当归肌动蛋白基因片段的克隆及序列分析

目的 对当归肌动蛋白（Actin）基因进行克隆及序列分析。方法 根据已经克隆的植物Actin基因的保守序列设计一对简并性引物,以当归根部总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增Actin基因片段并连接到pMD19-T载体上,阳性克隆经PCR检测后进行测序。结果 得到一段598 bp的序列,序列分析表明,该片段编码198个氨基酸,与高等植物Actin基因核苷酸序列同源性在83%以上,与其他肌动蛋白氨基酸序列同源性达94%以上。结论 首次从当归中克隆出了Actin基因,为有效利用该基因奠定了基础。     

党参肌动蛋白基因片段的克隆及序列分析

目的 对党参肌动蛋白（actin）基因进行克隆及序列分析。方法 根据已经克隆的植物actin基因的保守序列设计一对简并性引物,以党参根部总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增actin 基因片段并连接到pMD19-T Simple载体上,阳性克隆经PCR检测后进行测序。结果 得到一段603 bp的序列,序列分析表明,该片段编码200个氨基酸,与高等植物actin基因核苷酸序列同源性在78%以上,与其他肌动蛋白氨基酸序列同源性达90%以上。结论 首次从党参中克隆出了actin基因,为有效利用该基因奠定了基础。     

显齿蛇葡萄查耳酮合成酶基因cDNA克隆及蛋白质序列分析

目的 对显齿蛇葡萄Ampelopsis grossedentata查耳酮合成酶（CHS）基因进行克隆及序列分析。方法 根据已经克隆的植物基因的保守序列设计一对引物,以显齿蛇葡萄总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增CHS基因序列并连接到pMD18-T Simple载体上,阳性克隆经PCR检测后进行测序。结果 得到一段1 173 bp的序列,序列分析表明,该片段编码390个氨基酸,与其他高等植物CHS基因氨基酸序列同源性在67.9%以上。结论 首次从显齿蛇葡萄中克隆了CHS基因,为有效利用该基因奠定了基础。     

人参多向耐药性转运蛋白基因保守区序列的克隆及分析

目的 对人参多向耐药性（PDR）转运蛋白基因进行克隆及序列分析。方法 利用其他植物PDR基因的保守区域设计简并引物,以人参根总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增人参PDR基因片段并连接至pGEM-T Easy载体上,阳性克隆经PCR检测后测序。结果 得到一段长693 bp的基因序列,序列分析表明,该片段编码231个氨基酸,与植物PDR基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别在76%和80%以上。分析表明该序列属于PDR转运蛋白的核苷酸结合域,具有PDR转运蛋白的C端Walker A、ABC标签模体和C端walker B 3个保守功能域。结论 首次从人参中克隆出PDR转运蛋白基因,为研究人参次生代谢产物的转运和积累机制奠定了基础。     

吴茱萸Mn/Fe-SOD基因全长cDNA克隆及序列分析

目的 克隆吴茱萸Mn/Fe-SOD基因的全长cDNA序列。方法 根据已获得的吴茱萸Mn/Fe-SOD基因核心片段序列设计4条特异性引物,采用RACE和巢式PCR方法克隆获得吴茱萸Mn/Fe-SOD基因全长cDNA。结果 吴茱萸Mn/Fe-SOD基因全长cDNA序列共1 048 bp,包含一个687 bp的开放阅读框（open reading frame,ORF）,共编码228个氨基酸。结论 首次从吴茱萸中克隆得到了Mn/Fe-SOD基因的全长cDNA序列,为研究该基因在吴茱萸体内超量表达以提高植物抗逆性研究奠定基础。     

滇重楼环阿屯醇合酶基因的克隆及序列分析

目的 获取滇重楼甾体皂苷合成途径关键酶环阿屯醇合酶基因（PpCAS）的全长cDNA序列,并进行序列分析。方法 利用同源克隆和RT-PCR技术获得PpCAS基因保守片段,采用RACE技术获得PpCAS基因的3’及5’末端序列,并采用生物信息学方法进行序列分析。结果 PpCAS基因全长cDNA为2 309 bp,其开放阅读框（ORF）为2 283 bp,可编码760个氨基酸的蛋白质;PpCAS推导的蛋白质相对分子质量为8.69×10⁴,等电点（pI）为6.54;其氨基酸序列与GenBank中其他植物CAS的同源性在60%～83% PpCAS蛋白。结论 从滇重楼中首次获得PpCAS基因cDNA全长序列,该基因具有CAS同源基因的典型特征。     

刺五加GAPDH基因的克隆及序列分析

目的 对刺五加Eleutherococcus senticosus GAPDH基因进行克隆及序列分析,使其成为可用的内参照基因。方法 采用改良的异硫氰酸胍法提取刺五加总RNA,运用RT-PCR法克隆GAPDH基因的部分序列,并以其为内参照基因进行半定量PCR。结果 克隆了长度为627 bp的刺五加GAPDH基因,推测其编码209个氨基酸,与三七、人参、拟南芥的GAPDH氨基酸序列同源性分别为97%、93%、93%,核苷酸同源性分别为94%、86%、84%。其作为内参照基因的半定量PCR具有良好的扩增效果和重现性。结论 首次分离并克隆了刺五加GAPDH cDNA,证实该序列可以作为基因表达分析的内参照基因,为刺五加苷生物合成中关键酶的表达分析及调控机制研究奠定基础。     

半夏凝集素基因的克隆与氨基酸序列初步分析

目的 克隆半夏凝集素基因并对其氨基酸序列生物信息与已报道相关基因进行对比分析,为抗虫基因利用和转基因育种研究奠定基础。方法 根据已报道的植物凝集素基因序列设计特异引物,以半夏叶片DNA为模板进行PCR扩增,获得特异性片段,将其连接到测序载体上,进行序列测定,用分析软件分析序列信息。结果 克隆1 069 bp的半夏凝集素基因(pta),开放阅读框全长804 bp,编码268个氨基酸残基;预测相对分子质量和等电点分别为2.91×10⁴和7.77,功能区完整,具有1条信号肽和3个甘露糖结合区;已在GenBank中登记（登录号AY725425）。结论 克隆的半夏凝集素基因序列信息完整,具有典型的甘露糖结合位点,可以作为抗虫基因用于抗虫育种。     

成纤维细胞生长因子19转录活性及上游结合元件分析

目的 构建FGF19基因启动子区荧光素酶报告基因质粒,并研究分析其启动子区的转录活性和结合元件。方法 设计特异性引物PCR扩增基因组DNA,得到长为3323bp的FGF19基因启动子区片段,将此PCR产物插入荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic Vector,获得全长为3323bp的FGF19基因启动子区荧光素酶报告基因质粒。在此基础上设计特异性引物,构建5''端系列缺失荧光素酶报告基因质粒。通过瞬时转染实验检测所构建质粒的相对荧光素酶活性,分析不同启动子区片段对FGF19基因转录活性的影响,并用软件预测影响启动子转录活性的关键转录因子。结果 构建了7个FGF19基因启动子区荧光素酶报告基因质粒,经双酶切和测序验证均正确。瞬时转染及荧光素酶报告基因分析实验发现启动子区-2351~-2316是调控FGF19启动子转录活性的重要序列,且在线软件预测该序列存在潜在的转录因子位点。结论 FGF19基因启动子区-2351~-2316是调控其启动子转录活性的关键位置。     

铁皮石斛磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆及表达分析

目的 克隆铁皮石斛Dendrobium officinale磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（pepc）基因,并对其在F型和H型铁皮石斛中的表达进行分析,为研究铁皮石斛pepc基因的结构、功能提供依据。方法 基于GenBank上已知的pepc基因的同源序列设计引物,应用RT-PCR和RACE等方法,克隆铁皮石斛pepc基因全长。采用荧光定量PCR方法研究pepc基因在2种铁皮石斛中的表达。结果 成功克隆了铁皮石斛pepc基因,登录号为JF423930,该基因全长为3 560 bp,其中cds序列为2 895 bp,与兰科植物的同源性为80%左右,与其他科属植物的同源性达到70%以上,编码964个氨基酸。pepc基因在F型铁皮石斛中的表达量为H型的5.55倍。结论 成功克隆了铁皮石斛pepc基因,且F型铁皮石斛pepc基因的表达量高于H型。     

建泽泻鲨烯合酶基因克隆及其生物信息学分析

目的 对建泽泻原萜烷型三萜类成分生物合成关键酶鲨烯合酶（squalene synthase,SS）进行基因全长的克隆和生物信息学分析。方法 以建泽泻总RNA为模板,运用同源克隆法和RACE技术克隆建泽泻SS基因的cDNA全长,并通过DNAMAN软件及ExPASy在线分析等方法对其进行生物信息学研究。结果 获得建泽泻SS基因全长cDNA,GenBank注册号为JX866770,序列分析表明,所克隆的cDNA序列全长为1 577 bp,包含一个长1 230 bp的开放阅读框架,编码409个氨基酸的蛋白,与其他药用植物具有较高的同源性。预测该蛋白的相对分子质量为4.68×10⁴,等电点为5.97,无信号肽,包含2个富含天冬氨酸（DXXDD）的保守功能域。结论 首次克隆获得建泽泻SS基因的全长cDNA,为泽泻原萜烷型三萜类成分生物合成途径阐明与生物工程应用提供科学依据。     

半夏毒针晶的致炎作用研究

目的 探讨半夏毒针晶引起的刺激性炎症的机体表现及对相关炎症介质的影响。方法 采用小鼠毛细管通透性实验、小鼠腹腔炎症实验及大鼠足跖肿胀实验,考察不同剂量半夏毒针晶的致炎效应及其量-效关系,并测定相关炎症介质的量。结果 半夏毒针晶混悬液可使小鼠腹腔毛细血管通透性增加,腹腔渗出液中炎症介质前列腺素E₂（PGE₂）、一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）的量增加;亦可引起大鼠足跖肿胀,并在一定剂量范围内表现为典型的量-效关系,还可使大鼠致炎足跖中炎症介质PGE₂、环氧合酶-2（COX-2）的量显著增加。结论 半夏毒针晶刺激性毒性在机体内表现为炎症反应。     

金荞麦查尔酮异构酶的基因克隆及其花期表达与黄酮量分析

目的 获取金荞麦总黄酮合成途径的关键酶查尔酮异构酶（chalcone isomerase,CHI）基因的全长序列,并进行序列分析;对花期金荞麦CHI基因在各组织中的表达与总黄酮量进行分析。方法 利用同源克隆技术获得金荞麦查尔酮异构酶基因（FdCHI）的cDNA序列;采用半定量RT-PCR对CHI表达量进行分析,并采用AlCl₃法测量总黄酮量。结果 金荞麦FdCHI基因cDNA包含一个750 bp的ORF,编码249个氨基酸,命名为FdCHI。生物信息学分析表明该编码蛋白与其他植物CHI氨基酸序列同源率较高。FdCHI在花期金荞麦不同组织中的表达量分析表明,其表达量花＞根＞叶＞茎,总黄酮量为花＞叶＞茎＞根。结论 在金荞麦中首次获得CHI基因的cDNA序列,编码蛋白具有CHI同源蛋白的典型特征。FdCHI基因在金荞麦茎、叶和花中的表达量与总黄酮量具有相关性,但在根中表达量与总黄酮量相关性较小。