隐睾发生过程中DNA甲基化状态和甲基化转移酶表达的实验研究

目的研究环境内分泌干扰物邻苯二甲酸二（2-乙基已基）酯[Di—（2-ethylhexy）phthalate,DEHP]作用于孕鼠后,胎鼠睾丸组织基因组DNA甲基化水平的变化及3种DNA甲基化转移酶的表达情况;探讨DEHP所致表观遗传修饰改变在睾丸下降过程中的作用。方法妊娠昆明小鼠（KMmice）随机分为3组,即正常对照组、玉米油对照组和DEHP实验组,每组15只。玉米油对照组和DEHP实验组自妊娠第12．5天到妊娠第18．5天分别持续经口予以玉米油和DEHP,用量按每日500mg／kg,正常对照组不予灌药。采用高效液相色谱仪检测基因组DNA甲基化水平,实时荧光定量PCR检测3种DNA甲基化转移酶的表达量。结果正常对照组和玉米油对照组DNA甲基化水平和3种甲基化转移酶的表达均无统计学意义（P〉0．05）：DEHP实验组DNA甲基化水平比对照组增高约10％。与对照组相比,差异有显著统计学意义（P〈0．05）;实验组3种甲基化转移酶的表达量均比对照组高,与对照组相比,差异有显著统计学意义（Dnmt1,P〈0．05;Dnmt3a,P〈0．01;Dnmt3b,P〈0．05）。结论环境内分泌干扰物DEHP通过影响3种甲基化转移酶的表达而导致基因组DNA甲基化水平升高,从而抑制睾丸下降过程中多种基因的表达,发生隐睾。DNA甲基化等表观遗传学修饰的改变可能是DEHP诱发隐睾的分子机制之一。     

环境内分泌干扰因子DEHP与隐睾发病相关性的实验研究

目的　探讨邻苯二甲酸二异辛酯 (DEHP)诱导KM小鼠隐睾发生的作用及致病机制。方法　以己烯雌酚 (Diethylstilbestrol,DES)为阳性对照 ,孕鼠在妊娠期第 12d至分娩后第 3d每日灌胃给药DEHP ,分为低剂量组、高剂量组 ,观察雄性仔鼠隐睾发生情况及睾丸形态、组织学改变 ;应用免疫组织化学方法检测睾丸雌激素受体和雄激素受体的表达水平 ,应用放射免疫测定法测定仔鼠血清睾酮、雌二醇、卵泡刺激素和黄体生成素水平。结果　随给药剂量的增大 ,孕鼠未出现明显毒性反应 ,而雄性仔鼠隐睾发生率明显增高 ;隐睾鼠的睾丸、附睾重量及睾丸体积较非隐睾鼠明显降低 ,光镜和电镜下隐睾曲细精管上皮和间质细胞均出现明显异常和超微结构改变 ;同时雄性仔鼠血清睾酮、黄体生成素水平降低 ,卵泡刺激素水平增高 ,雌激素受体表达水平降低。结论　在雄性小鼠性分化的关键时期 ,DEHP可导致其隐睾发生 ,其发生率与剂量存在一定的相关性 ,其作用机制尚需进一步研究。     

DEHP诱导的隐睾鼠胰岛素样因子3基因CpG岛甲基化状态研究

目的 研究胰岛素样因子3(insulin-like factor 3,INSL3)基因在邻苯二甲酸二已酯(DEHP)致小鼠隐睾中DNA甲基化的状态.方法 运用"MethPrimer"软件对INSL3基因进行分析.预测CpG岛,通过甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MS-PCR)检测INSL3基因CpG岛的甲基化状况,并应用RT-PCR检测INSL3基因在正常组与实验组睾丸组织中的表达情况.结果实验组INSL3基凶第一外显子区存在CpG岛甲基化;实验组INSL3基因mRNA表达显著下降.结论 INSL3基因第一外显子区CpG岛的异常甲基化导致INSL3在隐睾鼠睾丸中表达降低,可能与隐睾的发生密切相关.     

叶酸缺乏孕鼠子代脑组织DNA甲基化水平的变化

目的 :探讨叶酸缺乏对胎鼠宫内脑发育的影响 ,研究叶酸缺乏孕鼠子代脑组织基因组DNA甲基化水平的改变 ,为叶酸缺乏造成脑发育障碍提供分子和细胞水平的依据。方法 :雌性SD大鼠实验组 30只、对照组 2 0只 ,分别饲以不含叶酸和含 2mg叶酸 kg的纯合饲料 ,两周后与雄鼠交配 ,于怀孕第 2 0天对孕鼠剖腹取胎。对模型进行评价并观察叶酸缺乏对胎鼠发育的影响 ,高效液相色谱法检测胎鼠脑组织基因组DNA甲基化水平。对孕鼠妊娠晚期末血清叶酸、胎鼠血清叶酸及胎鼠脑组织DNA甲基化水平作相关分析。结果 :1 实验组孕鼠交配前及妊娠晚期末血清叶酸均明显低于对照组 ,外周血出现多分叶核粒细胞。实验组胎鼠血清叶酸也明显低于对照组 ,出现巨幼红细胞 ,RBC和Hb均低于对照组 ,且伴有宫内生长限制。 2 实验组胎鼠脑组织基因组DNA甲基化水平低于对照组 ,这种改变与孕鼠及胎鼠本身的血清叶酸浓度呈正相关。结论 :1 交配前两周开始限食叶酸直至妊娠期结束 ,所建立的叶酸缺乏孕鼠动物模型处于叶酸缺乏第三阶段 ,其胎鼠宫内生长受限制 ,红细胞出现巨幼变 ,但没有产生神经管闭合的异常。这是较理想的妊娠中晚期叶酸缺乏的大鼠动物模型。 2 母体叶酸缺乏时胎鼠的脑组织基因组DNA甲基化水平降低 ,这种改变与孕鼠及胎鼠本身的     

生命早期营养影响远期健康的表观遗传机制

生命早期在分子和细胞水平发生的事件可导致婴儿终身表型改变,其分子机制是染色质的表观遗传修饰,它改变了基因的表达和随后的表型.表观遗传改变是指在没有细胞核DNA序列改变的情况下,基因功能可逆、可遗传性改变.基因组含有两种遗传信息:一种是DNA序列所提供的遗传信息;另一种是表观遗传信息,比如DNA甲基化、组蛋白共价修饰、非编码RNA及基因组印记等.研究较多的表观遗传调节包括:胞嘧啶DNA甲基化、组蛋白修饰、基因组印记、非编码RNA调控、染色质重塑等.从表观遗传学角度认识生命早期营养对远期健康的影响具有深远意义,本文对此进行综述.     

叶酸缺乏孕鼠子代脑组织DNA甲基化水平的变化

目的：探讨叶酸缺乏对胎鼠宫内脑发育的影响，研究叶酸缺乏孕鼠子代脑组织基因组DNA甲基化水平的改变，为叶酸缺乏造成脑发育障碍提供分子和细胞水平的依据。方法：雄性SD大鼠实验组30只、对照组20只，分别饲以不含叶酸和含2mg叶酸/kg的纯合饲料，两周后与雄鼠交配，于怀孕第20天对孕鼠剖腹取胎。对模型进行评价并观察叶酸缺乏对胎鼠发育的影响，高效液相色谱法检测胎鼠脑组织基因组DNA甲基化水平。对孕鼠妊娠晚期末血清叶酸、胎鼠血清叶酸及胎鼠脑组织DNA甲基化水平作相关分析。结果：1．实验组孕鼠交配前及妊娠晚期末血清叶酸均明显低于对照组，外周血出现多分叶核粗细胞。实验组胎鼠血清叶酸也明显低于对照组，出现巨幼红细胞，RBC和Hb均低于对照组，且伴有宫内生长限制。2．实验组胎鼠脑组织基因组DNA甲基化水平低于对照组，这种改变与孕鼠及胎鼠本身的血清叶酸浓度呈正相关。结论：1．交配前两周开始限食叶酸直至妊娠期结束，所建立的叶酸缺乏孕鼠动物模型处于叶酸缺乏第三阶段，其胎鼠宫内生长受限制，红细胞出现巨幼变，但没有产生神经管闭合的异常。这是较理想的妊娠中晚期叶酸缺乏的大鼠动物模型。2．母体叶酸缺乏时胎鼠的脑组织基因组DNA甲基化水平降低，这种改变与孕鼠及胎鼠本身的血清叶酸浓度呈正相关，可能是母体叶酸缺乏时胎鼠脑发育障碍的机制之一。3．受孕前后增补叶酸宜延长至妊娠结束，以减少不良妊娠结局的危险。     

不同缝线行睾丸固定复位术对隐睾模型大鼠生精能力的影响

目的建立内分泌型双侧隐睾大鼠模型,通过手术复位睾丸,检测、对比应用不同缝线固定睾丸对隐睾模型大鼠生精能力的影响。方法取孕SD大鼠10只,自然分娩产仔鼠,随机选取新生雄性仔鼠40只为正常对照组,并选取80只为双侧隐睾模型组。双侧隐睾模型组大鼠从出生第3天起皮下注射17-β雌二醇,第26天观察双侧睾丸均未降入阴囊内为隐睾模型制作成功。将双侧隐睾大鼠随机分为1号丝线手术组(采用1号丝线固定睾丸)和6-0可吸收线手术组(采用6-0可吸收线固定睾丸),各40只。于日龄45 d、56 d时采集血清后处死。采用ELISA间接法测定其血清抗精子抗体(AsAb)水平。睾丸切片苏木精-伊红染色光镜下观察曲细精管生育力指数(TFI)、平均曲细精管直径(MTD)。结果 1号丝线手术组隐睾大鼠45 d、56 d时TFI、MTD水平均低于6-0可吸收线手术组(Pa<0.05);45 d、56 d时1号丝线手术组大鼠血清AsAb IgG、IgA、IgM水平均显著高于6-0可吸收线手术组(Pa<0.01)。结论采用6-0可吸收线固定睾丸可以减少AsAb的产生。     

不同日龄隐睾复位大鼠睾丸组织结构观察

目的 观察不同13龄隐睾复位大鼠睾丸组织结构的变化.方法 72只21 d雄性SD大鼠随机分为单侧隐睾组、双侧隐睾组、假手术对照组各24只.建立单、双侧隐睾动物模型.2周后行隐睾大鼠睾丸下降固定术,于日龄40、60 d处死取睾丸,采用苏木素.伊红染色光镜下观察各组大鼠精曲小管生育力指数(TFI)和平均精曲小管直径(MTD);生物素-dUTP/酶标亲和素法(TUNEL法)检测睾丸生殖细胞凋亡情况.结果 隐睾侧睾丸MTD、TFI显著低于阴囊内睾丸,而隐睾生殖细胞凋亡指数(AI)明显增高于阴囊内睾丸(P＜0.05);单侧隐睾组阴囊内睾丸TFI低于相应日龄的假手术对照组,但无统计学意义(P＞0.05).40 d时单侧隐睾组隐睾侧睾丸生殖细胞AI较双侧隐睾组低(P＜0.05),日龄60 d,各组隐睾侧睾丸AI较40 d时明显降低(P＜0.05),但单侧隐睾和双侧隐睾AI比较无统计学差异(P＞0.05).结论 实验隐睾复位大鼠睾丸AI升高,同时单侧隐睾鼠对侧睾丸组织存在不同程度的损害.随着复位时间的延长,隐睾组织的病理损害有恢复的趋势.     

孕期甲基供体营养素与子代DNA甲基化关系的研究进展

孕期的营养对子代的健康起着非常重要的作用。叶酸、维生素B_(12)、胆碱、甜菜碱和蛋氨酸等营养素作为甲基基团供体直接影响DNA的甲基化,与子代健康关系密切。作为表观遗传学的重要组成部分之一,DNA甲基化在维持正常细胞功能、调节基因表达以及胚胎发育过程中起着重要作用。近年来的研究表明孕期营养可通过改变基因组DNA和/或特定基因启动子区域甲基化水平,进而对子代健康造成深远的影响。因此,该文就孕期甲基供体营养素对DNA甲基化的影响,从分子水平探讨其对子代健康的作用。     

大鼠隐睾、隐睾下降固定对生殖细胞发育、凋亡影响的实验研究

目的　探讨大鼠隐睾、隐睾下降固定对生殖细胞发育、凋亡的影响。方法　 6 8支SD雄性大鼠 ,分为三组 :隐睾组 (5 2 ) ;隐睾下降固定组 (8)及对照组 (8)。于日龄 2 2d时复制单侧隐睾模型 ,一部分于单侧隐睾模型术后 14d复制隐睾下降固定模型。采用生物素 dUTP/酶标亲和素测定法检测睾丸生殖细胞凋亡。结果　 1.单侧隐睾模型术后第 13d内隐睾侧睾丸生殖细胞凋亡指数随时间的延长而增加 ;从术后第 4天起 ,与自身对侧正常睾丸 (4.8± 0 .9) %相比 ,隐睾侧睾丸 (11.2±3.6 ) %发生凋亡的生殖细胞数显著增加 (P <0 .0 1)。 2 .与隐睾组 (47.5± 8.6 ) %相比 ,隐睾下降固定组 (6 .2± 1.8) %发生凋亡的生殖细胞数显著降低 (P <0 .0 1)。结论　 1.大鼠隐睾模型建立术后13d内隐睾侧睾丸生殖细胞凋亡指数随时间的延长而增加 ;2 .在日龄 36d时隐睾下降固定能使大鼠隐睾恢复正常的生精功能 ;3.隐睾患儿应及早施行睾丸下降固定术 ,可以恢复其生育能力。     

Phenobarbital-induced alterations in the sexual differentiation of the female rat: reversal by hydroxyurea and cycloheximide

The possible mechanism of action of phenobarbital in prenatal female rats has been studied using different inhibitors of protein/DNA/RNA synthesis. Administration of phenobarbital (40 mg/kg/day) subcutaneously from day 17 to day 20 of pregnancy resulted in a delay of the onset of puberty, disorders of estrous cycle, infertility, and high estrogen levels in the female offspring. Cycloheximide (60 microg/kg/day)--a protein synthesis inhibitor and hydroxyurea (160 mg/kg/day)--a DNA synthesis inhibitor when combined with phenobarbital, significantly reduced the incidence of reproductive dysfunctions listed above. Alpha-amanitin (15 microg/kg/day), an inhibitor of m-RNA synthesis, produced reproductive disorders in the female offspring when administered alone to pregnant rats and also failed to reverse the PB-induced reproductive alterations. Cycloheximide and hydroxyurea produced no effect upon reproductive function when administered alone. Cycloheximide administration resulted in low body weight at birth and delayed eye opening. These results suggest that prenatal administration of phenobarbital produces its effect via new protein synthesis and that cycloheximide and hydroxyurea protect the offspring from phenobarbital-induced toxic effects by inhibiting its biochemical action.     

Regional Brazilian diet-induced low birth weight is correlated with changes in renal hemodynamics and glomerular morphometry in adult age

Number of nephrons, renal hemodynamics, and glomerular morphometry were assessed in rats submitted to a multideficient diet which was developed from a basic regional diet consumed in a Brazilian region of sugarcane cultivation. We evaluated three groups of male Wistar rat offspring: (1) from dams fed a standard diet throughout mating, pregnancy and lactation (control group) and (2) from dams fed the multideficient diet during mating and pregnancy (MalN1 group) or (3) throughout mating, pregnancy, and lactation (MalN2 group). At adult age, the animals were anesthetized to measure mean arterial blood pressure and renal hemodynamics. The MalN1 group, as compared with the control group, showed unaltered body and kidney weights, nephron deficiency, a high mean arterial blood pressure, glomerular hypertrophy, and renal vasoconstriction. The MalN2 group showed the same nephron deficiency and mean arterial blood pressure levels as the MalN1 group. These animals exhibited lower body and kidney weights and no glomerular hypertrophy. In conclusion, the alterations induced by intrauterine malnutrition are compatible with the development of chronic renal failure.     

胚胎期铅暴露对子代大鼠运动协调能力的影响及可能机制

目的探讨胚胎期铅暴露对子代大鼠运动协调能力的影响及可能机制。方法采用Sprague-Dawley大鼠孕期自由饮用0.1%(低剂量铅暴露组)和0.2%(高剂量铅暴露组)醋酸铅溶液的方法建立胚胎期铅暴露模型,并设空白对照组。将各组母鼠娩出的雄性仔鼠纳入研究,其中空白对照组12只,低剂量铅暴露组10只,高剂量铅暴露组9只。应用转体实验和衣架实验观察仔鼠运动、协调能力;各组随机取8只大鼠,应用免疫组化、改良Timm's染色法分别观察各组大鼠海马c-Fos蛋白表达及苔藓纤维发芽(MFS)情况。结果高剂量铅暴露组转体时间长于正常对照组和低剂量铅暴露组(P0.05),低剂量铅暴露组转体时间亦长于正常对照组(P0.05)。高剂量铅暴露组平衡运动得分低于正常对照组和低剂量铅暴露组(P0.05),低剂量铅暴露组平衡运动得分亦低于正常对照组(P0.05)。高剂量铅暴露组海马CA1区c-Fos阳性细胞面积百分比高于正常对照组和低剂量铅暴露组(P0.05),低剂量铅暴露组c-Fos阳性细胞面积百分比亦高于正常对照组(P0.05)。高剂量铅暴露组CA3区及齿状回MFS的半定量评分均高于正常对照组和低剂量铅暴露组(P0.05);低剂量铅暴露组CA3区及齿状回MFS的半定量评分亦高于正常对照组(P0.05)。结论胚胎期铅暴露损害子代大鼠运动协调能力,该变化可能与海马CA1区c-Fos蛋白表达增加及海马CA3区、齿状回发生异常MFS有关。     

Pregnancy outcome in the Psammomys obesus gerbil on low- and high-energy diets

INTRODUCTION: Diabetes mellitus (DM) during pregnancy is associated with an increased risk for poor reproduction and a high rate of congenital malformations. The gerbil Psammomys obesus is a unique model for nutritionally induced Type 2 DM (T2DM) that enabled us to study the outcome of uncontrolled T2DM during pregnancy. METHODS: Female Psammomys on low-energy (LE) or high energy (HE) diet were studied. The blood glucose levels and weights of pregnant animals were determined. The offspring from the different groups were followed-up to weaning. RESULTS: Most of the HE-diet animals were diabetic (77%). There were no differences in the pregnancy rates in animals on both diets (32.7% in HE vs. 38.3% in LE). Pregnancy of the HE-diet group was longer than the LE-diet group (26.7 vs. 26.1 days), and litter average was reduced (2.7 vs. 3.0). At birth, the offspring of the HE-diet dams weighed less (5.2 vs. 7.2 g) and had smaller crown rump length (4.0 vs. 4.6 cm) These offspring also presented a 1-3 days delay in neuro-developmental parameters (first turn over, hair appearance, eye-opening and response to noise). However, from the fourth week of life they became diabetic, and from the third week they weighed more than the LE offspring. CONCLUSION: HE-diet caused diabetes, maternal complications and altered reproduction in Psammomys animals. The offspring of diabetic Psammomys presented birth weight and length changes as well as developmental delay.     

母亲孕期补充叶酸与其子女孤独症谱系障碍发病风险的Meta分析

目的定量综合分析母亲孕期补充叶酸与其子女孤独症谱系障碍(ASD)发病风险的相关性。方法计算机全面检索PubMed、Embase、Scopus、Corchrane Liabrary、EBSCO、中国知网、万方、维普及中国生物医学文献数据库等电子数据库,收集有关母亲孕期叶酸补充与儿童ASD发病风险的文献,以OR及其95%CI为合并效应量,运用Stata 12.0软件进行Meta分析,并进行发表偏倚评估和敏感性分析。结果根据纳入及排除标准共纳入10篇文献,包含15项研究,累计病例4 459例,对照1 225 835例。Meta分析结果显示,总体人群中母亲孕期补充叶酸可显著降低其子女ASD发病风险(OR=0.798,95%CI:0.669~0.952,P=0.012)。亚组分析结果显示,亚洲人群中母亲孕期补充叶酸可能与其子女ASD发病风险降低有关(OR=0.664,95%CI:0.428~1.032),但未达到统计学意义(P=0.069);西方人群中母亲孕期补充叶酸可降低其子女ASD发病风险(OR=0.817,95%CI:0.671~0.996,P=0.045)。结论母亲孕期补充叶酸可能可降低其子女ASD发病风险,在西方人群中效果较明显。     

邻苯二甲酸二丁酯致雄性仔鼠肛门直肠畸形与相关基因表达的研究

目的 邻苯二甲酸二丁酯(di-n-butyl phthalate,DBP)孕晚期染毒诱导子代雄性大鼠发生肛门直肠畸形(anorectal malformations,ARMs),探讨形态学变化及相关基因的表达.方法 孕鼠20只,随机分为两组,在怀孕天数第12～18天,每日分别给予DBP及大豆油850mg/kg灌胃.出生后(PND)1d统计雄性仔鼠肛门闭锁发生率,测量雄性仔鼠体重和肛门生殖器距离(AGD),观察肛门闭锁雄性仔鼠末端直肠及肛周病理学改变.Real-time PCR法检测雄性仔鼠末端直肠组织中Shh、Gli2、Gli3、Bmp4、Wnt5a、Hoxa13、Hoxd13、Fgf10、Fgfr2基因mRNA的表达水平.结果 与对照组相比,DBP染毒组母鼠孕期体重增量减少,孕期延长,仔鼠产量降低(P＜0.05),PND 1d肛门闭锁雄性仔鼠体重及AGD较对照组明显降低(P＜0.05).染毒组雄性仔鼠肛门闭锁发生率大约为39.5％.肛门闭锁雄性仔鼠PND1末端直肠及肛周组织病理显示典型的ARMs.与对照组相比,肛门闭锁雄性仔鼠PND1末端直肠中Shh、Gli2、Gli3、Bmp4、Wnt5a、Hoxa13、Hoxd13、Fgf10、Fgfr2的mRNA表达水平较对照组也明显降低(P＜0.05).结论 DBP孕晚期染毒能明显诱导雄性仔鼠ARMs发生,并对其生长发育具有不良影响,其末端直肠组织中与肛门直肠分化发育相关的基因Shh、Gli2、Gli3、Bmp4、Wnt5a、Hoxa13、Hoxd13、Fgf10、Fgfr2的mRNA的表达水平降低可能促进ARMs的发生.     

Long-term effects of maternal diabetes on vascular reactivity and renal function in rat male offspring

Fetal growth impairment can occur in pregnancy complicated by diabetes. Although several studies have focused the effects of nutritional status on intrauterine development, the long-term impact of maternal diabetes on vascular and renal function in the offspring is poorly investigated. In the present study, blood pressure profiles and renal function parameters were investigated in the offspring of diabetic rats (DO). Female rats were made diabetic throughout gestation with a single dose of streptozotocyn (STZ) 10 d before mating. After weaning, the offspring had free access to food and water. Arterial pressure was evaluated every 15 d. Functional and morphometric kidney studies were performed in newborn, 3, 6 and 12-mo-old male rats in DO and in controls, C. Although maternal diabetes did not affect nephron number in the young adult rat, glomerular hypertrophy developed from 3 mo on. Glomerular Filtration Rate and Renal Plasma Flow were observed to be significantly decreased in DO when compared with C, from 3 mo on. In DO, hypertension was observed from 8 wk on and persisted elevated throughout the experimental period (12 mo). Vascular reactivity, evaluated in mesenteric arterial bed showed a decreased endothelium-dependent vasodilatation in 12-mo-old DO animals, while preserved response to sodium nitroprusside was demonstrated. Our data show that exposure to intrauterine diabetes induced by STZ does not affect nephron number in the young offspring but can cause permanent changes in Nitric Oxide (NO)-related vascular response, which, in turn may accelerate the natural age-related nephron loss.