抗戊型肝炎病毒噬菌体抗体库的构建与筛选

目的 :构建人抗戊型肝炎病毒 (HEV)噬菌体抗体库 ,筛选人源中和性抗HEV的单克隆抗体 (mAb)。方法 :取抗HEV抗体阳性的 6例HE患者静脉血 ,分离淋巴细胞 ,提取细胞总RNA后逆转录。用一组人IgGFab基因特异性引物 ,分别扩增IgGκ0轻链与重链Fd段基因。将κ轻链与Fd段基因先后克隆入噬菌体载体pComb3的相应位点 ,经电穿孔法转化大肠杆菌XL1 Blue ,再以辅助噬菌体VCSM13超感染 ,构建人抗HEV噬菌体抗体库。采用独特的 5轮筛选法 (逐渐降低抗原包被量 ,严格洗脱条件 ) ,以固相化的 4种含中和抗原表位的HEV代表株ORF2重组混合抗原 ,筛选人噬菌体抗体库 ,并以ELISA鉴定噬菌体抗体。结果 :经数次电转化构建了容量为1.9× 10 7重组率为 80 %的κ轻链基因库 ;容量为 1.8× 10 7重组率为 2 0 %的Fab基因库。以含中和抗原表位的HEV代表株ORF2重组混合抗原特异淘筛 5次 ,出现特异富集。ELISA鉴定第 5轮筛选产物 ,得到 4株与HEVORF2重组混合抗原具有较高亲和力的Fab噬菌体抗体 ,可能为中和抗体。结论 :成功地构建了人抗HEV噬菌体抗体库 ,并获得人源抗HEV特异性噬菌体抗体。     

肺癌患者噬菌体抗体库的构建及抗肺癌单抗的筛选

目的　探索从人体肿瘤局部引流淋巴结扩增免疫球蛋白基因构建噬菌体抗体库及从中筛选抗肿瘤单抗的可行性。方法　从肺癌患者肺门淋巴结提取总RNA ,经逆转录 聚合酶链反应扩增免疫球蛋白重链Fd段和κ链基因 ,以pcomb3H为载体 ,构建噬菌体抗体库 ,以 2株肺癌细胞对噬菌体抗体库进行 6轮亲和筛选 ,再以人成纤维细胞进行 2轮吸附 ,以筛选出抗肺癌细胞抗体。以细胞ELISA法初步鉴定抗体活性。结果　构建成噬菌体抗体库 ,库容为 7.5× 10 7个克隆 ,κ链和Fd段基因与载体DNA的重组率分别为 10 0 % (10 / 10 )和 90 % (9/ 10 )。通过亲和筛选和吸附从中获得了能与肺癌细胞结合的人单抗。结论　从人体肿瘤局部引流淋巴结扩增免疫球蛋白基因构建噬菌体抗体库并从中筛选抗肿瘤单抗是可行的 ,以肿瘤细胞作抗原从抗体库中筛选抗肿瘤抗体是可取的。     

人源性Fab段噬菌体抗体库的构建及抗人β1-AR抗体克隆的筛选

目的构建人源性Fab段噬菌体抗体库并筛选抗人β1-AR抗体克隆.方法通过RT-PCR从抗人β1-AR抗体阳性的扩张性心肌病(DCM)患者的外周血淋巴细胞中扩增出人IgG重链Fd段和κ、λ两轻链基因片段,将其克隆入噬粒pComb3中,构建人源性Fab段噬菌体抗体库,并利用噬菌体表面显示技术,以人β1肾上腺素受体细胞外第二环26肽(β1-ARECⅡ)为抗原肽,对此抗体库进行淘筛富集.结果成功地构建了库容量为1.4×106的人源性Fab段噬菌体抗体库,从此抗体库中筛选到了特异性抗人β1-AR Fab段噬菌体抗体阳性克隆.结论利用噬菌体抗体库技术可以获得表达抗人β1-AR抗体的重组克隆.     

人噬菌体抗体库的构建和甲肝抗体的筛选

目的　构建人噬菌体抗体组合文库,筛选人单克隆抗体。方法　用RTPCR扩增人全套抗体基因片段,克隆于pComb3载体,电转化E.coli形成噬菌体抗体库;以固相化抗原淘筛抗体库,ELISA鉴定噬菌体抗体。结果　17对免疫球蛋白引物全部能够扩增出目的片段;经数次电转化构建了库容为693×107的抗体库,滴度为8×1014PFU/ml,Fab基因重组率为40%。以单抗捕获的甲肝抗原淘洗3轮,出现特异性富集;阳性克隆经直接ELISA和竞争抑制性ELISA实验证实具有良好的抗甲肝抗原特异性,无交叉反应性。结论　成功构建了抗体组合文库,从中获得抗甲肝抗原的特异性人抗体。     

人源抗丙型肝炎病毒噬菌体抗体库的构建及筛选

目的　构建人丙型肝炎病毒 (HCV)特异性噬菌体抗体库 ,制备人源抗HCV单克隆抗体 (mAb)。方法　用常规RT PCR法 ,直接从 5例丙型肝炎患者外周血混合淋巴细胞中 ,扩增抗体重链Fd基因和κ轻链基因 ,与噬菌体载体pComb3连接 ,构建噬菌体抗体Fab库。对抗体库进行 5轮吸附 -洗脱 -扩增的亲和选择后 ,以ELISA法鉴定抗HCV噬菌体抗体。结果　RT PCR可有效地扩增出Fd和κ基因 ,并以此构建成容量为 1 2× 10 7的噬菌体抗体库。经 5轮亲和选择可使特异性噬菌体抗体得到高度富集 ,抗HCV噬菌体抗体阳性克隆达 96 %。结论　抗HCV噬菌体抗体库的构建和人源抗HCVmAb的制备 ,为HCV感染的诊断、治疗和发病机制的研究提供有效的分子工具     

人噬菌体抗体库的构建及人源性bFGF抗体的筛选

目的选用含高效价碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)抗体的自身免疫病患者外周血淋巴细胞为材料,构建人噬菌体抗体库,并从中筛选抗bFGF抗体克隆。方法收集自身免疫病患者外周血,提取淋巴细胞总RNA后逆转录得到cDNA第一链,经PCR扩增重链Fd段和轻链基因,分别构建到噬菌粒载体pComb3中,将重组噬菌粒载体电转化大肠杆菌XL1Blue,以辅助噬菌体VCSM13超感染,构建人噬菌体抗体库。经过3轮固相筛选,获得能结合bFGF的抗体克隆,并用ELISA进行进一步鉴定及筛选,获得具有高亲和力的抗bFGF噬菌体抗体克隆。结果构建的人源噬菌体抗体库库容为2.5×107,经3轮筛选获得具有bFGF特异性的Fab噬菌体抗体克隆。结论构建了人噬菌体Fab抗体库,并能够从中筛选出与bFGF特异结合的抗体克隆,为bFGF抗体药物研究奠定基础。     

人源性噬菌体抗体库的构建和抗CEA抗体的筛选及表达

目的构建人源性噬菌体抗体库,筛选和表达人源性抗癌胚抗原(CEA)单克隆抗体。方法从结肠癌患者肠系膜淋巴结中的淋巴细胞克隆出免疫球蛋白Fd段和κ链基因,建成噬菌体抗体库。用人CEA对抗体库进行筛选,将得到的阳性克隆进行表达及检测。结果抗体库库容为5．2×106,Fab基因重组率为30％。ELISA及Western blot分析检测,证实表达出人源抗CEA单克隆抗体。DNA序列测定,证实所获基因为人免疫球蛋白可变区基因。结论成功构建噬菌体抗体库,从中获得人源性抗CEA的单克隆抗体。     

人源抗丙型肝炎病毒噬菌体抗体库的构建、筛选及表达

用常规RT PCR法 ,直接从 5名丙型肝炎患者外周血混合淋巴细胞中扩增抗体重链Fd基因和κ轻链基因 ,构建噬菌体抗体Fab库。对抗体库进行 5轮吸附 洗脱 扩增的亲和选择后 ,以ELISA法鉴定抗HCV噬菌体抗体。 5轮亲和选择使特异性噬菌体抗体得到高度富集 ,抗HCV噬菌体抗体阳性克隆达 96 %。对一阳性克隆在大肠杆菌中表达 ,经ELISA及Westernblot分析鉴定 ,证实成功表达出人源可溶性Fab。对抗体基因VH和VκDNA序列进行测定 ,证实所获基因为抗体可变区基因。抗HCV噬菌体抗体库的构建和人源抗HCV单克隆抗体Fab段的制备 ,为HCV感染的诊断、治疗和发病机制的研究提供有效的分子工具。     

人源抗SARS病毒噬菌体抗体库的构建及筛选

目的: 构建人源抗SARS病毒的Fab片段抗体基因的噬菌体表面呈现文库, 筛选抗SARS病毒特异性的噬菌体抗体。方法: 用PCR扩增人Fab片段抗体基因, 连入载体pComb3内, 构建噬菌体抗体库。以固相化的SARS抗原淘筛抗体库, 并用ELISA检测噬菌体抗体结合SARS病毒的特异性。结果: 用PCR共扩增出 13条Ig基因片段。电转化构建的噬菌体抗体库的库容为 1. 3×106, Fab基因的重组率为60%。以纯化的SARS抗原淘筛 3轮, 特异性富集了抗SARS病毒的噬菌体抗体, 并用ELISA法从中筛选出了 10个结合活性好、特异性强的克隆。结论: 成功地构建了人源抗SARS病毒的组合抗体文库, 从中获得人源抗SARS病毒的特异性抗体。     

构建预设CDR3基因噬菌体抗体库筛选抗人整合素ανβ3 mAb的人源化Fab

目的:构建预设CDR3基因的噬菌体抗体库,通过抗原表位导向选择方法筛选抗人整合素ανβ3单克隆抗体(mAb)人源化Fab。方法:将鼠mAbLCDR3重组到人轻链可变区文库中并与人/鼠嵌合重链Fd基因配对构建杂合噬菌体抗体库,用固相人整合素ανβ3抗原筛选人源化轻链基因。再用所获人轻链基因与移植有鼠mAbHCDR3的人重链Fd基因配对构建人源噬菌体抗体库,筛选人源化Fab。结果:分别构建了库容为2.1×106和2×107的杂合噬菌体抗体库和人源噬菌体抗体库,筛选到3株人源Fab克隆。经间接ELISA及竞争抑制ELISA证实,能特异结合整合素ανβ3抗原,其中人源D5株Fab克隆的基因序列表明,人轻链可变区基因属VKIII亚群,人重链可变区基因属VH1亚群。结论:利用噬菌体抗体库技术,成功地进行了鼠抗人整合素ανβ3mAbE10人源化的改造,为进一步临床应用奠定了基础。     

抗广州管圆线虫噬菌体抗体库的构建及初步筛选

目的以广州管圆线虫感染的小鼠脾细胞为源,构建抗广州管圆线虫抗体库,并筛选可用于广州管圆线虫病早期诊断的目的抗体。方法提取感染广州管圆线虫的小鼠脾细胞RNA,并逆转录合成cDNA第一链,PCR扩增出抗体轻链和重链基因,将轻、重链基因先后连接到表达载体pComb3上,转化大肠杆菌XLI-Blue,构建组合文库。用广州管圆线虫排泄分泌抗原（EsAg）作为筛选抗原,进行富集筛选,用ELISA法鉴定阳性克隆。结果成功构建了小鼠抗广州管圆线虫噬菌体抗体文库,库容为2.32×106,滴度为1.7×1013cfu/ml。筛选到了抗广州管圆线虫排泄分泌抗原特异性抗体克隆5株,用过氧化物酶标记的抗M13抗体进行初步鉴定,具有一定的特异性。结论构建的抗广州管圆线虫噬菌体抗体库达到了要求,为研制广州管圆线虫金标诊断试剂盒奠定了基础。     

黑素瘤患者噬菌体抗体库的构建与筛选

目的 :构建噬菌体抗体库并筛选抗黑素瘤细胞的人抗体。方法 :从 1例长期存活的黑素瘤患者的外周血中分离单个核细胞 (PBMC) ,提取总RNA ,并逆转录为cDNA。用PCR扩增多样性κ链基因和重链Fd段基因 ,分别构建κ链库和重链库 ,组合为Fab段噬菌体抗体库 ,用两种黑素瘤细胞系对抗体库进行筛选和鉴定。结果 :所构建的噬菌体抗体库的库容量达 1.2× 10 8,用两种黑素瘤细胞系进行亲和吸附筛选 ,获得针对其中 1种黑素瘤细胞系的特异性抗体。结论 :采用噬菌体抗体库技术 ,成功地从 1例长期存活的黑素瘤患者体内克隆到特异性抗黑素瘤细胞的抗体 ,为进一步的研究和应用奠定了基础     

人源Fab噬菌体抗体库的构建与抗精氨酸加压素抗体的筛选

目的:构建人源天然Fab噬菌体抗体库,筛选抗精氨酸加压素特异性抗体并进行初步鉴定。方法:从18位健康成人的外周血淋巴细胞,提取总RNA。利用RT-PCR扩增人Fab抗体基因片段,将其克隆至噬菌粒载体pComb3XSS内,构建人源天然Fab噬菌体抗体库。以固相化的精氨酸加压素为靶抗原对抗体库进行五轮筛选后,随机挑取50个单克隆进行phage-ELISA检测,阳性克隆行DNA测序分析。结果:成功构建库容为2.4×108的噬菌体抗体库,从中筛选到6株阳性克隆能够与精氨酸加压素特异性结合,其中阳性值最高的C4克隆行DNA测序分析证实其重链属IgG亚类,轻链为λ链。结论:构建大容量人源天然Fab抗体库,从中获得了特异性抗精氨酸加压素人源Fab抗体片段,有望为临床上精氨酸加压素的快速检测技术的建立奠定基础。     

从噬菌体抗体库筛选获得中和性人源抗甲型肝炎病毒Fab抗体

目的 研究人源抗甲型肝炎病毒基因工程抗体,为预防甲型肝炎病毒感染提供有效的方法。方法 采用噬菌体表面展示技术,从一名甲型肝炎恢复期病人的抗凝血中分离淋巴细胞,提取总ＲＮＡ逆转录后,用一组人ＩｇＧ Ｆａｂ特异性引物扩增。结果 克隆和表达了８株人源抗甲型肝炎病毒抗体Ｆａｂ段基因,经ＥＬＩＳＡ检测为特异性人抗甲型肝炎病毒Ｆａｂ段抗体。结论 该８株人源抗甲型肝炎病毒Ｆａｂ抗体都能与具有中和活性的鼠抗甲型肝炎病毒单克隆抗体产生竞争抑制反应,选其中的２株做体外中和实验,证明都有中和甲型肝炎病毒的活性。     

人源性噬菌体抗体库的构建及抗amylin抗体的初步筛选

目的:构建人源性噬菌体抗体库,从中筛选胰淀素(amylin)单克隆抗体(mAb),测定其特异性及抗原结合活性。方法:从正常健康人的外周血淋巴细胞中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增人免疫球蛋白Fd段和轻链基因,构建噬菌体抗体库。酶切和PCR鉴定后,阳性克隆进行DNA测序分析。用人amylin抗原对抗体库进行筛选富集,将得到的阳性克隆进行Phage-ELISA鉴定,结果进行统计学分析。结果:最终构建的抗体库库容约为0.8×108,酶切鉴定显示有插入片段,抗体库重组率为70%。阳性克隆进行DNA测序证实所获基因为人免疫球蛋白可变区基因。以amylin抗原进行3轮筛选,抗体库得到特异性富集。阳性克隆进行Phage-ELISA检测证实有良好的抗胰淀素抗原的特异性。结论:成功构建了一个人源性噬菌体抗体库,为从中获得人源抗amylin的mAb奠定了实验基础。     

用导向选择链更替技术建立抗肝癌抗原HAb18G的人源性Fab基因库

目的 :在嵌合HAb18 Fab抗体的基础上 ,利用载体pComb3X ,采用导向选择链更替技术建立全人源性Fab基因库。方法 :用RT PCR自肝癌患者外周血单个核细胞 (PBMC)中 ,扩增全套人抗体Fd基因片段和L链基因。首先 ,将Fd基因克隆入已含嵌合L链基因的展示载体pComb3X/CL中 ,建立人 -鼠杂合的Fab基因库 ,以原核表达的非融合HAb18G的胞外区片段为抗原 ,筛选杂合的Fab基因 ,以得到人Fd基因。然后应用筛选出的Fd基因与人L链基因库配对 ,建立全为人Fab的基因库 ,并筛选全人Fab基因。将IPTG诱导的表达菌裂解 ,取其上清对pⅢ Fab融合蛋白的功能进行分析 ,并对其编码基因进行测序。结果 :建立了库容为 2× 10 7的杂合Fab基因库 ,经 6轮筛选后得到 7株杂合Fab基因。利用筛选的人Fd基因建立了库容为 0 .8× 10 7的全人Fab基因库 ,经 4轮筛选得到 2株亲和力较高、特异性强的人Fab基因。测序结果显示 ,2株Fab基因具有相同的Fd基因序列 ,与亲本抗体同属IgG2亚类 ;L链基因为κ型 ,可变区均属于Vκ3家族。结论 :利用导向选择链更替技术 ,筛选出特异性较强、完全人源化的抗肝癌抗原HAb18G的Fab抗体 ,为进一步的工作打下了基础。     

人源性抗HER2胞外段Fab噬菌体抗体库的构建及筛选

目的:构建全人源抗HER2胞外段(HER2 ECD)噬菌体Fab抗体库,从中筛选出特异性的抗体,并对其进行鉴定。方法:体外致敏并用EB病毒(EBV)转化HER2高表达乳腺癌患者的外周血单核细胞(PBMC),用PCR分别扩增重链Fd和轻链κ/λ基因。经SacI/XbaI和XhoI/SpeI双酶切,依次克隆入噬菌体载体pComb3中,并电转化大肠杆菌XL1-Blue,以辅助噬菌体VCSM13进行超感染,构建抗HER2 ECD人源化Fab噬菌体抗体库。以纯化HER2 ECD蛋白为抗原进行3轮固相淘选,富集抗HER2 ECD的抗体,并随机挑选克隆进行ELISA,获得的阳性克隆进一步以Western blot鉴定其抗原结合活性,对其中活性最高的克隆进行DNA测序。结果:构建了容量为2.5×107的抗HER2 ECD的Fab噬菌体抗体库,并筛选获得了4株与HE2 ECD特异性结合的阳性克隆,Western blot分析显示其与HER2 ECD能较好的结合。选取结合活性最高的阳性克隆进行DNA序列分析,结果显示其重链可变区、轻链可变区分别与人胚系免疫球蛋白基因有高度的同源性。结论:成功构建了全人源抗HER2 ECD噬菌体抗体库,并筛选出抗HER2 ECD特异性较强的噬菌体克隆,为获得新的有临床应用价值的HER2 ECD抗体提供了实验基础。     

利用噬菌体抗体库技术制备抗甲状旁腺激素相关 …

目的 利用噬菌体抗体库技术制备抗甲状旁腺激素相关蛋白（ＰＴＨｒＰ）Ｆａｂ抗体。方法 从经ＰＴＨｒＰ免疫的Ｂａｌｂ／Ｃ小鼠脾细胞提取总ＲＮＡ,用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增一组Ｉｇ轻链和重链Ｆａｂ段基因,插入噬菌体载体ｐＣｏｍｂ３,构建了抗ＰＴＨｒＰ Ｆａｂ抗体基因库。用合成短肽和重组ＰＴＨｒＰ对抗体库进行了富集筛选,获得鼠源抗ＰＴＨｒＰ Ｆａｂ段基因后,进一步在大肠埃希菌表达,并对表达     

人源性抗HBsAg抗体Fab段噬菌体呈现文库的构建、筛选及阳性克隆核苷酸序列测定

目的:构建一个经HBsAg主动免疫的人lgG1抗体噬菌体展示文库,通过特异的淘筛(panning)获得与HBsAg有较高亲和力的Fab抗体,并测定其编码序列。方法:从一经乙肝疫苗免疫的自愿者的外周血分离淋巴细胞提取RNA,逆转录合成cDNA。PCR扩增重链Fd和κ轻链cDNA。依次将PCR产物克隆进载体pComb3H相应的位点,构建成噬菌体呈现库,并以HBsAg包被的96孔板对抗体库进行3轮淘筛,将所获克隆分别与HBsAg进行ELISA反应,挑取显色大于对照20倍以上的阳性克隆进行DNA测序。结果:lgG1的Fd段和κ轻链cDNA得到扩增,构建了一实际库容量为1.8×10⁵的噬菌体呈现文库。通过特异性淘筛,获得与HBsAg有较高新合力的3株Fab抗体并测定其编码序列。DNA序列测定结果表明,3株抗体中两株的Fd段完全一样,且3株的轻链完全一样。结论:成功构建了一个经HBsAg抗原免疫的人源抗体Fab段噬菌体抗体库,筛选得到了3株特异性抗体的Fab片段。     

人源抗人免疫缺陷病毒1型噬菌体抗体库的构建及筛选

目的构建人免疫缺陷病毒１型（ＨＩＶ－１）特异性噬菌体抗体库，制备人源抗ＨＩＶ－１ｇｐ１２０单克隆抗体。方法以半巢式聚合酶链反应（ＰＣＲ）从ＨＩＶ－１感染者外周血单个核淋巴细胞中扩增抗体重链Ｆｄ和轻链（ｋ）基因，与噬菌体载体ｐＣｏｍｂ３连接，构建噬菌体抗体Ｆａｂ组合文库。对抗体库进行３轮吸附－洗脱－扩增的亲和选择后，以ＥＬＩＳＡ法筛选抗ＨＩＶ－１ｇｐ１２０噬菌体抗体，并进行ＤＮＡ序列分析和Ｆａｂ的可溶性表达。结果半巢式ＰＣＲ有效地扩增出Ｆｄ和ｋ基因，以此构建成容量为１９５×１０７的噬菌体抗体库。３轮亲和选择使特异性抗体得到高度富集，抗ＨＩＶ－１ｇｐ１２０噬菌体抗体阳性克隆占３２％。对一阳性克隆抗体基因ＣＨ１和ＣＬ部分ＤＮＡ序列进行了测定，并在大肠杆菌表达出可溶性Ｆａｂ。结论抗ＨＩＶ－１特异性噬菌体抗体库的构建和人源抗ＨＩＶ－１ｇｐ１２０单克隆抗体的制备为今后筛选抗ＨＩＶ中和抗体奠定了基础，具有重要的应用价值。