H7N9禽流感病毒对人类致病的分子基础分析

【目的】 了解H7N9禽流感病毒对人类致病的分子特征,为更好地预防与治疗H7N9人禽流感提供科学依据。【方法】 从GISAID数据库中下载中国2013年分离的所有H7N9禽流感病毒株的基因及蛋白序列,并从NCBI数据库中下载其他相关的流感病毒序列,运用生物信息学软件分析H7N9禽流感病毒基因的系统进化特征?受体结合位点?宿主特异位点?飞沫传播关键氨基酸位点?致病及毒力相关位点?耐药性位点及潜在糖基化位点等的变异情况。【结果】 2013年中国流行的H7N9禽流感病毒为四源重组病毒, 所有基因片段均来源于禽类,不含任何人流感病毒基因;病毒HA的受体结合位点发生了2个关键氨基酸的变异(G186V和Q226L);在与飞沫传播有关的关键氨基酸位点中,个别氨基酸已发生了变异(T160A? Q226L);该病毒具有8个毒力增强位点;所有分离株的M2均发生了 S31N变异;分离株A/Shanghai/1/2013的NA的耐药位点发生了R294K变异;所有毒株的潜在糖基化位点均相对保守。【结论】 H7N9禽流感病毒为四源重组的新型禽流感病毒。该病毒具有与人呼吸道上皮细胞SAa-2,6 Gal受体结合的分子基础,但目前尚未获得经飞沫传播的充分条件,人传人的可能性不大。该病毒具有低致病性禽流感病毒的分子特征,表明对禽类致病性不强,但其对人类呈高致病性,这可能与其毒力位点的特征有关。所有分离毒株均发生了对离子通道抑制剂金刚烷胺类药物的耐药性突变,个别毒株已发生了对神经氨酸酶抑制剂奥司他韦(达菲)的耐药性突变。     

新型甲型H7N9流感病毒神经氨酸酶基因进化分析

目的探讨2013年新型甲型H7N9流感病毒神经氨酸酶(NA)基因的进化,及其编码蛋白重要氨基酸位点的变异情况。方法从美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库和全球禽流感基因共享数据库(GISAID)下载不同年代、不同地区甲型流感病毒N9亚型的NA基因序列,利用MEGA 5.05和BioEdit软件对基因的核苷酸序列和氨基酸序列进行分析。结果 2013年新型甲型H7N9流感病毒NA基因与2010年捷克共和国H11N9禽流感病毒的相似性达到96%;新型流感病毒存在5个氨基酸的缺失;其中1株新型病毒可能的酶活性位点发生了变异。结论 2013年新型甲型H7N9流感病毒的NA基因可能是由H11N9进化而来;氨基酸的缺失可能是造成人感染和较高病死率的原因。     

江苏省2013年甲型H1N1(09pdm)流感病毒血凝素和神经氨酸酶分子特征分析

目的:分析江苏省2013年甲型H1N1(09pdm)流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)变异情况,分析其遗传进化特征?方法:按照流感样病例定义,收集江苏省各哨点医院流感样病例标本,阳性样本经病毒分离培养及亚型鉴定?选取2013年不同时间段?不同地区具有代表性的14株甲型H1N1(09pdm)阳性毒株,利用特异性引物扩增HA?NA基因,测序并分析其遗传进化特征?结果:14株分离毒株与疫苗株A/California/07/2009(H1N1)的HA基因核苷酸和氨基酸同源性分别为97.6%~98.4%和96.5%~98.0%?NA基因核苷酸和氨基酸同源性分别为98.4%~98.9%和97.0%~98.5%?遗传进化分析表明,14株分离株HA和NA基因分属于不同的进化谱系?分子特征表现为HA氨基酸序列出现D114N?K300E?E516K的变异,NA分子特征表现为N44S位点变异?从2013年左右开始甲型H1N1(09pdm)流感基因多样性增加;通过FEL模型得到一个正向压力选择HA氨基酸位点310,一个正向压力选择NA氨基酸位点4,通过REL模型得到9个正向压力选择HA氨基酸位点179?180?239?301?303?310?311?312?313(含位点310),5个正向压力选择NA氨基酸位点4?23?52?287?374(含位点4)?HA蛋白具有9个潜在糖基化位点,7个位于HA1上,2个位于HA2上;NA蛋白共有9个潜在糖基化位点?14株分离毒株在NA蛋白酶活性中心及周围辅助位点上均未发现变异?结论:2013年江苏省甲型H1N1(09pdm)流感HA?NA基因变异加快,遗传多样性增加,未来的遗传进化值得进一步关注?     

2009年新型甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶基因进化分析

目的:探讨2009年新型甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶(NA)基因的进化及NA基因编码蛋白抗原性、酶活性位点、糖基化位点变异情况。方法:从NCBI基因库检索获得43株不同年代不同地域甲型流感病毒NA基因序列,用Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 4.0（MEGA 4.0）软件进行基因进化分析和氨基酸序列分析。结果:2009年新型甲型H1N1流感病毒与禽H5N1流感病毒NA基因的同源性达到85％,潜在抗原位点氨基酸分布相同;所有毒株的酶活性中心位点高度保守,但糖基化位点有变异。结论:2009年新型甲型H1N1流感病毒的NA基因可能来源于禽H5N1流感病毒;神经氨酸酶抑制剂治疗有效。     

2009年新型甲型H1N1流感病毒血凝素基因进化分析

目的:探讨2009年新型甲（A）型H1N1流感病毒血凝素（HA）基因与世界各地不同年代分离的A/H1N1代表株HA基因的进化关系。方法:从NCBI数据库下载2009年新型A/H1N1亚型流感病毒的HA基因序列以及以往流行的人、猪和禽的A/H1N1亚型流感病毒参考序列,采用Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 4.0（MEGA4.0）软件进行序列比对和构建系统进化树,并分别比较2009年新型甲型H1N1流感病毒HA基因与北美地区、欧洲地区、亚洲地区A/H1N1流感病毒HA基因编码蛋白的氨基酸序列。结果:不同时期人A/H1N1亚型流感病毒代表株HA基因进化分析显示：2009年新型A/H1N1流感病毒HA基因与1976~2007年北美地区分离的7株人A/H1N1亚型流感病毒具有较高的同源性,与欧洲和亚洲地区的同源性较低。不同种属间A/H1N1亚型流感病毒HA基因进化分析显示：2009年新型A/H1N1流感病毒HA基因与1998和2007年北美地区分离的A/H1N1猪流感病毒的HA基因进化关系较近,与欧洲及亚洲地区分离的A/H1N1猪流感病毒及A/H1N1禽流感病毒进化关系较远。氨基酸比对结果显示2009年新型A/H1N1流感病毒HA基因的重要抗原位点与北美地区分离的A/H1N1猪流感病毒相近,与欧洲和亚洲地区分离的A/H1N1猪流感病毒及人类流感病毒疫苗株相比变化较大。结论:2009年新型甲型H1N1流感病毒HA基因可能是北美地区甲型H1N1猪流感病毒长期进化并与该地区人A/H1N1流感病毒部分基因片段重排的结果,对人H1N1甲型流感病毒疫苗可能并不敏感。     

两株人H7N9禽流感病毒的全基因组测序及分子特征分析

【目的】对两株从轻症病例和重症死亡病例中分离的人H7N9禽流感病毒进行全基因组测序,研究其来源、基因组特征以及相互间的分子差异,旨在了解毒株的遗传进化特征与其致病性及其所致疾病临床类型的关系,为进一步阐明H7N9禽流感病毒的致病机制提供科学依据。【方法】选取两株从轻症病例和重症死亡病例中分离的H7N9禽流感病毒进行全基因组序列测定;运用生物信息学软件比较分析两株病毒的遗传进化关系、基因组特征、受体结合位点、宿主特异性位点及致病相关位点等重要分子特征;从禽流感共享数据(GISAID)下载2013年至2014年10月轻症和重症病例的病毒分离株序列,分析致病相关关键位点差异,并分析这些变异与其致病性及所致疾病临床类型的关系。【结果】这两株H7N9禽流感病毒的HA、NA和M基因来源于2013年华东地区流行的H7N9禽流感病毒,NP、NS、PA、PB1和PB2基因来源于2013年在广东地区禽类中流行的H9N2禽流感病毒;H7N9禽流感病毒PA蛋白L336M和PB1蛋白I368V的突变率随流行时间的延长而逐渐上升,并存在地区差异;两株病毒各基因核苷酸同源性达到99.2%以上,氨基酸同源性在99.5%以上,但各基因节段存在个别氨基酸的差异,其中HA受体结合位点存在一个关键氨基酸的差异(226L和226 Q),宿主特异性位点存在两个关键氨基酸的差异(PB2-591L和PB2-591Q,PB2-627E和PB2-627K),毒力位点存在两个关键氨基酸差异(PA-353R和PA-353K,PB2-627E和PB2-627K);M2均发生了S31N突变;潜在糖基化位点均相对保守;2013年至2014年10月报道的重症病例病毒分离株PB2蛋白E627K突变率高于轻症病例分离株。【结论】两株来自不同临床类型的H7N9禽流感病毒是一种新的重组病毒,是由华东地区流行的人H7N9禽流感病毒和在广东地区禽类中流行的H9N2禽流感病毒基因重组而来;H7N9禽流感病毒的某些致病相关的关键氨基酸位点在流行的过程中不断发生变异,必须密切监测毒株的变异动向;两株致病力不同的病毒各基因节段虽然同源性较高,但存在关键氨基酸位点的差异,其中PB2蛋白627位氨基酸位点的差异可能对病毒的致病性起重要作用,与所致疾病临床类型相关。     

新型甲型H1N1流感病毒深圳分离株HA基因的克隆与进化

目的 分析2009年新型甲型H1N1流感病毒深圳分离株A/Shenzhen/71/09血凝素(Hemagglufinin,HA)基因序列,探讨其基因变异与分子进化.方法 采用RT-PCR技术扩增A/Shenzhen/71/09 HA基因片段并进行测序,利用Cluster和Mega3.1软件对不同亚型毒株HA基因核苷酸序列进行分析,绘制发育进化树. 结果 A/Shenzhen/71/09毒株HA基因包含HA1和HA2两个片段,长度分别约为1 032bp和669bp,HA蛋白裂解位点为VPSIQSR↓ GLF,不含连续碱性氨基酸.进化分析表明该病毒株与其它亚型病毒株遗传距离较远,而与深圳地区同期分离的其它H1N1毒株高度同源,同源性在99.0％以上.结论 新型甲型H1N1流感病毒HA基因不具备高致病流感病毒序列特征,深圳地区同期分离的毒株变异率低,但仍需密切关注新型甲型流感的传播情况.     

福州市甲型H1N1流感病毒血凝素基因遗传特性研究

目的探究福州市甲型H1N1流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)基因的遗传变异特点及种系进化分布,为研究甲型H1N1流感病毒进化、致病性和流行规律提供科学依据。方法采用MDCK细胞培养法和real-time PCR法进行流感病毒分离、鉴定。采用逆转录-聚合酶链反应扩增流感病毒血凝素基因,扩增产物经纯化后,进行血凝素基因HA区核苷酸序列测定并推导出其氨基酸序列,然后用DNASTAR MegAlign序列分析软件进行基因种系进化特性分析。结果福州市甲型H1N1流感病毒与参考株A/California/04/2009相比具有高度同源性,HA蛋白有4个位点氨基酸发生了替换,与猪流感代表株A/swine/Iowa/15/1930(H1N1)存在6个HA抗原决定簇位点变异。福州市甲型H1N1流感病毒株都有8个糖基化位点,其中6个位于HA1区,分离株HA蛋白不具有多碱基裂解位点,具有低致病性流感病毒特点。与美国流感病毒A/California/04/2009(H1N1)株共聚类为一个独立的小分支,进化关系最近,甲型H1N1流感病毒的HA源于古典型猪H1N1流感病毒,与A/swine/Iowa/1/1976(H1...     

新型甲型H7N9流感病毒PB1-F2蛋白基因进化和变异分析

目的：对新型甲型H7N9流感病毒PB1-F2蛋白基因的进化和变异进行分析,为进一步研究致病性禽流感的致病机制和毒力因子奠定基础。方法：从IRD数据库中下载2013年2月19日至2013年10月31日的H7N9流感病毒PBl基因序列63条,运用MEGA5．2．1软件进行序列分析,用邻接法构建基因进化树;通过氨基酸序列分析PB1基因95～367片段的PB1-F2蛋白氨基酸位点变化;应用Excel表格对氨基酸构成进行计算;运用Predictive Analytics Software（PASW）18．0软件对氨基酸构成改变进行统计分析。结果：63株甲型H7N9毒株中有17株毒株的PB1-F2蛋白在其氨基酸序列第25位后发生断裂。新型甲型H7N9的进化主要分为两个系别,系别I主要由完整型PB1-F2蛋白毒株构成,系别Ⅱ主要由52aa截短型PB1-F2蛋白毒株构成。完整型PB1-F2蛋白与截短型PB1-F2蛋白各类氨基酸构成存在差异。结论：H7N9流感毒株中存在着截短型PB1-F2蛋白毒株,并且H7N9流感病毒毒株PB1-F2蛋白断裂位点均在25位氨基酸后,这将成为H7N9流感毒株进化过程中重要的特征。完整型PB1-F2蛋白与截短型PB1-F2蛋白氨基酸构成的差异对于甲型H7N9流感病毒致病性的影响有待进一步研究。     

2000～2009年H1N1甲型流感病毒血凝素基因HA1的演变特征

目的研究2000～2009年世界各地不同物种的新型H1N1流感病毒HA1基因演变特征。方法从NCBI数据库下载所需序列,采用生物信息软件对其氨基酸序列进行基因特性分析以及构建种系发生树。结果病毒株HA1基因抗原决定簇和多个受体结合位点发生变异,并且新型病毒与猪H1N1流感病毒在大多数变异位点的氨基酸相同。结论新型毒株HA1基因可能由早期来自北美洲的H1N1猪流感病毒进化而来,在进化过程中,一些重要位点的变异导致HA1基因发生抗原性变异,从而导致流感的大爆发。     

重庆市2009～2014年甲型 H1N1流感病毒分离株 HA基因变异分析

目的：对2009～2014年分离得到的甲型H1N1流感病毒进行血凝素（HA）基因测序分析,与世界卫生组织（WHO）推荐疫苗株A／California／07／2009（H1N1）比对,研究其基因变异情况。方法按分离时间及地点不同,选取47株2011～2014年分离得到的甲型H1N1流感病毒进行测序,同时选取既往已有的25株2009年甲型H1N1流感病毒的序列结果,经分子生物学软件进行核苷酸及氨基酸序列分析,并绘制系统进化树。结果2009、2011～2014年的新型甲型 H1N1流感病毒与疫苗株均位于一个大的分枝下,各病毒间的关系均较近。72株分离株的 H A基因总的核苷酸差异在0～2．7％之间,氨基酸差异在0～3．1％之间;与疫苗株A／California／07／2009（H1N1）的核苷酸差异在0．4％～2．4％之间,氨基酸差异在0．9％～3．1％之间。氨基酸变异情况随着年份增加累积得更多,但在氨基酸序列上仍显示为低致病性流感病毒特征;2009年有9株病毒株丢失481位的糖基化位点,2013年有6株病毒株增加位于162位的糖基化位点。结论 WHO推荐的甲型 H1N1疫苗总体上对重庆地区的人群仍有较好的保护作用,但随着时间推移,部分甲型 H1N1流感病毒株可能已发生抗原漂移,需继续对其监测。     

Characterization of hemagglutinin gene of influenza A virus subtype H9N2

Objective　To determine the origin of human influenza A (H9N2) virus and the relationship among H9N2 strains isolated from different hosts, on the basis of molecular biology. Methods　Viruses were passed in embryonated hen eggs, and virion RNA was extracted from allantoic fluid and reverse transcribed to synthesize cDNA. cDNA was amplified by PCR and the PCR product was purified with a purification kit. Afterwards RNA sequence analysis was performed by dideoxynucleotide chain termination and a cloning method. Finally, phylogenetic analysis of the sequencing data was performed with MegAlign (version 1.03) and Editseg (version 3.69) softwares. Results　The amino acid sequences at the cleavage site between HA1 and HA2 domains of H9N2 viruses isolated in China are R-S-S-R. One pigeon strain contains seven potential glycosylation sites on the HA protein molecule, while all others have eight. There are 2 to 15 differences of amino acid sequences distributed at 24 different positions on the HA protein molecules among six H9N2 viruses. The H9N2 viruses with multiple lineages of HA genes were co-circulating in China recently. Conclusion　The highest possibility is that human influenza A (H9N2) virus was derived from Chicken H9N2 virus, and not derived from pigeon H9N2 virus. However, it is still unknown whether the H9N2 virus could transmit from person to person. The H9N2 viruses with multiple lineages of HA genes are co-circulating in China.     

甲型流感病毒H9N2亚型毒株血凝素基因特性的研究

目的　了解人甲型流感病毒H9N2亚型毒株的来源及从分子生物学角度来弄清不同宿主来源的H9N2亚型毒株间相互关系。方法　病毒在鸡胚中传代 ,从收获的尿囊液中提取病毒粒RNA ,通过逆转录合成cDNA。cDNA通过PCR进行扩增 ,接着PCR产物用纯化试剂盒进行纯化。而后 ,RNA序列测定是采用双脱氧链末端终止和克隆法。最后用MegAlign( 1.0 3版 )和Editseq( 3.69版 )软件进行种系发生学分析。结果　从中国所分离出的H9N2亚型毒株。它们的HA1与HA2间裂解部位的氨基酸序列均为R S S R ,除一株鸽病毒其HA蛋白分子上仅含 7个潜在的糖基化位点外 ,而其余的均含 8个。 6株H9N2毒株HA蛋白分子上氨基酸序列有 2 - 16个不同 ,这些不同分布在 2 4个不同的位点上。近来在中国同时流行着多种HA基因系的H9N2亚型毒株。结论　人甲型流感病毒H9N2亚型毒株可能性最大来自鸡的H9N2毒株 ,而不是来源于鸽的H9N2毒株。但 ,H9N2毒株是否具有人传人能力 ,至今仍不清楚。在中国同时流行着多种HA基因系的H9N2毒株。     

中国大陆H7N9禽流感病毒流行病学特征及血凝素和神经氨酸酶的分子进化

摘 要: 【目的】 对中国大陆人感染H7N9禽流感的流行病学特征进行描述分析,并对不同地区?不同时间?不同宿主来源的H7N9禽流感血凝素及神经氨酸酶基因进行分子进化分析,为H7N9禽流感的科学防控提供依据?【方法】 汇总各公开网站发布的人感染H7N9禽流感病例信息,分析人感染H7N9禽流感的流行病学特点;从Genbank筛选H7N9禽流感毒株的核酸序列及氨基酸序列,利用MEGE5.0?Bioedit等软件构建进化树,分析核苷酸及所编码蛋白关键位点的变异情况?【结果】全国共报告451例人感染H7N9禽流感病例,病死率为19.96%,男女性别比约为2.25:1; 60岁以上(含60岁)病例占全部病例的45.76%;浙江,广东,江苏,上海四省市报告病例较多;2013年4月前后和2014年1月至2月为两个发病高峰?进化树显示H7N9禽流感毒株分为美洲来源支和欧亚来源支,分离的时间地点越接近进化关系越近?自韩国2011年野鸟中分离的H7N9毒株的NA基因与中国2013年及2014年分离的H7N9毒株NA基因进化关系较近?广东第一例人H7N9禽流感的NA基因与2013年5月分离自山东环境中的H7N9禽流感的NA基因及2013年4月来自浙江人感染H7N9禽流感的NA基因的同源性较高?所有人感染H7N9毒株NA茎区69~73位缺失了QISNT序列?【结论】 老人及男性是感染H7N9禽流感的高危人群,冬春季是疫情高发期,病例集中分布于东南沿海地区?分子进化分析表明H7N9禽流感毒株有时间和空间的聚集性,时间空间距离越短则进化关系越接近?广东地区H7N9禽流感病毒可能是北方的候鸟迁徙所致,中国H7N9毒株NA片段可能来自韩国禽类携带的毒株?人感染H7N9禽流感病毒的毒力及耐药性尚未发生变异?NA茎区69~73位缺失QISNT序列可能与该病毒具有感染人类的能力有关?     

新型H7N9流感防控中的公共卫生问题与应对对策

2013年3月,在中国境内报道了首例因感染新型甲型H7N9流感病毒而致死的病例。除了病毒基因重组、重要氨基酸位点变异等病毒进化生物因素外,还存在影响人感染新型甲型H7N9流感的社会因素。目前中国尚存在活禽养殖过程不规范、交易市场管理混乱、从业人员卫生意识薄弱、居民自我防护措施不足等问题。这些因素通过增加人与生禽密切接触机会而促进流感病毒传播,增加人患禽流感的危险性。针对上述情况,在今后的流感防控工作中,应加强农、林、医等多部门联动机制的建设,进行高效的防控与监测;通过健康教育来提高居民的健康保护意识及风险意识。同时应该根据禽流感病毒进化监测数据加快科学研发流感疫苗进程。基于社会影响因素开展公共卫生预防应是今后降低人感染禽流感发生率的重要措施。     

2009年新型甲型H1N1流感病毒基质蛋白及核蛋白基因进化分析

目的:探讨2009年新型甲型流感病毒(A/H1N1)基质蛋白(M)及核蛋白(NP)基因的进化规律。方法:从NCBI数据库下载147条甲型H1N1流感病毒M基因及NP基因序列,采用Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 4.0(MEGA4.0)软件对M基因和NP基因序列进行比对,并用NJ法构建进化树,同时采用Epi Info软件分析1918~2009年人H1N1病毒的M基因和NP基因序列进化距离的线性趋势。采用MEGA4.0软件对M2蛋白氨基酸序列进行比对。结果:不同地区的2009年新型甲型H1N1流感病毒M基因、NP基因同源性高,但与历史上流行的H1N1流感病毒M基因、NP基因差异较大,且M基因进化距离随分离年限变化的趋势性检验结果有统计学意义(Ptrend=0.001)。2009年新型甲型A/H1N1流感病毒M2蛋白与1918~2008年人A/H1N1病毒M2蛋白氨基酸序列进行比对,结果显示在第11、43、54、57、77、78氨基酸位点发生了改变;与猪、禽A/H1N1的M2蛋白氨基酸序列进行比对,结果显示仅在第43、77位氨基酸位点发生改变。结论:2009年新型甲型A/H1N1流感病毒NP基因片段较以往流行的人H1N1流感病毒NP基因发生了改变;M2蛋白位于胞外编码区的第11位氨基酸、位于TM结构域的第43位氨基酸突变可能导致了新型甲型A/H1N1流感病毒对金刚烷胺类特异性抗病毒药物产生耐药。