抗尖吻蝮蛇蛇毒金属酶类共同基序IgY抗体的制备与研究

[目的]制备针对尖吻蝮蛇蛇毒金属蛋白酶类共同基序的IgY抗体,并对其中和蛇毒活性的作用进行研究.[方法]通过分析尖吻蝮蛇蛇毒各类金属蛋白酶类共有序列,设计合成与其酶活性密切相关且高度保守的抗原肽PT1和PT2;偶联复合物KLH-PT1、KLH-PT2免疫母鸡获得IgY抗体.采用ELISA和Western blot等方法对IgY效价及与尖吻蝮蛇蛇毒和短尾蝮蛇蛇毒的交叉反应特性进行初步研究;最后通过抗小鼠皮下出血实验对IgY中和活性进行评价.[结果]ELISA、Western blot结果表明,抗KLH-PT1、抗尖吻蝮蛇蛇毒IgY均可与尖吻蝮蛇蛇毒、短尾蝮蛇蛇毒发生交叉反应且后者显著强于前者;抗KLH-PT2 IgY在体外与尖吻蝮蛇蛇毒、短尾蝮蛇蛇毒无明显交叉反应,在体内抗出血实验中却表现出很强的中和毒性作用,并且显著优于前两者.[结论]通过设计金属蛋白酶共有序列抗原肽,制备了能与多种血循型蛇毒交叉反应的IgY抗体,这为制备特异、高效、低毒性且广谱的抗出血型蛇毒抗体奠定了基础.     

卵黄中蝮蛇蛇毒抗体对蝮蛇蛇毒毒性成分的中和作用

目的：制备特异性高的蝮蛇蛇毒卵黄抗休事半功倍对其体内保护和体外保护作用进行了研究。方法：用蝮蛇蛇毒作为抗原免疫鸡，使之在蛋黄中产生抗体IgY，然后用聚乙二醇法提取IgY，并通过小鼠体内保护和体外中和试验。研究IgY对蝮蛇蛇毒毒性成分的中和作用。结果：通过本法制得的IgY在体内和体外试验中都能中和蝮蛇蛇毒，对蝮蛇蛇毒急性中毒的小鼠有明显的保护作用。结论：聚乙二醇法从免疫鸡蛋黄中提取的蛇毒抗体IgY，可用于救治蝮蛇蛇毒急性中毒的小白鼠。     

精制抗五步蛇毒血清和抗蝮蛇毒血清对竹叶青蛇毒的中和作用

本文通过琼脂免疫扩散实验表明抗五步蛇毒血清和抗蝮蛇毒血清对竹叶青蛇毒有中和作用，对竹叶青蛇毒的出血毒素及促凝毒性作用两种抗血清均有中和及对抗作用；两种抗血清的混和液对竹叶青蛇毒有协同作用。     

中国福建尖吻蝮蛇蛇毒类凝酶止血作用的实验研究

目的：研究中国福建尖吻蝮蛇蛇毒类凝酶止血作用及其作用机制。方法：用断尾法测小鼠出血时间,观察止血剂量对家兔全血凝固时间及纤维蛋白原含量的影响。结果：蛇毒类凝酶在0．0001－0．0100kU/kg可使小鼠出血时间明显缩短,而当剂量增大到3．0000kU/kg时,则显著延长小鼠出血时间。其0．0004－0．0036kU/kg剂量能使家兔全血凝固时间明显缩短,降低纤维蛋白原的含量。结论：中国福建尖吻蝮蛇蛇毒类凝酶在小剂量时可作为止血药,它可能通过适度降低纤维蛋白原的含量,缩短出凝血时间而发挥其止血作用。     

尖吻蝮蛇蛇毒纤溶酶的分离纯化及氨基酸序列测定

目的:从尖吻蝮蛇蛇毒中分离纯化出高纯度的纤溶酶并对其进行初步性质研究和氨基酸序列分析。方法:采用DEAE-Sepharose FF离子交换和两次Superdex75PG凝胶过滤,从尖吻蝮蛇蛇毒中纯化出可直接溶解纤维蛋白原的蛋白酶。结果:分离到的纤溶酶相对分子质量为25kD,HPLC分析纯度在97%以上,氨基酸序列分析其N末端为MSTEF QRYME IVVNHS MVKKY NGDSD KIKAW。结论:采用此工艺可从尖吻蛇毒中分离出高比活的纤溶酶,为进一步研究其药理作用奠定了基础。     

注射用尖吻蝮蛇血凝酶引起过敏性休克1例

正蛇毒类凝血酶作为一种动物来源的蛋白酶类止血药,由于其毒性低、起效快、药效持久且不引起血管内栓塞等优点,近年来已经引起了人们的极大关注[1]。尖吻蝮蛇血凝酶(Haemo-coagulase Agkistrodon,HCA,商品名苏灵)是一种从尖吻蝮蛇毒液中提取分离出的蛇毒类凝血酶,该类凝血酶具有良好的止血作用[2],用于各种出血、血友病血肿、血小板减少性疾病伴出血症     

精制抗蝮蛇和抗五步蛇毒血清对烙铁头蛇毒毒性成份的中和效应

本文通过交叉免疫反应与毒素中和实验，利用抗原抗体中和反应原理，进一步证明精制抗蝮蛇和抗五步蛇毒血清对烙铁头蛇毒具有交叉免疫活性，能够中和烙铁头蛇毒中的出血毒素、坏死毒素和抗凝组份，而对诱导血小板聚集的活性没有影响。     

尖吻蝮蛇毒素组双向电泳和二维液相色谱研究

目的：初步研究尖吻蝮蛇蛇毒的蛋白质组分及其活性。方法：利用双向电泳和二维色谱（IEX＋HPLC）分析尖吻蝮蛇蛇毒蛋白质组，并制备分离样品研究蛇毒中酶和毒素活性。结果：双向电泳分离检测得到128种蛋白质，其中24种蛋白质丰度较高，73种为酸性蛋白质，加种为碱性蛋白质。二维色谱展现58种蛋白质，其中26种蛋白质丰度较高。初步活性研究表明，尖吻蝮蛇蛇毒蛋白质多数属于丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶和磷脂酶A2家族，部分蛋白质可能属于去整合素家族。结论：双向电泳和二维色谱相互结合．有效分析了尖吻蝮蛇毒的蛋白盾组成和生物活性．     

五步蛇和蝮蛇的抗蛇毒血清对烙铁头蛇毒的中和作用

针对我国院目前尚无烙铁头蛇毒血清，本研究旨在利用国内现有的精制抗五步蛇毒血清和精制抗蝮蛇毒血清，通过动物实验，证明这两种抗血清在体外和体内都能中和烙铁头蛇毒，对被烙铁头蛇毒中毒的小鼠有明显保护作用，且两种血清的保护率无显著差异。     

压电免疫传感器阵列检测尖吻蝮蛇毒的初步研究

目的 探讨以压电传感阵列技术榆测尖吻蝮蛇毒的可行性.方法 构建2×5的AT切向、基频10 MHz的石英晶体微阵列,将尖吻蝮蛇毒抗体巯基化,通过自组装技术固定在石英晶体金膜电极表面,检测不同浓度的尖吻蝮蛇毒标准液.结果 尖吻蝮蛇毒压电免疫传感器阵列上,最适抗体固定浓度为3 μg/ml,尖吻蝮蛇毒与相应抗体反应时间为40 min,检测尖吻蝮蛇毒最低浓度为0.1μg/ml,蛇毒浓度在0.1～4.0μg/ml范围时,与晶体频率变化之间呈良好的线性关系.结论 采用压电免疫传感器阵列检测尖吻蝮蛇毒响应特性良好,具有灵敏度高、操作简单、不需标记等优点,是实现快速仪器化检测蛇伤的可能途径.     

短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白β亚基的基因克隆和序列分析

目的：克隆短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白（PBAP）β亚基基因,并对该基因进行序列分析。方法：从短尾蝮蛇的毒腺中提取总RNA,设计引物并采用RT-PCR技术进行体外扩增PBAPβ亚基cDNA序列,将PCR扩增产物克隆至载体PMD-19T,通过PCR进行鉴定后,提取阳性克隆菌体质粒进行测序。结果：序列分析结果显示：PBAPβ亚基cDNA序列长度为441bp,编码框由146个氨基酸组成,其中包括由23个氨基酸的信号肽,以及123个氨基酸组成的成熟肽。结论：PBAPβ亚基基因及其氨基酸序列和已报道的一些蛇毒凝集素β亚基的基因以及氨基酸序列相比较,有88%～99%的同源性。     

高压氧辅助抗蛇毒血清治疗对五步蛇毒中毒大鼠肾保护作用研究

目的 探讨高压氧(HBO)辅助抗蛇毒血清治疗对五步蛇毒中毒大鼠肾的保护作用.方法 将96只健康成年雄性SD大鼠随机分为对照组(A组)、蛇毒中毒组(B组)、血清治疗组(C组)、血清联合HBO治疗组(D组),每组24只.B、C、D组大鼠经尾静脉注射五步蛇蛇毒0.8×LD50(LD50=1.594 mg/kg)建立中毒模型,观察五步蛇毒中毒后肾组织的病理变化.C组于建模成功后即从尾静脉注射抗蛇毒血清(0.8×78 U/kg),D组于注射抗蛇毒血清后0、4、11、23 h予以HBO治疗1次,A组不予任何处理.结果 B、C、D组静脉注射蛇毒后大鼠出现明显的中毒症状.与B组比较,C、D组大鼠肾功能、凝血功能明显改善(P＜0.05),且D组优于C组(P＜0.05).B组大鼠出现肾小球出血、肾小囊扩张,周围毛细血管存在不同程度的充血,肾小管管腔扩张,可见细胞低平,刷状缘脱落,肾小管上皮细胞空泡化,肾间质组织炎性细胞浸润.随着中毒时间的延长肾出血减少,炎性细胞浸润增加.C、D组大鼠以上病变明显改善.结论 五步蛇毒中毒可导致大鼠肾损伤;采用HBO辅助抗蛇毒血清治疗对五步蛇毒中毒大鼠肾损伤有保护作用,并且越早采用其保护效应越好.     

桂北五步蛇金属蛋白酶原基因800bp片段的克隆和序列分析

目的：扩增桂北五步蛇金属蛋白酶原基因,并对其进行序列分析,方法：从广西桂北山区五步蛇毒腺中抽提蛇毒总RNA,采用一步法（RT－PCR和PCR在同一试管内进行）扩增金属蛋白酶原基因,对其进行电泳检测,得到3条特异的DNA条带,大小分别为1．5kb,1.3kb,和800bp,利用平端连接方法将800bp克隆至pGEM-T载体,挑选白色菌落,用酶切和PCR法对其进行鉴定,提取阳性菌落进行测序并推导编码的氨基酸序列。结果：信号肽和前肽和已报道的皖南五步蛇金属蛋白酶很相似。同源性为97．9％,但仅含有部分金属蛋白酶成熟肽的氨基酸序列。结论：推测此800bp片段为广西五步蛇金属蛋白酶原基因的一部分。     

五步蛇毒对大鼠脑区海马组胺受体H2 mRNA和蛋白质表达的影响

目的 研究五步蛇毒对大鼠脑区海马组胺受体H2 mRNA及蛋白质表达的影响.方法 用RT-PCR和Western blot方法检测五步蛇毒对不同时相点大鼠海马组胺受体H2 mRNA及蛋白质表达的变化.结果 五步蛇毒处理后,大鼠海马组胺受体H2 mRNA及蛋白质的表达在各时相点均发生变化,且其mRNA和蛋白质表达均为先即时上调然后下调,最后又上调.结论 大鼠海马组胺H2受体 mRNA和蛋白质表达的变化对海马的生理功能有一定的影响.     

桂北五步蛇金属蛋白酶原基因1137bp片段的克隆和序列分析

目的：克隆桂北五步蛇金属蛋白酶原基因,并对其进行序列分析。方法：采用一步法抽提广西桂北山区五步蛇蛇毒总RNA,经RT-PCR扩增纤溶酶金属蛋白酶原基因,将扩增产物克隆至pGEM-T Easy载体,挑选白色菌落。用酶切和PCR法对其进行鉴定。直接利用纯化PCR产物或提取阳性菌落进行测序并推导其编码的氨基酸序列。结果：RTPCR和PCR扩增得到一约1137bp产物,并将其克隆及测序。结论：和已报道的皖南五步蛇纤溶酶金属蛋白酶氨基酸序列相比较,二者之间有91％的同源性。