去甲基化对宫颈癌细胞系增殖及信号通路的影响

目的检测DNA甲基转移酶(DNMTs)抑制剂5-氮杂-2'脱氧胞苷(5-Aza-2'deoxycytidine,5-Aza-CdR)处理后,对宫颈癌细胞系Hela、Siha、C33A的增殖、HPV16、HPV18E6 mRNA、TERT mRNA水平以及对于p21、p53蛋白表达的影响。方法用不同浓度5-Aza-CdR干预宫颈癌Hela、Siha、C33A细胞株7 d后,采用CCK8检测三种细胞增殖水平的变化;RT-PCR检测HPV16、HPV18 E6以及TERT mRNA水平;Western blot法检测p21和p53蛋白表达。结果随着5-Aza-CdR浓度的增加,Hela、Siha、C33A细胞的增殖抑制随之增强,呈时间剂量依赖关系。5-Aza-CdR对于C33A、Hela、Siha、细胞抑制率分别为70.3%、61.9%、40.6%,差异有统计学意义(P 0.05);去甲基化后,Siha细胞HPV16E6和Hela细胞HPV18 E6水平呈下降趋势,Hela、Siha、C33A细胞TERT mRNA水平均呈下降趋势;去甲基化后宫颈癌Siha、Hela和C33A细胞中p53和p21蛋白含量明显增加,差异有统计学意义(P 0.05)。结论 5-Aza-CdR可能通过激活p53、p21信号通路抑制TERT mRNA水平,进而通过抑制HPVE6水平抑制宫颈癌细胞的增殖。     

HPV16 E6小干扰RNA与宫颈癌细胞中E6 p53 p21关系的研究

目的 探讨HPV16E6小干扰RNA（siRNA）与宫颈癌CaSki细胞中E6、p53、p21之间的关系。方法 2004年9月至2005年3月于四川大学华西第二医院,应用化学合成针对HPV16E6的siRNA借脂质体转染CaSki细胞,实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和流式细胞术检测E6siRNA转染前后细胞中HPV16E6、p53、p21mRNA及其蛋白表达的变化。结果 转染24h,E6mRNA的表达显著低于空白组（P〈0.05）。各时间点p53、p21mRNA的表达差异无显著性意义（P〉0.05）。转染48h,E6蛋白表达明显下调,p53、p21蛋白表达相应升高。结论 HPV16E6siRNA能特异、高效地沉默宫颈癌细胞E6mRNA的表达,减少对野生型p53的降解,恢复p53蛋白的功能活性。RNA干扰（RNAi）技术可为HPV感染相关性疾病提供一种新的特异性基因治疗方法。     

β-D-葡聚糖通过下调HPV16 E6和重新激活p53调节HPV16阳性宫颈癌细胞的生物学行为

目的:研究β-D-葡聚糖在宫颈癌细胞中的作用及可能机制。方法:CCK-8法检测β-D-葡聚糖对宫颈癌细胞CaSki、HeLa和SiHa细胞增殖的影响，伤口愈合试验检测细胞迁移情况，流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡情况。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测细胞中HPV16 E6/E7、HPV18 E6/E7、p53和p21 mRNA表达水平，Western blot检测N-钙黏蛋白、E-钙黏蛋白、p53、波形蛋白、p21蛋白表达水平。以宫颈癌CaSki细胞为研究对象，在雌性BALB/c小鼠皮下注射成瘤，验证β-D-葡聚糖在体内对肿瘤生长的抑制作用。结果:β-D-葡聚糖对不同宫颈癌细胞增殖的影响不同，对CaSki细胞增殖有显著的时间依赖性抑制作用，对HeLa细胞增殖无显著影响，对SiHa细胞作用72h后表现为促进增殖作用(P<0.05)。β-D-葡聚糖对CaSki、HeLa和SiHa细胞的迁移都有抑制作用(P<0.05)。β-D-葡聚糖对CaSki、SiHa的细胞周期有调节作用并能促进其凋亡(P<0.05),但对HeLa细胞无显著影响。与对照组相比，β-D...     

一氧化氮与HPV感染的关系及其对子宫颈癌细胞增殖与凋亡的影响

目的 探讨一氧化氮(NO)与HPV感染的关系及其对宫颈癌细胞增殖与凋亡的影响.方法 选择2009年12月1日至2010年8月5日在复旦大学附属妇产科医院宫颈疾病诊疗中心行阴道镜检查的患者115例,应用HPV分型检测试剂盒(可检测21种HPV亚型)进行HPV分型,同时应用Griss法间接检测官颈局部NO含量.在体外培养的宫颈腺癌细胞株HeLa细胞和宫颈鳞癌细胞株Caski细胞中,加入不同浓度(终浓度分别为0.125、0.25、0.5 、1.0及2.0 mmol/L)NO供体--硝普钠(SNP)后培养24 h,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞生长情况,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,并应用荧光定量逆转录PCR技术及蛋白印迹法检测SNP处理后细胞中HPVE6、E7 mRNA的表达及p53蛋白的表达.结果 (1)115例患者中,宫颈HPV感染93例,其中高危型50例,低危型43例;无HPV感染22例.115例患者的宫颈局部均检测到NO,其中高危型HPV感染患者的宫颈局部NO含量为(47.6±1.4)μmol/L,低危型HPV感染者为(24.1±1.2)μmol/L,无HPV感染者为(22.8±0.3)μmol/L,高危型HPV感染者高于低危型HPV感染者和无HPV感染者,差异有统计学意义(P＜0.05);而低危型HPV感染者与无HPV感染者比较,差异无统计学意义(P＞0.05).(2)不同浓度(0.125、0.25、0.5 1.0及2.0 mmol/L)SNP处理HeLa、Caski细胞24 h后,能抑制细胞生长、促进细胞凋亡,当SNP浓度≥1.0 mmol/L时,与SNP处理前比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).1.0 mmol/L的SNP处理24h后,HeLa细胞中HPV18 F6、E7 mRNA的表达水平(分别为19.181±0.360、17.571±0.010)明显低于SNP处理前(分别为27.362±0.191、22.962±0.053;P＜0.05),p53蛋白的表达水平(1.17±0.03)明显高于SNP处理前(0.23±0.05;P＜0.05);但Caski细胞中HPV16E6、E7mRNA和P53蛋白的表达在SNP处理前、后无明显变化(P＞0.05).结论 宫颈局部微环境中NO含量增加与感染高危型HPV有一定的相关性;SNP能抑制宫颈癌细胞的生长,促进其凋亡,降低HPV18 E6、E7 mRNA的表达及活化p53蛋白,其机制可能是宫颈腺癌细胞株HeLa细胞对SNP更敏感.NO释放增加可能是官颈局部微环境清除HPV的免疫机制之一.

Abstract：

Objective To study the relationship between nitric oxide within cervical microenvironment and different HPV types as well as the effect of sodium nitroprusside( SNP), a nitric oxide donor, on the proliferation and apoptosis of cervical cancer cell lines. Methods HPV typing test was assessed from 115 women by using high-risk HPV (HR-HPV) 21 typing test and the release of cervical nitric oxide(NO) was assessed as nitrate, nitrite in cervical fluid. Cervical NO was then compared between women showing different HPV types. Proliferation of Caski and HeLa cervical cells was determined by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay, cell apoptosis was detected by flow cytometry after 24 hours treated by different final concentration of SNP (0. 125,0. 25,0. 5,1.0 and 2. 0 mmol/L, respectively). The expressions of HPV E6,E7 gene mRNA and p53 protein were detected by SYBR Green Ⅰ quantitative real-time PCR and western blot. Results ( 1 ) The cervical NO release of women with HR-HPV was higher compared to that in HPV negative women [ (47. 6 ± 1.4) μmol/L vs ( 22. 8 ± 0. 3 ) μmol/L; P ＜ 0. 05 ]; but there was no statistical difference between low-risk HPV (LR-HPV) group [ (24. 1 ± 1.2 ) μmol/L] and control group (P ＞0. 05 ). (2)After 24 hours treated by different final concentration of SNP, the results shown that SNP could inhibited the proliferation and increased apoptosis rate in Caski and HeLa cells, in which the concentration of SNP ≥ 1.0 mmol/L , there were significantly different ( P ＜ 0. 05 ), while when SNP ≥2. 0mmol/L, the proliferation of cells inhibited seriously. Treated by SNP ( 1.0 mmol/L ) 24 hours, the expressions of HPV18 E6, E7 mRNA in HeLa cells were reduced from 27. 362 ±0. 191,22. 962 ±0. 053 to19. 181 ±0. 360, 17. 571 ±0. 010 and the protein expression of p53 increased from 1. 17 ±0. 03 to 0. 23 ±0. 05, there were statistically significant differences between adding SNP group and the control group ( P ＜0. 05); but there were no statistically significant differences in HPV16 E6, E7 mRNA and that of p53 in Caski cells( P ＞ 0. 05 ). Conclusions The presence of HR-HPV is associated with an increased release of NO in the human uterine cervix; NO could inhibit the growth and proliferation and enhance the apoptosis of cervical cancer cells, inhibit the expression of HPV18 E6, E7 mRNA in HeLa cells and activate the expression of p53 protein, the mechanism may be due to higher sensitivity of HeLa cells (cervical adenocarcinoma cell) to SNP. The increasing release of NO may play a role in regulating the elimination of HPV in cervical microenvironment, which is a part of mucous membrane immunity.     

siRNA对宫颈癌细胞系 HPV16 E6基因的作用

目的 构建并筛选出最有效的HIV16 E6基因特异的小干扰RNA(amall interfering RNA，siRNA)表达载体，观察其对宫颈癌细胞中HIV16 E6基因表达的长期影响，探讨E6基因在宫颈癌发生过程中的分子作用机制，为临床HIV感染及宫颈癌治疗探索新方法。方法 构建Hairpin siRNA质粒，稳定转染宫颈癌SiHa细胞，鉴定转染细胞中的质粒DNA，通过Real-Time RT-PCR检测细胞中HPV16 E6mRNA表达，采用Westem-blot检测p53、p21等蛋白的变化。MTT法(四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法)检测SiHa细胞转染siRNA后细胞增殖曲线。结果 HIV16 E6A hairpin siRNA表达载体转染人宫颈癌SiHa细胞，可以在细胞内长期表达siRNA，有效抑制细胞内HIV16 E6基因的表达。E6A siRNA能抑制细胞生长，作用持续达4个月以上。结论 利用siRNA表达载体抑制整合在细胞中的外源HIV E6病毒癌基因可能是治疗HIV感染和宫颈癌的一种新的理想方法。     

高危型HPV16 E6蛋白表达抑制宫颈癌细胞株p63α表达的研究

目的:探讨高危型HPV16 E6蛋白的表达对宫颈癌细胞株中p63α表达的影响。方法:用RT-PCR法从SiHa中扩增出带酶切位点的HPV16 E6的片段,将HPV16 E6基因片段克隆到p3×flag-CMV-Myc-24真核表达载体上,通过脂质体转染入宫颈癌细胞株后,W estern blot检测p63α的表达。结果:成功构建HPV16 E6真核表达载体,转染至宫颈癌SiHa和Caski细胞株中,p63α均低于对照组。结论:高危型HPV E6能够抑制p63α的表达,提示p63α与HPV E6的相互作用在子宫颈癌发病中发挥重要作用。     

反义HPV16 E6/E7-EGFP重组质粒的构建及其对宫颈癌SiHa细胞的促凋亡作用

目的:构建HPV16早期基因E6/E7的反义重组质粒,探讨其对SiHa细胞的促凋亡作用。方法:将HPV16E6/E7基因片段反向克隆于真核表达载体pEGFP-C1并转染SiHa细胞,用RT-PCR方法检测转染后SiHa细胞E6、E7基因mRNA的表达,West-ernblot方法检测转染后E6/E7蛋白的表达,流式细胞仪检测转染后细胞的凋亡率。结果:成功构建携带HPV16E6/E7基因反义片段的真核表达载体,转染该质粒后,SiHa细胞E6、E7基因的mRNA和蛋白均明显下调;转染后细胞凋亡率为(59.3±11.3)%,明显高于转染空载体组[(9.4±1.8)%]和未转染组[(2.1±0.4)%](P<0.05)。结论:反义HPV16E6/E7基因可下调宫颈癌细胞中E6/E7癌基因的表达,诱导宫颈癌细胞凋亡,为宫颈癌的基因治疗提供了实验依据。     

宫颈癌发生中细胞凋亡与p53基因蛋白及HPV感染的相关性

目的探讨子宫颈癌发生中细胞凋亡与p53基因蛋白表达及高危型人乳头样病毒(HPV)感染的关系.方法检测对象为正常宫颈鳞状上皮(NE)41例、重度非典型增生(SD)41例、原位癌(CIS)37例、早期浸润癌(MIC)31例、大细胞非角化型浸润癌(IC)40例共计190例手术切除福尔马林固定、石蜡包埋的组织标本.凋亡细胞的检出使用TDT-mediateddUTP-biotinnickendlabeling(TUNEL)方法,p53基因蛋白表达采用单克隆抗体免疫组织化学ABC染色方法,HPV16、18型E6DNA感染使用PCR方法进行检测.结果TUNEL标记率从NE到CIS组呈现有意义地减少(P＜0.01);在SD、CIS组,p53基因蛋白超表达者TUNEL标记率呈现有意义的低值(P＜0.05);高危型HPV感染与宫颈癌的发生有关,与细胞凋亡、p53基因蛋白表达未呈现直接的相关性改变.结论细胞凋亡参与宫颈癌发生的早期过程,其与p53基因蛋白超表达有关.     

Hsa-miR-6841-3p对宫颈癌细胞系Caski增殖及侵袭转移的影响

目的:探讨miRNA-6841-3p对宫颈癌细胞生物学行为的影响。方法:将miRNA-6841-3p模拟物、miRNA-6841-3p抑制物转染至宫颈癌细胞系Caski。实时荧光定量PCR检测宫颈癌细胞系Caski转染后miRNA-6841-3p mRNA以及其预测靶基因TFF3的转录表达。CCK-8法检测细胞增殖能力。Transwell小室检测细胞体外侵袭转移能力。划痕实验检测细胞迁移能力。结果:实时荧光定量PCR显示,miRNA-6841-3p模拟物转染组与miRNA-6841-3p模拟物对照组相比,miRNA-6841-3p mRNA表达明显上调(P0.01),miRNA-6841-3p抑制物转染组miRNA-6841-3p mRNA转录表达明显受抑制,差异有统计学意义(P0.01)。其预测靶基因TFF3 mRNA转录表达在miRNA-6841-3p模拟物转染组明显低于抑制物转染组(P0.01)。与miRNA-6841-3p抑制物转染组比较,转染miRNA-6841-3p模拟物后,宫颈癌细胞系Caski细胞活性、迁移侵袭能力明显减弱(P0.05)。结论:上调miRNA-6841-3p表达可明显抑制宫颈癌细胞系Caski增殖,抑制其迁移、侵袭能力,其作用机制可能通过抑制预测靶基因TFF3表达实现。     

干扰素α-2b对宫颈癌细胞HPV16 E6E7基因抑制作用的研究

目的研究干扰素α-2b对宫颈癌SiHa细胞生长的调节作用，从细胞生物学及分子生物学水平探讨干扰素α-2b对宫颈癌细胞SiHa的作用机制。应用RT-PCR半定量检测细胞内HPV16 E6E7 mRNA表达，观察干扰素α-2b对宫颈癌SiHa细胞中HPV16 E6E7 mRNA表达的影响。方法以不同浓度的人重组干扰素α-2b含药培养液作用于感染HPV16的人宫颈癌细胞系——SiHa细胞，并设立无药对照，通过MTT及流式细胞分析技术检测该药对细胞生长及增殖的影响；进行细胞凋亡检测并用RT—PCR法半定量检测对HPV16 E6E7基因表达的影响。结果经含有干扰素α-2b的培养液作用后，细胞数量减少，1000IU／ml的干扰素α-2b对细胞抑制作用最强；细胞周期各时相中，S期细胞所占比例明显减少；均可诱导细胞凋亡；均使细胞中HPV16 E6E7mRNA表达明显减少。结论干扰素α-2b不仅可直接抑制宫颈癌细胞的生长，并可能通过抑制HPV16 E6E7基因表达的分子机制，达到抑制肿瘤目的。     

HPV16 E7 siRNA表达载体对宫颈癌CaSki细胞增殖及成瘤性的影响

目的:通过载体介导的RNA干扰技术干扰E7癌基因的表达,探讨HPV16E7小干扰RNA(siRNA)表达载体对宫颈癌CaSki细胞增殖及成瘤性的影响,以及成为宫颈癌基因治疗新策略的可行性。方法:利用脂质体将HPV16E7特异性siRNA表达载体、空载体转染CaSki细胞,分别命名为CaSki-S、CaSki-P。通过荧光定量RT-PCR及流式细胞仪检测CaSki、CaSki-S、CaSki-P3种细胞E7mRNA和蛋白的变化,通过流式细胞仪及MTT法检测3种细胞的细胞周期及生长曲线变化,并检测3种细胞在裸鼠体内成瘤性及生长活性的差异。结果:荧光定量RT-PCR及流式细胞仪检测显示,CaSki-S细胞E7基因mRNA和蛋白的表达明显低于CaSki细胞,抑制率分别为92.86%、84.21%。MTT法检测显示,CaSki-S细胞生长明显慢于CaSki细胞。流式细胞仪检测细胞周期显示,CaSki-S细胞与未转染组CaSki细胞比较,G1期细胞比例明显增加,S期细胞比例则明显减少。裸鼠体内成瘤性及生长活性显示CaSki-S细胞显著低于CaSki细胞。而CaSki-P细胞无论是在E7mRNA和蛋白的表达,还是在肿瘤细胞生长、细胞周期的改变及成瘤性方面都与CaSki细胞无明显差异。结论:HPV16E7siRNA表达载体能有效地抑制宫颈癌CaSki细胞E7基因的表达,部分逆转其恶性表型。因此它有望成为宫颈癌基因治疗的新策略之一。     

宫颈癌细胞株Hela中CSN6对E6-AP及p53的调节及其分子机制

目的:探讨宫颈癌细胞株Hela中组成型光形态发生因子9信号复合体6(CSN6)对E6-AP及其目标蛋白p53的调节及其分子机制。方法:重组慢病毒干扰载体质粒转染Hela细胞,降调CSN6表达。Western blot法检测E6-AP表达,实时荧光定量PCR检测p53下游基因表达变化。分别将蛋白酶抑制剂MG132、真核生物蛋白合成抑制剂放线菌酮(CHX)和高表达CSN6的Flag-CSN6质粒分别作用于Hela细胞,Western blot法检测E6-AP蛋白表达。将重组慢病毒质粒shRAN CSN6转染Hela细胞48h后,泛素化检测分析CSN6调节E6-AP蛋白表达的分子机制。试验组裸鼠皮下接种shRNA-CSN6细胞株,对照组接种shRNA-vector细胞株,观察肿瘤体积变化。结果:放线菌酮(CHX)可下调E6AP表达,抑制CSN6表达后E6-AP下调更显著;MG132可使E6AP表达增加,CSN6可加强该作用;抑制CSN6表达后,Hela细胞和裸鼠肿瘤组织中p53下游相关基因表达增加,裸鼠肿瘤生长缓慢。泛素化检测提示,CSN6可抑制E6-AP蛋白的泛素化水解,并呈剂量依赖性。结论:宫颈癌细胞株Hela中CSN6上调E6AP是通过抑制E6-AP蛋白的泛素化水解,稳定其在细胞中的表达,实现对p53的持续降解。     

曲古霉素A对人宫颈癌Hela细胞增殖及凋亡的影响

目的:探讨组蛋白乙酰化酶抑制剂曲古霉素A(TSA)对人宫颈癌Hela细胞增殖和调亡的作用及其机制.方法:不同浓度的TSA处理Hela细胞,应用Western blot法检测细胞内组蛋白H4(Ac-H4)乙酰化水平,荧光定量PCR方法检测p21 mRNA表达,MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果:随着TSA浓度增加,人宫颈癌Hela细胞内Ac-H4乙酰化水平增加(P＜0.05),p21 mRNA表达增加(P＜0.05),细胞增值率减少(P＜0.05),细胞凋亡率增加(P＜0.05).结论:TSA通过提高组蛋白乙酰化水平,增加p21基因表达,抑制人宫颈癌Hela细胞的增殖和诱导细胞凋亡,且呈浓度依赖性.     

辣椒碱对人宫颈癌细胞Hela和C-33A的抗肿瘤活性

目的:研究辣椒碱对Hela(HPV+)和C-33A(HPV-)细胞生长增殖和凋亡的影响,探讨辣椒碱对宫颈癌细胞的抑制作用与相关机制。方法:选取HPV(+)的Hela和HPV(-)的C-33A宫颈癌细胞株为研究对象。CCK-8法检测细胞活性,流式细胞术检测辣椒碱对细胞生长的抑制作用、细胞周期和对细胞凋亡的影响;q PCR和Western blot法检测细胞凋亡相关基因m RNA和蛋白表达。结果:辣椒碱对宫颈癌Hela和C-33A细胞增殖抑制呈浓度和时间依赖性;辣椒碱能显著促进两种细胞凋亡,对Hela细胞的促凋亡效果更明显。辣椒碱处理后,两种细胞的细胞色素C(cytchrome C)和caspase3表达量显著增加,Bax表达量增加,Bcl-2表达量降低。结论:辣椒碱可显著抑制宫颈癌Hela和C-33A细胞增殖和促进细胞的凋亡,其机理可能是通过诱导细胞内活性氧类物质(ROS)增加、细胞色素C和Caspase3表达量增加等途径,最终诱导细胞凋亡。     

外源性PUMA表达对人乳头瘤病毒阳性宫颈癌放疗敏感性的影响

目的 探讨外源性PUMA(p53 up-regulated modulator of apoptosis)基因对人乳头瘤病毒(HPV)阳性宫颈癌放疗敏感性的影响.方法 以重组腺病毒为载体,将PUMA基因导入HPV阳性宫颈癌细胞HeLa和caSki.应用MTT法比较携带PUMA的复制缺陷型重组腺病毒(Ad-PUMA)和携带野生型p53基因的复制缺陷型重组腺病毒(Ad-p53)对HeLa和Caski细胞增殖的影响,平板克隆方法检测Ad-PUMA与X射线联合应用后对细胞生长的影响,并通过DAPI染色、流式细胞检术检测细胞凋亡情况.Western Blot法检测x射线处理后HeLa细胞PUMA表达.结果 (1)Ad-PUMA能够明显抑制HeLa和CaSki细胞增殖,增加细胞凋亡,而Ad-p53对细胞生长无明显抑制作用.(2)X射线能够诱导HeLa细胞PUMA表达升高,具有时间和剂量效应.(3)Ad-PUMA与X射线联合应用后可显著增加细胞凋亡,减少平板克隆形成数,但Ad-PUMA对X射线引起的G2期阻滞无明显影响.结论 PUMA在放射线诱导肿瘤细胞凋亡的过程中发挥作用.Ad-PUMA抑制宫颈癌细胞增殖,诱导细胞凋亡.Ad-PUMA与X射线联合应用后显著提高宫颈癌细胞放疗敏感性.     

LATS1在宫颈癌中的表达及其生物学特性的实验研究

目的:探讨LATS1在宫颈癌中表达的临床意义及生物学特性。方法:免疫组化法检测80例宫颈癌组织中LATS1蛋白表达;分别以Si Ha及Caski细胞系为媒介,进行LATS1转染及干扰实验;MTT及基质胶侵袭实验检测细胞增殖和侵袭能力。结果:80例宫颈癌组织中LATS1低表达的比例约为45%(36/80);LATS1过表达抑制了宫颈癌细胞的增殖和侵袭,LATS1过表达上调p27表达量的同时下调cyclin E及MMP-9的表达量。LATS1过表达刺激了YAP的磷酸化过程。敲除LATS1的Caski细胞系中则呈现相反的结果。结论:在宫颈癌中,LATS1发挥肿瘤抑制剂的功能,在肿瘤细胞增殖和侵袭过程中发挥重要作用。     

γ-分泌酶抑制剂DAPT对宫颈癌细胞系及HPV16亚基因转化的永生化人宫颈上皮细胞系作用的研究

目的:研究γ-分泌酶抑制剂DAPT对宫颈癌细胞系以及HPV16亚基因转化的永生化人宫颈上皮细胞系的作用,探讨DAPT临床治疗宫颈癌的可行性。方法:体外培养宫颈癌Siha、HeLa细胞系和HPV16亚基因转化的永生化人宫颈上皮细胞系(CRL2614)。加入不同浓度的γ-分泌酶抑制剂DAPT,不同时间点终止细胞生长,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色方法检测细胞生长情况;使用流式细胞计数仪检测细胞增殖周期中增殖指数(PI)、S期细胞比例(SPF)和凋亡细胞百分比。结果:应用MTT法检测细胞生长情况,5μmol/L及10μmol/LDAPT作用宫颈癌细胞系72h,可显著抑制其生长(P均0.05)。10μmol/LDAPT对CRL2614细胞系作用72h无抑制作用(P0.05)。流式细胞计数仪检测细胞增殖周期及细胞凋亡百分比。用5μmol/L及10μmol/LDAPT作用宫颈癌细胞系24,48,72h均可见SPF、PI明显降低,凋亡细胞百分比明显增加(P均0.05)。10μmol/LDAPT作用CRL2614细胞系72h对SPF、PI及凋亡细胞百分比无影响(P0.05)。结论:DAPT能抑制宫颈癌HeLa、Siha细胞系增殖,促进肿瘤细胞凋亡,对HPV16亚基因转化的永生化人宫颈上皮细胞系的增殖和凋亡没有明显影响。DAPT可能为药物治疗宫颈癌提供新思路。     

LncRNA MALAT1靶向miR124-3p/STAT3对宫颈癌细胞增殖和侵袭的影响

目的探究LncRNA MALAT1靶向miR124-3p/STAT3对宫颈癌细胞增殖和迁移的影响及其分子机制。方法采用RT-PCR检测Ect1/E6E7、Hela、SiHa和C33a细胞中LncRNA MALAT1的mRNA表达水平;构建慢病毒稳定细胞系,采用双荧光素酶报告基因分析LncRNA MALAT1和miR-124-3p-OE的靶向关系;采用MTT法检测细胞的增殖活力;采用Transwell分析细胞的侵袭情况;采用Western blot检测细胞中STAT3的蛋白表达。结果与Ect1/E6E7细胞比较,Hela、SiHa和C33a细胞中LncRNA MALAT1的mRNA相对表达水平明显上升(P 0.05)。双荧光素酶报告基因检测显示LncRNA MALAT1靶向作用miR-124-3p并下调其表达水平(P 0.05)。LncRNA MALAT1敲降或miR-124-3p过表达均可显著抑制宫颈癌细胞的增殖和侵袭,并下调STAT3的蛋白表达(P0.05)。结论 LncRNA MALAT1通过下调miR-124-3p/STAT3分子轴促进宫颈癌细胞的增殖和迁移,有望为宫颈癌的早期诊断和临床治疗提供新的思路。     

HPV16 E6E7癌蛋白通过TWEAK/Fn14信号途径对细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨HPV16 E6E7对TWEAK/Fn14信号途径及细胞增殖和凋亡的影响。方法:制备表达HPV16 E6E7的逆转录病毒,感染原代角质形成细胞。用流式细胞仪分析可诱导纤维母细胞生长因子14(Fn14)表达,Real-time RT-PCR和Western blot法检测调解活化正常T细胞表达和分泌的趋化因子(RANTES)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、干扰素-γ诱导蛋白10水平(IP10)和肿瘤坏死因子(TNF)受体相关因子(TRAF2)表达,生物化学法检测Ras GTpase活性,TUNEL检测细胞的凋亡,MTT法检测细胞增殖。结果:表达HPV16 E6E7的逆转录病毒感染角质形成细胞后,Fn14高表达,RANTES、MCP-1、IP10和TRAF2表达增加,Ras GTpase活性升高。与未感染表达HPV16 E6E7逆转录病毒的细胞比较,表达E6E7感染的角质形成细胞对TNF-α刺激不敏感,细胞增殖显著增加(P0.05)。结论:表达HPV16 E6E7细胞激活TWEAK/Fn14信号途径,从而上调RANTES和TRAF2表达,导致细胞增殖,这可能是高危型HPV的一个致病机制。     

表达谱基因芯片筛选子宫颈癌甲基化差异基因的研究

目的筛选人乳头瘤病毒（HPV）阳性宫颈癌细胞系中由于HPV感染诱导沉默的特异抑癌基因,探讨HPV感染可能导致抑癌基因发生甲基化的机制。方法选取HPV阳性HeLa和Caski宫颈癌细胞系和HPV阴性C-33A和HT-3宫颈癌细胞系,分别经去甲基化药物5-氮杂-2′-脱氧胞苷（5-Aza～CdR,Aza）处理,采用Agilent人类全基因组表达谱芯片检测Aza处理前后细胞全基因组的表达水平,采用实时荧光定量PCR（RTqPCR）验证芯片结果,亚硫酸氢盐-基因组测序法（BGS）检测目的基因甲基化水平。结果①芯片结果显示：HPV阳性和阴性细胞系共721条基因表达存在差异。②用药后表达显著上调的基因：HeLa细胞系825条,Caski细胞系815条,c_33A细胞系1023条,HT-3细胞系1196条。HeLa和Caski细胞系共表达上调的基因为182条,剔除阴性细胞系共表达上调基因,筛选出阳性细胞系HPV相关表达上调基因97条,与阴性细胞系基因表达比较,差异有统计学意义（P〈0．01）,最终筛选出13条差异表达基因,其中具有功能者7条。③RT-qPCR结果：筛选基因在宫颈癌细胞系中的表达与芯片检测结果一致;HPV阳性宫颈癌细胞系中甲基化频率明显高于阴性细胞系,支持芯片结果。结论筛选出的7条新的潜在抑癌基因可能由于HPV感染诱导发生甲基化而沉默,为进一步探讨HPV诱导抑癌基因发生甲基化的机制提供实验基础。