细胞周期与视网膜色素上皮细胞的生长

目前玻璃体视网膜手术在治疗PVR方面取得了巨大成功但是手术并不能完全阻止甚至可能刺激RPE细胞的迁移和增殖,从而导致PVR的复发。RPE细胞是参与PVR形成的一种重要细胞,因此有关药物抑制RPE细胞增殖的研究受到重视,本文综述了近年来影响RPE细胞周期药物的研究进展.展望了通过调控RPE细胞周期来抑制细胞增殖以防治PVR的前景。     

神经生长因子对人胚胎视网膜色素上皮细胞生长及其DNA合成的影响

目的　探讨神经生长因子 (NGF)对体外培养的人胚胎视网膜色素上皮 (RPE)细胞的促增殖作用及DNA合成的影响。方法　分别用MTT法测定加入NGF 10 0、2 0 0、30 0 μg/L 48h后人RPE细胞数量的改变和核酸蛋白分析仪测定加入NGF 5 0、10 0、2 0 0、30 0、40 0 μg/L 48h后人RPE细胞DNA质量浓度的变化。 结果　 10 0、2 0 0、30 0 μg/LNGF作用 48h后其细胞增殖的A值分别为 ( 0 2 137± 0 0 2 33)、( 0 2 188± 0 0 181)、( 0 2 32 2± 0 0 16 4) ,与对照组 ( 0 1897± 0 0 15 2 )相比 ,差异有显著性 (q test ,P <0 0 5 ) ;10 0、2 0 0、30 0、40 0 μg/LNGF作用 48h后其细胞DNA质量浓度分别为 ( 981 2 2 0 4± 12 3 5 35 7)、( 1375 8484± 2 44 4 718)、( 16 5 8 70 71± 176 9381)、( 2 35 3 0 86 3± 6 0 9 90 6 4) μg/ml ,与对照组 ( 6 6 6 8188± 14 1 330 2 ) μg/ml相比差异有显著性 (q test,P <0 0 5 )。结论　NGF可促进人RPE细胞增殖及促进细胞DNA合成。     

二甲基亚砜对培养人视网膜色素上皮细胞增殖的影响

目的　探讨细胞分化诱导剂及端粒酶抑制剂二甲基亚砜 (dimethylsulfoxide ,DMSO)对人视网膜色素上皮细胞增殖的抑制作用。方法　本研究分实验组和对照组 ,对照组弃原培养液 ,加无血清培养液继续培养 ,实验组用不同浓度的DMSO 5、10、2 0、4 0mL·L-1分别作用于人RPE细胞 2 4、4 8、72、96h ,用MTT法检测DMSO对hRPE细胞生长的影响 ,流式细胞仪检测DMSO对hRPE细胞周期的影响。结果　 10mL·L-1DMSO处理的hRPE细胞从作用 4 8h开始 ,OD值 ( 0 .5 37± 0 .0 10 )小于对照组 ( 0 .6 4 7± 0 .0 2 2 ) ,有显著性差异 (P <0 .0 0 1) ,细胞生长受到抑制 ,且随浓度增加及作用时间延长 ,抑制越显著。流式细胞仪检测 2 0mL·L-1DMSO作用 72h细胞周期发生明显变化 ,G1期细胞由4 1 31%增加至 5 9.6 5 % ,S期由 32 .0 9%减至 2 1.2 1% ,G2 期由 2 6 .6 5 %减至 19 14 % ,细胞生长被阻滞在G1期 ,生长受到抑制。结论　DMSO能阻滞hRPE细胞于G1期 ,抑制hRPE细胞增殖且呈剂量依赖性。     

内皮素对人视网膜色素上皮细胞黏附的影响

目的 探讨内皮素-1(endothelin-1,ET-1)对人视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium,RPE)黏附作用的影响.方法 用RPE黏附实验和放射免疫测定法检测不同浓度ET-1对RPE黏附的影响和6-Keto-PGFal的浓度变化.结果 10-11～10-mol·L-1～ET-1对RPE细胞黏附力呈剂量依赖性增加,而RPE细胞黏附力随着ET-1浓度的进一步增加(10-9～10～mol·L-1)呈剂量依赖性下降(F=6.352,P＜0.01);黏附实验上清液中6-Keto-PGFα1含量随着ET-1浓度增加呈浓度依赖性增加(F=33.929,P＜0.01).结论 ET-1对RPE有促进黏附作用,ET-1刺激后6-Keto-PGFα1含量上升,与RPE细胞对ET-1作出的反应有关,并抑制ET-1作用.     

玻璃体条件培养液对人视网膜色素上皮细胞生长活性及细胞周期的影响

目的:探讨在含有人玻璃体的条件培养液作用下体外培养的人视网膜色素上皮(HRPE)细胞形态学、细胞生长活性及细胞周期的改变.方法:将HRPE细胞培养在含100,250,500,1 000mL/L人玻璃体的DMEM条件培养液(VCM).用倒置显微镜观测细胞的形态学改变,分别用MTT、流式细胞术检测细胞的生长活性及细胞周期的改变.结果:不同体积分数的VCM使HRPE细胞的形态发生了改变,HRPE细胞出现了多核及更早的脱色素,类似成纤维细胞表型的生长状态.含100,250及500mL/L玻璃体体积的VCM处理后HRPE细胞的增长活性与对照组相比存在显著性差异(P均＜0.01),其中含250mL/L玻璃体的VCM刺激HRPE细胞增生的能力最强.VCM促使更多的HRPE细胞进入了DNA合成期(S期,6%～13%),含250与500mL/L玻璃体体积的VCM使HRPE细胞出现了异倍体的改变.结论:一定体积分数的VCM使HRPE细胞的S期比例增加,细胞增生能力增强.     

人视网膜色素上皮细胞NF-kB的表达

目的探讨核因子闎(NF-кB)在体外培养的人视网膜色素上皮(human retinal pigment epithelium,hRPE)细胞中的基础表达以及吡咯二硫代氨基甲酸乙酯(pyrollidi ne dithiocarbamate,PDTC)、IL-1β对NF-кB表达的影响. 方法体外培养的hRPE细胞经同步化后分2组分别加药(1)无PDTC组分别加入IL-1β、生理盐水(用于检测NF-кB在hRRE中的基础表达);(2)PDTC组分别加入IL-1β、生理盐水(用于检测NF-кB在PDTC预处理后hRPE中的表达).免疫荧光抗体染色、流式细胞计数法(flow cytometry, FCM)测定上述2组标本中hRPE的NF-кB的表达率. 结果 NF-кB在hRPE中的基础表达率为8.05 %,IL-1β作用后表达率升高到30.26%; hRPE细胞经PDTC预处理后,NF-кB的表达率下降为3.74%,加入IL-1(10 υg·L-1)作用后表达率为3.66%. 结论 IL-1β可以显著提高NF-кB在hRPE细胞中的表达;PDTC可以显著降低体外培养的hRPE中的NF-кB表达率,PDTC亦可显著抑制由IL-1β诱导的NF-кB的活化过程.     

电场对人视网膜色素上皮细胞增生的影响

目的观察一定条件下电场对人视网膜色素上皮(human retinal pigment epitheli-um,hRPE)细胞增生的影响及相关机制。方法hRPE细胞置于电场强度为6V.cm-1的电场中连续作用12h。观察未受电场作用的正常对照组及电场作用12h的实验组细胞,显微摄像系统记录不同时间点细胞图像并计数细胞数,检测细胞密度和细胞的生长速度,观测指标包括:细胞密度,以每平方厘米细胞数表示;细胞生长速度,计算公式为:(Ni-N0)/N0×100%(Ni为12h细胞数;N0为0h细胞数);采用流式细胞仪测定细胞周期,计算细胞增生指数:(NS+NG2/M)/N(NS为S期细胞数;NG2/M为G2/M期细胞数;N为细胞总数);Western blotting检测细胞cyclinE蛋白的表达。结果对照组hRPE细胞在12h的观察期间内细胞密度缓慢上升,到12h时细胞密度由95×103cm-2增至130×103cm-2;而实验组在6V.cm-1电场作用下hRPE细胞数量逐渐上升,12h后细胞密度上升至150×103cm-2。实验组hRPE细胞生长速度为50.02%,较对照组(36.84%)明显升高(P<0.05);...     

重楼皂苷Ⅰ对人视网膜色素上皮细胞系ARPE-19增殖的影响

目的 探讨重楼皂苷Ⅰ对人视网膜色素上皮细胞系(ARPE-19)的增殖和凋亡的影响.方法 不同浓度(1.5 mg·L-1、3.0 mg·L-1、6.0 mg·L-1)重楼皂苷Ⅰ作用下的ARPE细胞,CCK-8法检测重楼皂苷Ⅰ对ARPE-19细胞增殖的影响;流式细胞仪检测ARPE-19细胞周期变化及细胞凋亡水平;Western blot检测ARPE-19细胞内Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、Cyclin D1、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达.结果 1.5 mg· L-1、3.0 mg·L-1、6.0 mg·L-1重楼皂苷Ⅰ处理后细胞存活率分别为(68.945±5.647)％、(58.637±5.266)％、(47.338±6.493)％,均低于空白对照组的(98.600±7.803)％;凋亡率分别为(9.622±0.315)％、(26.123±0.331)％、(34.345±0.621)％,均高于空白对照组的(4.512±0.213)％;G0/G1期比例分别为(68.520±2.630)％、(75.222±2.627)％、(81.792±3.931)％,均高于空白对照组的(54.632±2.506)％.重楼皂苷Ⅰ处理对ARPE-19细胞ERK1/2蛋白表达无明显影响,但下调Cyclin D1、Bcl-2和p-ERK1/2蛋白的表达,上调Bax、cleaved caspase-3蛋白的表达.结论 重楼皂苷Ⅰ通过下调Cyclin D1的表达将ARPE-19细胞阻滞于G1期,抑制细胞增殖.通过抑制ERK信号通路,活化线粒体凋亡通路,诱导细胞凋亡.本研究为中药重楼治疗增生性玻璃体视网膜病变提供了依据.     

肝细胞生长因子对人视网膜色素上皮细胞表型的影响

目的 探讨肝细胞生长因子(HGF)对人视网膜色素上皮(RPE)细胞形态及细胞表面抗原的影响.方法 体外培养人RPE细胞,分别采用0.4%小牛血清和重组人HGF因子刺激人RPE细胞,应用相差显微镜观察细胞形态变化;免疫组织化学方法 检测细胞表面抗原细胞角蛋白、波形蛋白、成纤维细胞特异性蛋白-1(Fsp-1)的表达变化;采集经HGF(20 ng/mL)刺激后0、12、24、48 h的RPE细胞应用RT-PCR方法 观察Fsp-1mRNA的表达变化.结果 体外培养的人RPE细胞,在含0.4%小牛血清培养液中呈多角形,贴壁生长融合后呈铺路石样;细胞角蛋白的表达阳性率为89.7%,波形蛋白阳性率为100%,Fsp-1阳性率为45.3%.HGF(20 ng/mL)刺激24 h后,细胞呈长梭形,具有成纤维细胞形态特征;细胞角蛋白阳性率为50.1%(χ2=38.1,P＜0.01),Fsp-1阳性率为91.2%(χ2=48.62,P＜0.01),而波形蛋白表达无明显变化.HGF作用后,Fsp-1mRNA表达升高(F=13.761,P=0.002). 结论 HGF促进人RPE细胞向成纤维细胞的表型转化,提示HGF在RPE细胞上皮-间质转化过程中起重要作用.     

溶血磷脂酸对人视网膜色素上皮细胞增殖的影响

目的 :探讨建立体外原代培养人类视网膜色素上皮细胞 (RPE)方法。方法 :取自愿者贡献的意外事故成年眼球 ,用 0 .2 5 %胰酶消化获取人RPE细胞、置 15 %胎牛血清的DMEM培养液中培养 ,细胞接近融合状态时进行传代培养。用溶血磷脂酸 (lysophosphatidicacid ,LPA)观察RPE增殖的影响。结果 :RPE原代细胞镜下为圆形 ,大小不一 ,内含较多的色素颗粒 ,胞核无法辨认。原代细胞培养贴壁后第 3天增殖速度明显加快 ,至 4～ 5d即可基本融合 ,细胞浆内色素颗粒则随传代次数增多而逐渐减少。第 3代培养的视网膜色素上皮细胞膜表面可见微绒毛 ,细胞质内细胞器丰富 ,线粒体量多 ,体积较小 ,内外膜分界清晰 ,嵴较短。色素颗粒散在分布于胞浆内 ,多数细胞质内含量较少 ,呈高电子密度包含物。LPA对原代培养的视网膜色素上皮细胞增殖有促进作用。结论 :LPA可促进人类RPE细胞体外培养的增殖 ,第 3代培养的视网膜色素上皮细胞可保留原代细胞的生物学特性     

组织型纤溶酶原激活剂对人视网膜色素上皮细胞的抑制

目的：探讨组织型纤溶酶原激活剂（tissue-type plasminogen activator,tPA)对人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelial,RPE)细胞的作用。方法：运用活细胞计数法和甲基噻咪基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)比色实验观察分析tPA对人RPE细胞增殖的抑制作用,应用流式细胞仪（flow eytometry,FCM)分析人RPE细胞周期。结果：0．1－3μg/ml tPA对人RPE细胞有抑增殖作用,其效应与药物浓度和作用时间呈正向依赖关系（P＜0．01）;5μg/ml tpA对人RPE细胞有致死毒性作用。RCM显示tPA作用后S期细胞增加9．8％（P＜0．05）,G2M期减少6．6％（P＜0．05）。结论：tPA在一定时间和剂量范围内对人RPE细胞具有抑增殖作用,且不对细胞产生致死毒性;tPA主要延迟／阻滞人RPE细胞于S期。     

体外培养视网膜色素上皮细胞对成纤维细胞生长的促进作用

观察体外培养的视网膜色素上皮细胞条件培养液对成纤维双细胞生长的影响。利用＾３Ｈ胸嘧啶核苷掺入法和 细胞计数法首次显示了视网膜色素上此细胞条件培养液对成纤维细胞生长有促进作用。     

MicroRNA-96对人视网膜色素上皮细胞增殖与迁移的影响

目的：探讨MicroRNA-96（miR-96）对人视网膜色素上皮（RPE）细胞增殖和迁移的影响。方法：实验研究。通过RNA原位杂交检测人胚胎眼（20周）石蜡切片中RPE层miR-96的表达情况。将miR-96和阴性对照（NC）通过阳离子脂质体介导转染人眼RPE细胞,采用细胞增殖实验（MTS）、流式细胞术和Transwell实验分别检测细胞增殖、细胞周期以及细胞迁移能力。通过生物信息学及Western blot法确定miR-96作用的靶基因。应用Western blot检测miR-96对细胞增殖迁移相关信号通路蛋白（Akt、ERK）及细胞周期相关蛋白（p-Cdc2、CyclinD2、p-Rb）表达的影响。组间数据比较采用独立样本t检 验。结果：MiR-96在人眼RPE细胞中有表达。MTS结果显示,转染NC、miR-96后,人眼RPE细胞的相对增殖速率分别为100%、74%±2%,差异有统计学意义（t=42.174,P=0.002）。流式细胞术检测结果显示,转染miR-96后阻滞在G1期的RPE细胞显著多于转染NC后,且差异有统计学意义（t= -18.444,P=0.003）。Transwell实验结果显示,与转染NC相比,转染miR-96能显著抑制RPE细胞的迁移,差异具有统计学意义（t=6.754,P=0.002）。进而,明确了MITF是miR-96作用的靶基因。Western blot检测结果显示,转染miR-96后细胞中细胞周期相关蛋白p-Rb（t=11.211,P=0.002）、p-Cdc2（t=9.133, P=0.003）、CyclinD2（t=7.542,P=0.005）以及迁移相关信号通路蛋白p-ERK（t=16.699,P<0.001）,p-Akt （t=23.552,P<0.001）的表达水平均降低。结论：miR-96通过作用于靶基因MITF,并调控细胞周期和迁移相关蛋白的表达从而抑制人RPE细胞的增殖和迁移。     

Modification of Isolation and Culture of Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Purpose: To modify the isolation of human retinal pigment epithelial (RPE) cells and to increase the purification and production of cultured RPE cells.Methods: The human eyecups were fixed on a rubber holder. After digestion by trypsin, RPE cells were collected, then cultured and identified by morphology, im-munohistochemistry and electron microscopy.Results: The cultured RPE cells grew actively in the early stage with transparent nucleus and abundant melanin particles in cytoplasm. These cells were positive in DOPA oxidase reaction and in anti-pancytokeratin antibody staining. Cellular microvilli and tight junctions could be seen through transmission electron microscopy. Conclusion: We developed a rubber holder to fix the eyecup. Using this holder, more and purer cultured RPE cells can be obtained. These cultured RPE cells are similar to those in vivo in morphology and immunohistochemical staining. Eye Science 1999; 15: 187 - 190.     

TIMP-1 Production in Human Retinal Pigment Epithelial Cells after Laser Exposure

Purpose: To investigate changes in the production of tissue inhibitor of metalloproteinase type 1 (TIMP-1) by human retinal pigment epithelial (RPE) cells following argon laser exposure. Methods: Human cultured ARPE19 cells were exposed to argon green laser at four different energy levels ranging from 60mW to 360mW. After laser exposure, the culture media were sampled at 0, 24, 72 and 144 hours for TIMP-1 concentration produced by the RPE cells. The levels of TIMP-1 in the cells treated with different laser energy levels were compared with a control group not exposed to laser application. Immunocytochemistry for proliferating cell nuclear antigen (PCNA) was performed to detect any adverse effects on the RPE cells caused by laser exposure. Results: Immediately after laser exposure, the concentration of TIMP-1 was not detectable. At 24 hours after laser exposure, the concentration of TIMP-1 increased significantly in RPE cells treated with 120mW and 240mW at 24 hours (P=0.006 and P=0.001 respectively) comp     

光诱导对人视网膜色素上皮细胞自噬和凋亡的影响

研究人视网膜色素上皮（RPE）细胞光损伤中自噬与凋亡之间的关系,并探讨自噬抑制剂3甲 基腺嘌呤（3MA）对光诱导下RPE细胞自噬和凋亡的影响。方法：实验研究。将体外培养的人RPE细 胞（ARPE-19）随机分为12 h对照组、12 h模型组、12 h 3MA组以及24 h对照组、24 h模型组、24 h 3MA组。对照组采用锡纸包裹避光培养;模型组接受光照刺激;3MA组中加入3 mmol/ml 3MA后接 受光照刺激,以自制三基色LED（发光二极管）冷光灯作为光源,在（16 500±500）lx光照强度下照 射细胞12 h和24 h。透射电子显微镜观察每组细胞超微结构,流式细胞仪测定细胞存活率,激光共 聚焦结合倒置荧光显微镜定性、定量分析自噬-溶酶体形态及荧光强度,Western blot法检测Beclin 1、 LC3和P62自噬相关蛋白表达量。数据采用单因素方差分析。结果：在光照12 h后,ARPE-19细胞自 噬水平可以抵抗光损伤,降低细胞凋亡率（F=931.53,P<0.001）;光照24 h后细胞自噬水平超过其正 常调节范围,细胞凋亡率升高,差异有统计学意义（F=1156.67,P<0.001）;使用3MA可抑制光诱导 的ARPE-19细胞过度自噬,降低细胞凋亡率（F=2.856,P=0.027）,进而保护细胞以应对光损伤。结论： ARPE-19自噬水平随光照时间而变化;随着光照时间延长,细胞凋亡率升高。抑制细胞的过度自噬 可以保护ARPE-19细胞应对光损伤。     

姜黄素对培养的人胚胎视网膜色素上皮细胞增殖活性的影响

目的:研究姜黄素(curcumin,CUR)对培养人胚胎视网膜色素上皮(human fetal retinal pigmentepithelium,hfRPE)细胞增殖的影响。方法:用不同浓度CUR(2.5,5,10,20μg／ml)处理传代培养的hfRPE细胞24~48 h,采用MTT法和流式细胞术观察药物对hfRPE细胞增殖和细胞周期的影响。结果:CUR可明显抑制hfRPE细胞增殖,24、48 h的半数抑制浓度(IC50)分别为14.27μg／ml和12.7μg／ml;流式细胞仪分析表明姜黄素将hfRPE细胞阻滞在G2／M期。结论:在一定浓度范围内,姜黄素通过改变hfRPE细胞的周期分布来抑制其增殖。     

Influence of IL-1β and TNF-α on Fas Expression of Human Retinal Pigment Epithelial Cells in Vitro

Purpose: To observe Fas expression change of cultured human retinal pigment epithelial (RPE) cells by IL-lβ and TNF-α. Methods: With flow cytometry, immunohischemistry, and color imaging system, Fas expressions by exposure to IL-1β and/or TNF-α were measured. Results:The gray degree values of Fas expression were 67.5 ±6.1 in IL-1β+TNF-α-treated group, 80.1 ±9.2 in IL-1 β-treated group, and 70.4±6.4 in TNF-α-treated group, respectively. There were significant differences (P ＜ 0.005) compared with control group (107.0±10.2). Flow cytometry showed that 15.0% cultured human RPE cells expressed Fas. Fas-positive in IL-lβ, TNF-α, and IL-lβ+TNF-α-treated groups expressed was 28.1%, 34.5%, and 65.2%, respectively. Conclusion: IL-1 β, TNF-α, and combining both of them can up-regulate Fas protein expression, which may contribute to more Fas (+) cells in proliferative vitreoretinopathy PVR). Minimizing this process by means of inducing apoptosis of Fas (+) proliferative cells of Fas/FasL pathway is a future preventive and therapeutic possibility for PVR. Eye Science 2004;20:39-41.     

三氟啦嗪对视网膜色素上皮细胞cAMP-PKA信号系统的影响

目的 :检测TFP对培养的豚鼠RPE细胞cAMP浓度和PKA活性的影响。探讨CaM被抑制时 ,与cAMP -PKA信号系统相关性及在RPE细胞增殖调控中的作用。从信号传导角度探讨TFP抑制RPE细胞迁移和增殖的机制。方法 :1 应用12 5I -cAMP试剂盒 ,采用放免法测定 10umol/LTFP作用不同时间RPE细胞内cAMP浓度的变化。 2 应用液闪法测定 10umol/LTFP作用不同时间后 ,RPE细胞PKA活性的变化。结果 :1 TFP对豚鼠RPE细胞cAMP浓度的影响 :统计结果表明 ,与对照组cAMP值 ( 0 410 9± 0 0 931pmol/5 0ul)相比 ,TFP作用 5分钟内即引起cAMP快速的升高达 ( 0 80 5 1± 0 5 5 3pmol/5 0ul) (P <0 0 1) ,直到 3小时仍维持较高的水平 ( 0 72 85±0 0 2 94pmol/5 0ul) (P <0 0 5 )。 2 TFP对豚鼠RPE细胞PKA活性的影响 :统计结果表明 ,与对照组PKA活性值 ( 4 5 5 73±2 41cpm/mgprotiein)相比 ,TFP作用 5min内即引起PKA活性快速上升达 ( 135 6 5± 1 81cpm /mg protein) (P <0 0 1) ,直至3h仍维持较高水平 ( 6 5 95± 5 0 1cpm/mg protein) (P <0 0 5 )。结论 :1 在TFP抑制RPE细胞增殖过程中 ,cAMP -PKA信号系统呈上调趋势。 2 在RPE细胞增殖抑制过程中 ,Ca2 + -CaM系统与cAMP -PKA信号系统存在着拮抗关系。 3 在TFP引起cA