乙型肝炎病毒X基因对肝细胞凋亡的影响及其作用机制

乙型肝炎病毒X基因（HBx）在HBV慢性感染导致肝硬化，原发性肝癌（HCC）的发生过程中，起着重要的作用。X连锁凋亡抑制因子（XIAP）为凋亡抑制蛋白（IAPs）家族成员，是一种强效的凋亡抑制蛋白，可以抑制半胱氨酸蛋白酶活性，阻断细胞凋亡过程。我们观察了肝癌细胞株以及正常肝细胞株在转染HBx前后凋亡抑制蛋白XIAP表达的差异，了解和分析HBx对不同肝细胞系细胞凋亡的作用及其是否与凋亡抑制蛋白XIAP基因相关。     

乙型肝炎病毒X基因下调miR-192对人肝癌细胞株HepG2凋亡的影响

目的 探讨乙型肝炎病毒X基因(HBx)通过调节人肝癌细胞株HepG2中miR-192的表达而抑制其凋亡的机制.方法 设立3个细胞组:稳定转染HBx基因的HepG2细胞(HepG2/HBx),稳定转染空载体pcDNA3.1的HepG2细胞(HepG2/pcDNA3.1)以及未作转染的HepG2细胞.用流式细胞术分析3个细胞组的凋亡率差异,用Taqman探针荧光定量PCR检测3组细胞中miR-192的表达水平.转染miR-192后,用流式细胞术检测HepG2细胞凋亡率的变化,同时用SYBR Green荧光定量PCR和Western blot检测细胞中p53、PUMA表达的变化.计量资料均数的比较用单因素方差分析.结果 HepG2/HBx细胞的凋亡率为2.37％±0.35％,较HepG2/pcDNA3.1、HepG2细胞(11.46％±0.69％、12.50％±0.66％)明显降低(F=171.722,P＜0.01).miR-192表达在HepG2/HBx细胞中为49.1％±5.9％,较HepG2/pcDNA3.1、HepG2细胞(98.0％±8.9％,100％)也明显下调(F=14.319,P＜ 0.05).转染miR-192后HepG2细胞的凋亡率(15.74％±1.17％)较转染相应阴性对照的HepG2细胞的凋亡率(10.74％±1.15％)显著升高(F=18.415,P＜0.05),同时,p53、PUMA基因在mRNA (953:1.68±0.12比0.90±0.09,F=43.115,P＜0.05 ; PUMA:1.66±0.10比0.98±0.06,F=22.541,P＜0.05)和蛋白质水平(p53:3.07比1,PUMA:2.13比1)的表达均显著上升.结论 miR-192促进HepG2细胞凋亡,HBx通过下调miR-192抑制HepG2细胞凋亡.     

乙型肝炎病毒X基因与肝细胞凋亡

乙型肝炎病毒X基因(HBX)对病毒在体内生成必不可少,HBX广泛参与病毒复制、反式激活作用、肝细胞生长、凋亡、癌变过程,成为当前研究的热点课题,本文对HBX与肝细胞凋亡方面的进展作一综述.     

中老年肝细胞癌患者乙型肝炎病毒X基因检测与分析

目的检测慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染后肝细胞癌(HCC)患者血清HBVX基因,并与慢性乙型肝炎、肝硬化患者HBVX基因检出率对比分析。方法在微孔板上包被HBVX基因片段的捕获探针;PCR扩增被检标本中目的片段,其引物用Bio-Ⅱ-dUTP修饰,在微孔板上杂交后用链霉亲和素碱性磷酸酶系统显色。结果该方法检测HBVX基因灵敏,特异;乙型肝炎后HCC患者HBVX基因检出率明显高于慢性乙型肝炎组和肝硬化组。结论检测HBVX基因对HCC具有辅助诊断价值。     

乙型肝炎病毒X基因转染人肝细胞致裸鼠的成瘤实验

目的 拟在裸鼠体内证实HBV X基因能否转化人肝细胞形成移植瘤.方法 利用高表达HBx基因的pCMVX/QSG7701细胞株作为实验组,以表达空白质粒的pRcCMV2/QSG7701细胞株和QSG7701细胞株为对照组接种于裸鼠皮下,观察裸鼠能否成瘤.HE染色、显微镜检查研究移植瘤的组织形态学特征.成瘤率的比较采用Fisher's精确检验.结果 接种pCMVX/QSG7701细胞株的所有6只裸鼠在第2周开始均出现移植瘤生长,周围器官和组织未发现转移灶.对照组至接种后第35天无移植瘤生长(X2-16.505,P＜0.01).HE染色证实移植瘤为肝细胞痛组织.结论 HBV X基因表达可以直接导致肝细胞癌变.     

乙型肝炎病毒Ⅱ型与肝细胞癌

调查了237例肝细胞癌(HCC)患者血清中感染乙型肝炎病毒(HBV)的状态,其中152例(64.14%)HBs Ag阳性,并揭示HCC患者血清中存在HBV_2感染的血清学模式,即HBsAg阳性而抗-HBc阴性,占HBsAg阳性HCC患者的10.53%(16/152)。占所有HCC患者的6.75%(16/237)。应重视对HBV_2感染的防治。     

乙型肝炎病毒X蛋白在肝细胞癌发生中的作用机制

HBx蛋白（HBxAg）被认为是乙型肝炎病毒（HBV）致肝细胞癌（HCC）的病毒蛋白,能影响肝细胞的生长、转化、迁移和凋亡以及DNA的修复等过程,己成为近年来研究的热点之一。HBx是一种多功能的病毒蛋白,有转录调控作用,对肝细胞内许多癌基因和／或抑癌基因的表达有直接或间接的影响,在肝癌形成中起重要作用。通过对HBx在肝癌发生、发展中机制的深入研究,有望在HCC防治方面开辟新途径。     

乙型肝炎病毒Ⅹ蛋白对原代小鼠肝细胞周期的影响

目的 探讨HBV复制过程中HBx蛋白对原代小鼠肝细胞周期的影响. 方法 采用原代小鼠肝细胞为研究系统,用野生型HBV质粒(pHBV)和HBx蛋白表达缺失的HBV质粒(pHBV△X)分别转染细胞.Western blot检测细胞周期蛋白cyclin D1、cyclin E、cyclin A及细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子p16 (p16)、p21的表达水平;实时荧光定量PCR和Southern blot检测HBVDNA复制水平.两组之间比较用两样本均数t检验,多样本均数间的比较用方差分析及q检验. 结果 新分离肝细胞和原代培养24、48、72 h肝细胞的细胞周期蛋白表达水平无明显差异;转染48 h后,pHBV组细胞与pHBV△X组细胞周期蛋白条带灰度值相比,前者cyclin D1、p21、cyclin E表达量较高,p16的表达量较低,统计量t值分别为15.713,22.897,14.680,-19.584,P值均＜0.05.培养72 h后提取HBV DNA,Southem blot检测HBV DNA复制中间体松散环状DNA、双链线性DNA、单链DNA的水平,经条带灰度扫描,pHBV组的水平(分别为3288.336±448.011、6458.318±182.163、2760.613±393.561)明显高于pHBV△X组(分别为515.721±62.530、2122.228±28.347、1632.013±207.021)及空白对照组,P值均＜0.05;实时荧光定量PCR检测HBV DNA复制水平,pHBV组[每个细胞(987.50±47.80)拷贝]也明显高于pHBV△X组[每个细胞(303.67±33.94)拷贝],t=20.203,P＜0.05.结论 HBx蛋白能通过调节细胞周期中各蛋白的表达,使细胞由静止期(G0)进入DNA合成前期(G1)并停滞于G1期,从而促进HBV的复制.     

乙型肝炎病毒X基因转化人肝细胞QSG7701的体外观察

目的 观察HBV X基因多功能蛋白(HBx)的表达对QSG7701细胞生物学特征的影响及对其的转化作用.方法 采用脂质体法分别将重组质粒pCMV/X及真核表达质粒pRe/CMVZ稳定转染QSG7701细胞,分别获得pCMV X/QSG7701、pReCMV2/QSG7701,设未转染的QSG7701细胞为对照组.Western印迹检测细胞中HBx、c-Myc及Bel-2蛋白的表达,MTT比色法、流式细胞技术、软琼脂克隆形成率实验检测细胞的生物学活性.结果HBx高表达于pCMV X/QSG7701中.pCMV X/QSG7701中c-Mye蛋白的表达水平较其他两组高,Bcl-2蛋白在3组细胞中均有表达,但表达水平差异无统计学意义.在pCMV X/QSG7701、pRcCMV2/QSG7701及未转染的QSG7701 3组细胞中,pCMV X/QSG7701组s期细胞所占百分比较后两组明显增加[分别为(28.80±2.32)%、(15.50+2.64)%、(21.50±3.66)%,LSD 0.05=3.95%,LSD 0.01=5.47%,P<0.01],其G1期细胞所占百分比较后两组明显减少[分别为(62.30±3.85)%、(78.70±4.12)%、(78.105=4.45)%,LSD 0.05=5.63%,LSD 0.01-7.79%,P<0.01],其凋亡率明显高于后两组[分别为(14.90+11 01)%、(8.91±0.48)%、(4.03±0.47)%,LSD 0.05=0.94%,LSD 0.01=1.31%,P<0.01],其细胞株的倍增时间较后两组明显缩短(分别为14 h,29 h,38 h),其软琼脂克隆形成率明显高于后两组[分别为(19.83±1.96)%,(1.764±0.03)%,(1.33±0.18)%,LSD 0.05=1.53%,LSD 0.01=2.11%,P<0.01].结论 HBx能够在体外转化人源性非瘤性肝细胞QSG7701,使细胞具有恶性化生长的倾向.     

阿霉素干预下HBX基因对肝细胞凋亡的影响

HBx蛋白具有广泛的反式激活作用，可通过多种复杂的细胞信号传导途径参与细胞凋亡、DNA修复调控，促进细胞周期进程，与HCC的发生、发展具有密切的关系。我们采用脂质体转染构建稳定表达HBX的转基因细胞模型L02／HBx，运用流式细胞术观察其细胞周期、增殖及细胞凋亡情况，着重研究阿霉素干预后HBx对肝细胞凋亡的影响，旨在探索HBx致肝细胞恶性转化的分子机制。     

环氧合酶2对胰腺癌细胞凋亡的调节作用及其机制

目的：有研究提示环氧合酶2（COX－2）可能参与了细胞凋亡和增殖平衡的调节过程。该文研究COX－2在胰腺癌细胞凋亡发生过程中的调节作用，并探讨其可能作用机制。方法：应用流式细胞术、DNA梯度电泳和透射电镜，观察选择性COX－2抑制剂Celebrex对胰腺癌细胞PC－3（高表达COX－2）凋亡的影响，并用RT－PCR研究凋亡相关基因bcl-xl、bax、Survivin等表达的变化。结果：100μmol/L Celebrex作用PC-3细胞24h，流式细胞术显示凋亡细胞比例显著升高；DNA电泳见典型梯形条带；透射电镜发现细胞核固缩，表明Celebrex可诱导PC－3细胞凋亡。RT－PCR结果表明，Bax、bcl-xl和Survivin等凋亡相关基因在PC－3细胞高表达，而Celebrex在诱导PC－3细胞凋亡过程中，bax基因的表达无明显变化，但bcl-xl和Survivin基因的表达均显著下调。结论：COX－2对胰腺癌细胞凋亡呈负向调节作用，其机制可能部分通过凋亡抑制基因bcl-xl和Survivin的信号传导而实现。     

Inhibitive effect of cordyceps sinensis on experimental hepatic fibrosis and its possible mechanism

AIM: To investigate the inhibitive effect and its possible mechanism of Cordyceps Sinensis (CS) on CCl4-plus ethanolinduced hepatic fibrogenesis in experimental rats.METHODS: Rats were randomly allocated into a normal control group, a model control group and a CS group. The latter two groups were administered with CCl4 and ethanol solution at the beginning of the experiment to induce hepatic fibrosis. The CS group was also treated with CS 10 days after the beginning of CCl4 and ethanol administration. All control groups were given corresponding placebo at the same time. At the end of the 9th week, rats in each group were humanely sacrificed. Blood and tissue specimens were taken.Biochemical, radioimmunological, immunohistochemical and molecular biological examinations were used to determine the level change of ALT, AST, HA, LN content in serum and TGFβ1, PDGF, collagen Ⅰ and Ⅲ expression in tissue at either protein or mRNA level or both of them.RESULTS: As compared with the model control group,serum ALr, AST, HA, and LN content levels were markedly dropped in CS group (86.0±34.4 vs224.3±178.9, 146.7±60.2vs272.6±130.1, 202.0±79.3 vs316.5±94.1 and 50.4±3.0vs 59.7±9.8, respectively, P＜0.05). Tissue expression of TGFβ1 and its mRNA, collagen I mRNA were also markedly decreased (0.2±0.14 vs1.73±1.40, 1.68±0.47 vs3.17±1.17,1.10±0.84 vs 2.64±1.40, respectively, P＜0.05). More dramatical drop could be seen in PDGF expression (0.87±0.43vs1.91±0.74, P＜0.01). Although there was no statistical significance, it was still strongly suggested that collagen Ⅲ mRNA expression was also decreased in CS group as compared with model control group (0.36±0.27 vs0.95±0.65,P=0.0615). In this experiment, no significant change could be found in PDGF mRNA expression between two groups (0.35±0.34 vs 0.70±0.46, P＞0.05).CONCLUSION: Cordyceps sinensis could inhibit hepatic fibrogenesis derived from chronic liver injury, retard the development of cirrhosis, and notably ameliorate the liver function. Its possible mechanism involves inhibiting TGFβ1expression, and thereby, down regulating PDGF expression,preventing HSC activation and deposition of procollagen Ⅰand Ⅲ.     

TRAIL体外诱导人肝星形细胞LX-2 凋亡作用及调控机制

目的研究肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）诱导肝星形细胞凋亡情况及调控机制。方法用RT-PCR检测LX-2中α-SMAmRNA和DR5mRNA的表达;MTT比色法、流式细胞术检测外源性TRAIL对LX-2细胞增殖和诱导细胞凋亡的影响;采用Westernblot检测Bax、Caspase3表达。结果培养的LX-2表达α-SMAmRNA和DR5mRNA逐渐增加,TRAIL可以抑制其细胞增殖,与剂量相关（P〈0.05）。与对照组比较,TRAIL诱导活化的LX-2细胞凋亡明显增加（P〈0.05）,Western blot分析显示TRAIL作用下,LX-2线粒体Bax、细胞质Caspase3表达上调。结论外源性TRAIL可以诱导活化的LX-2凋亡,其机制与DR5及线粒体Bax表达上调有关。     

IGFBPrP1 siRNA诱导的大鼠肝星状细胞凋亡及其机制

目的研究IGFBPrP1 siRNA对大鼠肝星状细胞凋亡的影响,并探讨其可能的机制。方法体外培养大鼠肝星状细胞株（HSC-T6）,分别设立：正常对照组,阴性对照组,IGFBPrP1 siRNA转染组。IGFBPrP1 siRNA转染大鼠肝星状细胞,转染不同时间后,用CCK-8试剂盒检测肝星状细胞增殖的变化,AnnexinV/PI双标法流式细胞术检测肝星状细胞凋亡的变化,免疫细胞化学染色法检测P53及Bcl-2蛋白表达的变化。结果 （1）IGFBPrP1 siRNA转染大鼠肝星状细胞不同时间（24、48、72 h）后,转染组细胞增殖受到抑制且凋亡率明显增高,与正常对照组及阴性对照组相比,差异均有统计学意义（P〈0.01）;（2）IGFBPrP1 siRNA转染大鼠肝星状细胞48 h后,与正常对照组及阴性对照组相比,转染组P53蛋白的表达量显著增高（P〈0.01）;Bcl-2蛋白的表达明显降低（P〈0.01）。结论 IGFBPrP1 siRNA能显著抑制大鼠肝星状细胞增殖且能促进其凋亡;上调P53的表达,下调Bcl-2的表达可能是IGFBPrP1 siRNA诱导大鼠肝星状细胞凋亡的途径之一;推测抑制IGFBPrP1的表达有可能成为治疗肝纤维化的新靶点。     

siRNA抑制survivin基因及其对人肝癌细胞株HepG2细胞凋亡的影响

目的观察特异小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）抑制survivin基因表达对人肝癌细胞株HepG2细胞凋亡的影响。方法构建survivin-siRNA真核表达载体,利用脂质体转染人肝癌HepG2细胞,采用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测survivin基因mRNA表达水平。针对转染后不同的时间点采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测各组细胞的增殖以及HepG2细胞的凋亡情况。结果构建的survivin-siRNA转染组survivin蛋白表达较对照组明显下调,差异有显著性（P〈0.01）,其增殖能力较对照组显著下降（P〈0.001）;而阳性对照组及未转染组对survivin表达及mRNA抑制作用不明显（P=0.219）。结论所构建的针对人survivin-siRNA可显著抑制survivin的表达及HepG2细胞凋亡。     

葛根素抗心肌缺血及其机理的实验研究

自的：探讨葛根素对心肌梗死（MI）犬心的保护作用及其机理。方法：12只犬随机分成葛根素处理组（G组）和对照组（C组），建立急性MI模型，分别给予葛根素和生理盐水，共21d，冠状动脉（冠脉）结扎前、后不同时间点行冠脉造影，术前及术后第22天查11项血液流变学指标，测量梗死面积及心肌血管面密度。结果：①G组梗死面积明显小于C组。②冠脉结扎后2h和22dG组侧支血管明显多于C组。③在MI急性期，血小板聚集性和血粘度较梗死前明显塔高，而葛根素能阻止上述改变。④G组缺血区和梗死区心肌毛细血管和供血血管面密度较C组明显增加。结论：葛根素能促进大冠脉侧支循环的开放和形成，抑制MI后血小板聚集和降低血粘度，改善微循环，对缺血心肌具有保护作用。     

碘油羟基磷灰石纳米微粒对兔VX2肝肿瘤细胞凋亡的影响及机制探讨

目的探讨碘油羟基磷灰石纳米微粒(nHAP)经肝动脉治疗对兔VX2肝肿瘤细胞凋亡的影响及机制。方法100只新西兰白兔肝内肿瘤种植后2周,随机分为5组,每组20只,经肝动脉灌注给药,实验设生理盐水组(A组)、nHAP组(B组)、单纯碘油组(C组)、阿霉素碘油组(D组)及碘油nHAP组(E组)。治疗2周后,流式细胞术检测肝肿瘤组织中细胞凋亡,并利用Western blot检测凋亡抑制相关蛋白XIAP及Survivin的表达。结果流式细胞术检测肝肿瘤组织细胞凋亡结果显示,A组和B组比较无明显差异,C组和D组残余肿瘤区域细胞凋亡率较A组升高(P0.05),而E组细胞凋亡率较C、D两组明显升高(P0.05)。Westernblot结果提示与A组相比,C组和D组残余肿瘤区的XIAP和Survivin表达降低(P0.05),E组XIAP和Survivin蛋白表达较C、D两组降低(P0.05)。结论碘油羟基磷灰石纳米微粒可进一步促进肝脏肿瘤细胞凋亡,这种作用可能与碘油nHAP降低凋亡抑制蛋白XIAP和Survivin表达有关。     

花色苷对小鼠腹腔巨噬泡沫细胞胆固醇外流的影响及其分子机制探讨

目的 研究花色苷对小鼠腹腔巨噬泡沫细胞胆固醇外流的影响,探讨 花色苷抗动脉粥样硬化的分子机制。方法 以50μg／ml氧化型低密度脂蛋白培养小鼠腹腔巨噬细胞24h形成巨噬泡沫细胞。用1、10、100I．Lmol／L矢车菊定-3-葡萄糖苷（Cy-3-g）和芍药定-3-葡萄糖苷（Pn-3-g）分别培养巨噬泡沫细胞,酶学荧光法检测培养液中胆固醇含量,用定量PCR和激光共聚焦显微镜检测三磷酸腺苷结合盒转运体A1（ABCA1）的表达。结果 花色苷Cy-3-g和Pn-3-g能够促进巨噬泡沫细胞胆固醇外流,这一作用存在时间和剂量一依赖关系。花色苷还能促进巨噬泡沫细胞ABCA1 mRNA和蛋白的表达,ABCA1抑制剂4,4’-二异硫氰酸二丙乙烯12,2’-二磺酸能够阻断花色苷诱导巨噬泡沫细胞胆固醇外流。结论 花色苷Cy-3-g和Pn-3-g通过调控ABCA1的表达从而促进巨噬泡沫细胞胆固醇外流。     

瘦素对TRAIL诱导大鼠肝星状细胞凋亡的影响及机制研究

目的：了解瘦素对肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）诱导肝星状细胞（HSC）凋亡的影响及调控机制。方法MTT比色法、流式细胞术检测瘦素对外源性TRAIL诱导HSC-T6细胞增殖和细胞凋亡的影响;采用Western印迹检测信号传导与转录激活因子3（STAT3）、磷酸化STAT3（pSTAT3）、Bcl-2。结果TRAIL抑制HSC-T6细胞增殖、诱导HSC-T6细胞凋亡,而瘦素使TRAIL诱导的HSC-T6细胞凋亡明显减少（P＜0．05）;当TRAIL诱导HSC-T6细胞凋亡时加入瘦素,pSTAT3、Bcl-2表达上调。结论瘦素可以使外源性TRAIL诱导的HSC-T6细胞凋亡减少,可能与瘦素促使STAT3磷酸化,Bcl-2表达上调有关。