正相关(r=0.931,P<0.01)。结论:在视网膜新生血管形成中存在HIF-1α,VEGF的高表达,且两者表达密切相关。     

Treatment of retinal detachment of the course of retinopathy of prematurity

Cryo- and laser therapy of stage 3 have reduced, but not eliminated the occurrence of retinal detachment in stages 4a, 4b and 5 of ROP. In this disease the treatment of these stages is still the greatest challenge to the ophthalmologist. Therefore, the aim of this paper is to present our up-to-date possibilities of treatment of different kinds of retinal detachments in ROP, including segmental scleral buckling, encircling scleral buckling, scleral resection, vitrectomy and its modifications in ROP. Guidelines of surgery of retinal detachment in active stage 4 and 5 of retinopathy of prematurity have been described.     

Analysis of some of the possible neonatal risk factors of development of retinopathy of prematurity

PURPOSE: The aim of the study was to evaluate some of the possible risk factors for retinopathy of prematurity (ROP) treated with laser photocoagulation or cryocoagulation. MATERIAL AND METHODS: The study comprised 71 preterm infants with ROP needing treatment and 118 prematures without ROP or with ROP requiring no treatment, as a control group. All infants were born with gestational age < or = 32 weeks and birth weight < or = 1500g. The perinatal variables, including some of clinical data, the length of mechanical ventilation as well as continous positive airway pressure (CPAP), duration of total parenteral nutrition and some of laboratory data were analyzed, to evaluate their correlation with the development of ROP. RESULTS: Gestational age before 28 weeks (OR = 5.11), episodes of convulsiones (OR = 2.15), mechanical ventilation for more than 20 days (OR = 5.86) and > 30 days (OR = 7.47), CPAP for more than 5 days (OR = 4.15) and > 10 days (OR = 2.84), total parenteral nutrition for more than 10 days (OR = 7.84) and > 20 days (OR = 9.02) and elevated peak of alanine aminotransferase (AIAT) levels (OR = 3.17) were significant risk factors for ROP requiring treatment. CONCLUSIONS: The opthalmic examination for retinopathy of prematurity requiring laser photocoagulation or cryocoagulation should be obligatory for prematures born < or = 32 weeks of gestational age, with birth weight < or = 1500 g.The frequency of the consecutive ophthalmic examinations depends on the severity of prematurity and on the presence and intensification of the risk factors for ROP.     

角膜曲率的分析

目的：探讨我国人角膜曲率半径的正常值及不同性别、不同年龄的角膜曲率半径差异。方法：对10998只眼的角膜曲率进行检测，并按男、女10岁一组进行统计分析。结果：（1）K1为7.65mm,K2为7.71mm，平均K值为7.67mm。较眼科学正常值K:7.77mm短0.1mm。（2）K的平均值男性较女性的长0.1155mm。且女性各年龄段角膜曲率半径均男性的有不同程度的减短。（3）男女均随年龄的增长，角膜曲率半径大致呈递减趋势，即：角膜曲率半径与年龄成反比关系。（４）男女K1,K2之比，均随年龄增长而增长，即K1逐渐增长而增长，即　K1值逐渐增长，K2逐渐减短。结论：本文测定的角膜曲率较眼科文献中的提供的正常值短0.1mm，并且存在着年龄、性别上的差异。     

亟待新型早产儿视网膜病变动物模型的问世

早产儿视网膜病变（ROP）病因和发病机制尚不完全清楚,制约了其有效防治和相关研究的深入开展。尽管氧诱导视网膜病变动物模型为探索ROP复杂的病因和发病机制发挥了重要作用,但特异性较差,与人类ROP临床本质存在一定差异。因此,有必要对现有动物模型进行改良或建立新动物模型。通过更新观念、在多学科交叉中寻求突破,融合更多ROP危险因素,并结合新兴的转基因技术以及完善模型评价系统,建立科学的实验研究平台,为更好地开展ROP防治研究奠定基础。