肾小球系膜细胞的分离和培养

目的分离、培养和鉴定正常人肾小球系膜细胞。方法筛网滤过分离正常人肾小球系膜细胞,同时采用免疫荧光技术,利用异硫氰酸荧光素(FITC)间接标记单克隆抗体:抗Ⅷ因子相关抗原抗体、抗结蛋白抗体、抗角蛋白抗体、抗细胞角蛋白抗体、抗Ⅳ型胶原抗体、抗纤维连接蛋白抗体、抗层粘连蛋白抗体对系膜细胞特有的中间微丝进行鉴定。并采用同期培养的同一来源的肾小球内皮细胞作对照。结果抗Ⅷ因子相关抗原、抗角蛋白和抗细胞角蛋白抗体表达均为阴性,而抗结蛋白抗体、抗Ⅳ型胶原抗体、抗纤维连接蛋白抗体、抗层粘连蛋白抗体为阳性,说明培养的细胞为系膜细胞。结论该种方法分离培养的细胞经过免疫荧光染色鉴定为肾小球系膜细胞。     

大鼠肾小球系膜细胞原代培养与鉴定

目的: 原代培养及鉴定大鼠肾小球系膜细胞(GMC),探索分离、培养GMC的最佳条件.方法: 对大鼠双肾灌洗后,筛网滤过分离肾小球,并用Ⅳ型胶原酶消化处理,然后种植法体外培养大鼠肾小球.同时采用免疫细胞化学和免疫荧光技术,检测亚代GMC的α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、波形蛋白(Vimentin)、细胞角蛋白(Cytokeratin)、Ⅷ因子相关抗原抗体的表达,鉴定GMC,并绘制其生长曲线.结果: 种植4 d后,约80%肾小球贴壁,可见卵圆形上皮细胞生长,18 d左右镜下细胞多呈星状或三角形并伴有不规则的突起,21 d后细胞生长密集, 细胞团簇之间形成网络.免疫细胞化学和免疫荧光证实抗α-SMA及抗Vimentin染色阳性,而抗Cytokeratin、抗Ⅷ因子抗体染色为阴性.GMC亚代倍增时间为4 d. 结论: 结果表明,用改良的培养方法成功率高,培养的细胞为大鼠肾小球系膜细胞.     

肾小球内皮细胞培养及产生细胞外基质的实验研究

作者成功地培养了肥儿及牛肾小球内皮细胞，将内皮细胞克隆后传代培养了７代，并利用间接免疫荧光方法进行鉴定，观察胎儿及牛肾小球内皮细胞都可以表达第ＶＩＩＩ因子相关抗原，纤维连接蛋白，ＩＶ型胶原及层粘连蛋白。测定了不同时胎儿肾小球内皮细胞培养上清中细胞外基质的水平。结果证实不加任何刺激因子，肾小球内皮细胞可以稳定地产生细胞外基质。     

人肾小球系膜细胞原代培养及鉴定方法的研究

目的：建立一种重复性好、传代次数多的人肾小球系膜细胞培养方法。方法：取肾脏肿瘤手术切除后远离患病部位的正常肾脏组织、水囊引产的胎儿肾,三层筛网滤过分离,取最下层筛网上组织,用胶原酶消化,培养正常人肾小球系膜细胞。同时采用形态学观察和免疫荧光技术,对鼠抗人结蛋白,鼠抗人角蛋白进行鉴定,采用MTT、 流式细胞仪技术对不同来源肾脏的系膜细胞生长状况进行比较。结果：形态学、免疫荧光法鉴定表明培养细胞为肾小球系膜细胞,胎肾原代培养后8～10d即可传代,而成年肾脏原代培养后需15～16d方可传代。成年肾脏培养细胞至第4代细胞生长缓慢,贴壁能力减弱,出现死亡。而胎肾培养细胞则可继续培养至第7～10代。结论:三层滤网法分离人肾小球系膜细胞, 方法简单、高效,培养的原代肾小球系膜细胞符合肾小球系膜细胞的生物学特性,且进一步证明胚胎组织比成年个体肾脏原代细胞培养容易成功。     

L158,809和西拉普利对体外培养系膜细胞TGF-β1表达和细胞外基质蛋白分泌的影响

目的：观察血管紧张素受体拮抗剂(ARBs)L158，809和血管紧张素转换酶(ACE)抑制剂西拉普利对体外培养人肾小球系膜细胞转化生成因子(TGF—β1)表达和纤维连接蛋白、层粘连蛋白和Ⅳ型胶原分泌的影响。方法：分别在不同葡萄糖浓度(5.6mmol／L和30mmol／L)和药物浓度(1、10、100和500μmol／L)下体外培养人肾小球系膜细胞，分别于24、48和72h后测定细胞增殖。然后将系膜细胞分为低糖(5．6mmol／L)对照组(LG)、高糖(30mmol／L)对照组(HG)、L158，809(10μmol／L)组和西拉普利(10μmmol／L)组，48h后，分别用RT-PCR法测定TGF-β1表达，ELISA和放射免疫法测定细胞上清液中TGF-β1、纤维连接蛋白、层粘连蛋白和Ⅳ胶原浓度。结果：与低糖对照组相比，高糖对照组系膜细胞过度增殖，细胞上清液中TGF-βl、纤维连接蛋白、层粘连蛋白和Ⅳ胶原浓度明显升高，TGF-βlmRNA表达也显升高；而L158，809组和西拉普利组TGF-β1和细胞外基质(ECM)蛋白水平明显低于高糖对照组，且TGF-β1mRNA水平亦表达明显降低。结论：高糖可刺激体外培养系膜细胞过度增殖，TGF-β1表达增高，ECM蛋白分泌明显增加，而L158，809和西拉普利均可抑制高糖环境下上述现象。     

免疫组织化学研究流行性出血热肾组织中细胞骨架蛋白和Ⅳ型…

研究流行性出血热尸检肾脏中细胞骨架蛋白和Ⅳ型胶原的变化以客观反映肾脏的损伤。应用免疫组化方法，以抗平滑肌特异性肌动蛋白α链，结蛋白，波形蛋白，Ⅳ型胶原单克隆抗体评价肾小球的损伤，以抗Ⅳ型胶原，Ｖｉｍｅｎｔｉｎ单克隆抗体显示肾小管基底膜，血管和间质的改变；以抗细胞角蛋白，角蛋白，上皮细胞膜抗原单克隆抗体判断肾小管的损伤；ＰＣＮＡ和Ｖｉｍｅｎｔｉｎ显示肾小管的增生和分化。结果：ＥＨＦ肾脏肾小球固有细胞     

肾小球肾炎系膜增殖和基底膜组成变化的相关研究

应用免疫组织化学方法检测了随机选择的９５例肾小球肾炎的Ⅳ型胶原和纤维连接蛋白。结果表明，两种抗原的表达和定位可分为单纯基底膜型和系膜、基底膜复合型，系膜增殖明显的肾小球肾炎的Ⅳ型胶原和纤维连接蛋白阳性表达明显多于系膜无增殖和轻微增殖的肾小球肾炎（Ｐ＜０．０１）。Ⅳ型胶原和纤维连接蛋白在免疫球蛋白和补体沉积阳性、阴性肾炎之间无明显区别（Ｐ＞０．０５）。提示系膜增殖有助于合成参与基底膜炎症损伤修复的大分子物质。     

狼疮肾炎中新发现的抗肾小球系膜细胞抗体靶抗原的鉴定

目的 研究狼疮肾炎血清中新发现的抗肾小球系膜细胞抗体与抗DNA抗体的关系,及其靶抗原是否存在于细胞膜上。方法 DNA纤维素柱亲和层析分离狼疮肾炎患者血清中的抗DNA抗体,Western印迹法检测祛除抗DNA抗体的血清和亲和层析纯化的抗DNA抗体与系膜细胞靶抗原的结合。从体外培养的人系膜细胞系分离细胞膜并提取膜蛋白,以已知抗肾小球系膜细胞抗体阳性血清为探针应用Western印迹法鉴定膜蛋白中的靶抗原。结果系膜细胞中相对分子质量为74000、36000的蛋白可以被祛除抗DNA抗体的血清识别。而相对分子质量为63000、91000、125000的蛋白被亲和层析的抗DNA抗体识别。系膜细胞膜上至少相对分子质量为101000、91000、74000和31000的蛋白可以被狼疮肾炎患者的血清识别。结论部分抗肾小球系膜细胞抗体与抗DNA抗体无关。人系膜细胞系的膜蛋白中存在狼疮肾炎血清可识别的抗原物质,提示抗DNA抗体以外的直接针对肾小球系膜细胞的自身抗体在狼疮性肾炎的发病机制中可能起重要作用。     

肾小球肾炎系膜增殖和基底膜组成变化的相关研究

应用免疫组织化学方法检测了随机选择的９５例肾小球肾炎的Ⅳ型胶原和纤维连接蛋白。结果表明，两种抗原的表达和定位可分为单纯基底膜型和系膜，基底膜复合型，墓产殖明显的肾小球肾炎的Ⅳ型胶原和纤维连接蛋白阳性表达明显多于系统膜无增殖和轻微增殖的肾小球肾炎。     

苯那普利对抗Thy1.1大鼠系膜基质积聚的影响

目的 观察血管紧张素转换酶抑制剂苯那普利对系膜增殖性肾炎（MsPGN）大鼠系膜基质的影响。方法 用抗胸腺细胞血清（ATS）诱导SD大鼠产生MsPGN后，用苯那普利治疗24d，处死大鼠并用ELISA方法测定大鼠肾小球系膜中胶原Ⅳ（ColⅣ）、胶原Ⅲ（ColⅢ）、层粘连蛋白（LN）、纤维连接蛋白（FN）的含量。结果 治疗组大鼠系膜中ColⅣ、ColⅢ、LN、FN的含量明显低于对照组大鼠系膜中各相应成分的含量，各对应成分之间两两比较差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论 苯那普利对MsPGN大鼠系膜基质的积聚有明显的抑制作用。     

当归补血汤含药血清对高糖条件下肾小球系膜细胞增殖的影响

目的观察当归补血汤含药血清对高糖条件下肾小球系膜细胞（GMC）增殖的影响,探讨其在糖尿病肾病（DN）防治中的意义。方法采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法动态观察各种处理因素的作用下GMC增殖情况。结果高糖能明显刺激体外培养的GMC增殖,而当归补血汤能明显抑制GMC增殖,并呈一定量效关系,即随糖或药物浓度的增加,GMC增殖也相应增加或减少。结论高糖可促进GMC增殖,当归补血汤能明显抑制高糖条件下GMC增殖,从而发挥预防和延缓DN发展的积极作用。     

凝血酶诱导人胚胎肾系膜细胞增殖和PAI—1表达的研究

目的：探讨凝血酶对人胚胎肾系膜细胞增殖和纤溶酶原激活物抑制物－１（ＰＡＩ－１）表达的影响。方法：采用噻唑蓝（ＭＴＴ）掺入法、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交和纤维蛋白平板法分别检测不同浓度凝血酶刺激下人胚胎肾小球系膜细胞增殖、ＰＡＩ－１ｍＲＮＡ表达和ＰＡＩ－１蛋白质活性的变化,并同时用人工水蛭素进行阻断实验。结果：凝血酶呈浓度依赖性的方式促进人胚胎肾小球系膜细胞增殖、ＰＡＩ－１ ｍＲＮＡ表达和ＰＡＩ－１蛋白质     

凝血酶诱导人胚胎肾系膜细胞增殖和PAI-1表达的研究

目的 :探讨凝血酶对人胚胎肾系膜细胞增殖和纤溶酶原激活物抑制物 1 (PAI 1 )表达的影响。方法 :采用噻唑蓝 (MTT)掺入法、Northern杂交和纤维蛋白平板法分别检测不同浓度凝血酶刺激下人胚胎肾小球系膜细胞增殖、PAI 1mRNA表达和PAI 1蛋白质活性的变化 ,并同时用人工水蛭素进行阻断实验。结果 :凝血酶呈浓度依赖性的方式促进人胚胎肾小球系膜细胞增殖、PAI 1mRNA表达和PAI 1蛋白质活性 ,水蛭素能特异地阻断凝血酶的作用。结论 :凝血酶可通过促进系膜细胞增殖、PAI 1的表达和提高其活性而导致肾脏损伤     

PDGF对大鼠肾小球系膜细胞表达纤维连接蛋白和PAI-1的影响

目的：探讨血小板源性生长因子fPDGF）对体外培养的大鼠肾小球系膜细胞表达纤维连接蛋白（VN）和纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1）的影响。方法：分别以0、5、10ng／rnl的PDGF—BB刺激体外培养的大鼠肾小球系膜细胞12、24、48h．以ELISA法检测培养上清中FN水平，发色底物显色法检测PAI-1的活性；以0、5、10ng／ml的PDGF—BB刺激大鼠系膜细胞24h和10ng／ml PDGF-BB分别作用0、12、24、48h。RT-PCR方法检测系膜细胞PAI-1 mRNA的表达。结果：PDGF-BB在10ng／ml以内随浓度增加可促进大鼠肾小球系膜细胞PAI-1 mRNA和FN表达．在48h内其表达呈时间依赖性。而PAI-1活性在24h时表达最高，以后逐渐下降、结论：PDGF-BB可上调FN和PAI-1及其mRNA表达．提示PDGF可能通过促进细胞外基质合成并抑制其降解而导致肾小球细胞外基质的积聚。     

IDENTIFICATION OF GLUCOSE TRANSPORTER－1 AND ITS FUNCTIONAL ASSAY IN MOUSE GLOMERULAR MESANGIAL CELLS CULTURED IN VITRO

Objective. To evaluate the role of glucose transporter-1 (GLUT1) in the glucose uptake of glomerular mesanglal cells. Methods. Cultured C57/SJL mouse mesangial cells were used in the study. The expression of GLUT1 mRNA was detected by RT-PCR. The expression of GLUT1 protein was detected by immunofluorescence and flow cytometry. The uptake of glucose and its kinetics were determined by 2-deoxy-[3H] -D-glucose uptake. Results. Both GLUT1 mRNA and protein were found in mouse glomerular mesangial cells. 2-deoxy-D-glucose uptake and kinetics assay showed that this glucose transporter had high affinity for glucose and the glucose uptake specificity was further confirmed by phloretin. Conclusion. Functional GLUT1 did present in mouse mesangial cells cultured in vitro and it might be the predominant transporter mediated the uptake of glucose into mesangial cells.     

糖肾颗粒对大鼠肾小球系膜细胞增殖的影响

[目的]研究糖肾颗粒对高糖培养下大鼠肾小球系膜细胞(Glomerular mesangial cells,GMC)增殖的影响,探讨其在糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)防治中的意义.[方法]将常规体外培养的GMC分为正常对照组、高糖组、糖肾颗粒高、中、低剂量组及贝那普利组,分别进行相应处理后收集细胞,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测不同作用时间(24h、48h、72h)下细胞增殖程度.[结果]高糖(30.0mmol· L-1)能明显刺激体外培养的GMC增殖.糖肾颗粒及贝那普利两种药物含药血清对高糖刺激下的GMC增殖有抑制作用,其中糖肾颗粒血清对GMC的抑制作用优于贝那普利血清,且呈一定的时间、剂量依赖性关系.[结论]高糖可促进GMC增殖,糖肾颗粒能明显抑制高糖条件下GMC增殖,从而发挥预防肾小球纤维化及硬化的发生、发展,进而延缓DN的进展.     

高糖对培养的肾小球系膜细胞产生t-PA及与其结合的影响

目的 观察高糖状态下系膜细胞与组织型纤溶酶原激活物（Tissue plasminogen,t-PA）结合力及系膜细胞产生t-PA活性改变与纤维连接蛋白（Fibromectin,FN）产生的影响。方法 采用体外人肾小球系膜细胞培养，放射性核素标记法测定系模细胞与t-PA结合力，纤维蛋白酶谱法检测t-PA活性，酶联免疫分析检测FN。结果 高糖可抑制系膜细胞与t-PA结合力，同时t-PA活性增加，FN产生明显增多，并随着培养时间的延长，葡萄糖愈高，作用愈明显。结论 高糖致系膜细胞与t-PA结合力下降，t-PA活性增加，同时可能其抑制物明显增多，导致细胞外基质积聚，可能是糖尿病肾小球坚硬是化发生的重要原因之一。     

Interleukin 6 production and interleukin 6 mRNA gene expression by mouse glomerular mesangial cells]

To investigate the relationship between Interleukin 6(IL 6) and glomerular mesangial cells (MC), the MC of BALB/c mouse were cultured and verified subsequently by anti-keratin and antidesmin antibodies. The cultured MC were divided into two parts those with Mac-1 marker and those without by flow cytometry. The IL 6 activity of cultured supernatants of MC was measured using the IL 6-dependent cell line subclone (MH 60). The results show that the mouse MC can produce IL6 and the level of IL 6 produced by MC with Mac-1 marker was higher than that without Mac-1. The RNA from the mouse glomerular mesangial cells was hybridized in dot blots with a-32pdCTP labeled IL6 cDNA probe, the dot blot autoradiograph showed the expression of IL6 mRNA gene in mouse mesangial cells.