Retroviral vector containing human p16 gene and its inhibitory effect on Bcap -37 breast cancer cells

目的　研究p16基因对肿瘤细胞生长抑制及细胞周期阻滞作用。方法　将p16cDNA插入逆转录病毒载体pLXSN构建成p16基因逆转录病毒重组体pLp16SN。利用基因转染方法 ,将pLp16SN及pLXSN导入逆转录病毒包装细胞系PA317细胞 ,获得逆转录病毒。用逆转录病毒感染Bcap 37乳腺癌细胞 ,经G4 18筛选获阳性克隆。利用Northern和Westernblotting方法检测p16基因的表达。检测转基因细胞的生长速度 ,细胞周期及裸鼠成瘤等细胞生物学行为的改变。结果　Northern及Westernblotting显示转染p16基因的Bcap 37细胞p16基因mRNA及蛋白质表达明显增高。此细胞较未转染基因的Bcap 37细胞和转染空载体的Bcap 37细胞生长速度慢 ,G1期细胞比率增高 ,裸鼠接种成瘤体积小。结论　p16基因高表达能够抑制乳腺癌细胞Bcap 37的生长 ,并阻滞细胞从G1期进入S期     

重组正反义α-SMA逆转录病毒载体对瘢痕与皮肤成纤维细胞的影响

目的 利用α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)基因重组反义和正义逆转录病毒载体，探讨α-SMA逆转录病毒对瘢痕与皮肤成纤维细胞的影响。方法 用含α-平滑肌肌动蛋白cDNA，重组反义和正义逆转录病毒载体，并感染培养的瘢痕和皮肤成纤维细胞，进行α-SMA在蛋白水平表达等的研究，观察瘢痕与皮肤成纤维细胞形态学与功能的变化。结果 反义α-SMA逆转录病毒抑制了瘢痕成纤维细胞的增殖，细胞形态变小；α-SMA在瘢痕与皮肤成纤维细胞表达降低，并随着作用时间延长，效果更明显；正义α-SMA逆转录病毒则具有相反的作用，促进α-SMA的表达。结论 α-SMA重组病毒对瘢痕与皮肤成纤维细胞的形态、生长、细胞功能均有影响。     

人TNF-α重组腺病毒转染人肺腺癌细胞的体外生物学特性研究

目的 在利用COS／TPC同源重组法高效制备hTNF-α重组腺病毒基础上，对感染人INF-α重组病毒的人肺腺癌细胞（Anip973）的体外生物学特性进行研究。方法 将携带有人TNF－α基因的重组腺病毒（rAd-hTNF-α）感染人肺腺癌细胞系,通过细胞生长实验、克隆形成实验、流式细胞分析、形态学检查等观察其对Anip973肿瘤细胞的作用；利用PCR和琼脂糖电泳对肺癌中人TNF－α基因进行了检测。结果 rAd-hTNF-α经扩增、纯化后，滴度可达10^10PFU／ml，当病毒为30MOI时，对Anip973细胞的转染率达90％以上。转染的Anip973肿瘤细胞除表面结构和超微结构有轻微变化外，其生长能力、克隆形成率及细胞周期等无明显变化。结论 腺病毒介导的细胞因子基因hTNF-α转染的ANIP973肿瘤细胞未见明显变化，为制备肿瘤疫苗打下基础。     

IL-18基因转导乳腺癌细胞肿瘤原性的改变及抗瘤作用的研究

目的：建立转人白细胞介素-18（IL-18）基因的乳腺癌细胞株Bcap37细胞,并探讨IL-18基因转导后Bcap37细胞肿瘤原性的改变和抗瘤作用。方法：将携带人IL-18的质粒pcDNA3.1-IL-18转导入人乳腺癌细胞系Bcap37细胞中,通过药物G418进行筛选,采用RT-PCR和ELISA法对IL-18基因的表达进行检测;裸鼠致瘤实验观察肿瘤原性的改变;观察灭活后Bcap37-IL-18细胞的抗瘤作用。结果：IL-18基因成功转导入Bcap37细胞中并能顺利表达;RT-PCR 电泳结果显示IL-18基因在mRNA水平有表达;ELISA结果显示,106个转导细胞在24h内分泌IL-18的含量是(126.3±4.5)pg; 空载体转染的细胞未检测到IL-18;裸鼠致瘤实验表明,接种Bcap37-IL-18细胞的裸鼠肿瘤的生长速度明显低于Bcap37组和Bcap37-pCDNA3.1组;抗瘤实验结果显示,放射灭活的Bcap37-pcDNA3.1细胞和Bcap37-IL-18细胞免疫接种裸鼠后,再接种Bcap37细胞于裸鼠左侧背部皮下。肿瘤长出的时间Bcap37-IL-18细胞免疫接种组比Bcap37 pCDNA3.1细胞免疫接种组明显延长,且肿瘤的体积Bcap37-IL-18细胞免疫接种组比Bcap37-pCDNA3.1细胞免疫接种组小。结论: IL-18基因能成功的整合到Bcap37细胞基因组中,且在转导的肿瘤细胞中持续表达;IL-18基因转染降低了Bcap37细胞的肿瘤原性;IL-18基因修饰的Bcap37细胞具有明显的抗肿瘤作用。     

薯蓣皂苷元及其维吉尼链霉菌IBL-14转化产物体外抑制人乳腺癌细胞Bcap37的作用研究

通过维吉尼链霉菌（Streptomyces virginiae) IBL-14对薯蓣皂苷元进行生物转化,得到一系列新的代谢产物;用四唑蓝(MTT)比色法测定薯蓣皂苷元及其衍生物对Hela、Bcap37、KB-3-1、SW1990 4种肿瘤细胞的体外抑制作用;用Hoechst 33258细胞核荧光染色来观察薯蓣皂苷元及其衍生物对Bcap37细胞形态学上的改变;采用流式细胞计量法测定薯蓣皂苷元及其衍生物对Bcap37细胞的凋亡作用。结果表明：薯蓣皂苷元及其3个衍生物在一定浓度范围内,对上述4种肿瘤细胞均有抑制生长的作用,其中对人乳腺癌细胞 Bcap37的抑制效果相对显著。在薯蓣皂苷元及其衍生物的影响下,人乳腺癌细胞Bcap37细胞呈现典型的细胞凋亡特征,包括细胞形态的变化和DNA片段的变化。薯蓣皂苷元及相关衍生物能对Bcap37细胞产生抑制增殖的作用,并能诱导使之发生细胞凋亡。     

重组腺病毒介导的CTLA-4Ig基因在人源性细胞中的表达

目的：了解CTLA－4Ig重组腺病毒在不同人细胞中的转染能力及表达效率，为其器官转染研究及其治疗应用奠定基础。方法：用所构建的CTLA－4Ig腺病毒感染培养的HeLa细胞，人成纤维细胞，人脐静脉内皮细胞，应用免疫组化检测CTLA－4Ig的表达情况，结果：与重组腺病毒共培养6h使HeLa细胞获得转染，12h开始表达，36h表达达高峰；人成纤维细胞8h获得转染，24h开始表达，60h后达高峰，人脐静脉内皮细胞4h获得转染，12h开始表达，36h后达高峰。结论：CTLA－4Ig重组腺病毒能高效转染HeLa细胞，人成纤维细胞，人脐静脉内皮细胞。     

人DeltaNp73α基因重组腺病毒载体的构建及其鉴定

目的利用Adeasy腺病毒载体系统构建含人DehaNp73α cDNA的重组腺病毒并在293细胞中扩增制备重组病毒。方法从pcDNA3-DeltaNp73α—HA中酶切出DehaNp73α基因，并插入pAdTrack—CMV中构建成腺病毒穿梭质粒；pAdTrack-CMV—DehaNp73α线性化后电穿孔法转化到含有腺病毒骨架质粒pAdeasy-1的E.coli．BJ5183菌株内同源重组。筛选正确的重组质粒，PacⅠ线性化后脂质体法转染293T细胞包装成重组病毒颗粒；并在293T细胞中反复扩增；增强离心法转染树突状细胞，Western blot检测目的蛋白的表达。结果经限制性内切酶酶切鉴定、PCR筛选、基因测序和GFP表达证实成功构建了携带DehaNp73α cDNA的重组腺病毒载体并制备出高滴度的重组病毒；Western blot检测出预期相对分子质量为67×10^3的特异条带。结论成功构建了携带DehaNp73α cDNA的重组病毒。     

人p27~(kipl)可调控性重组腺病毒载体的构建及其在PC-3细胞中的表达

目的:体外构建人p27kipl可调控性重组腺病毒载体,并观察其在前列腺癌细胞系PC-3细胞中的表达及其对细胞生长的影响。方法:采用Ad-X Tet-Off表达系统,将人全长p27kipl cDNA经过穿梭载体,与可调控性腺病毒载体骨架连接,得到重组人p27kipl基因腺病毒(Ad-p27kipl),在HEK293细胞包装、扩增,获得高滴度病毒,采用空斑试验测定病毒滴度,体外转染PC-3细胞,RT-PCR、Western杂交分别检测目的基因不同水平的表达,并通过MTT法观察转染前后细胞增殖力的变化。Ad-X-TRE-β gal病毒作为对照。结果:构建的Ad-p27kipl病毒滴度为1.2×109 pfu/ml,RT-PCR、Western杂交检测有特异的高表达,转染后对细胞的生长有抑制作用。结论:体外连接法成功地构建携带人p27kipl基因的可调控性重组腺病毒载体,在人前列腺癌细胞系PC-3中有高表达并对细胞生长有抑制作用。     

阿霉素对不同乳腺癌细胞株的抑制及凋亡调控作用

目的 探讨阿霉素(ADM)对人乳腺癌细胞株Bcap37、MDA-MB-231的抑制作用效果及机制,评估细胞凋亡对乳腺癌治疗应用价值。方法 应用不同浓度阿霉素作用于Bcap37、MDA-MB-231,用MTT法检测抑制率,流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡及凋亡相关分子Fas、Bcl-2与突变型p53蛋白表达的变化。结果 阿霉素对Bcap37的抑制率较高并呈剂量和时间依赖性,但对MDA-MB-231抑制率较低,且剂量和时间效应关系不明显。阿霉素作用于Bcap37后Fas表达升高,Bcl-2表达降低,可观察到细胞凋亡。阿霉素作用于MDA-MB-231后p53、Fas、Bcl-2表达变化不明显,未发现凋亡细胞。结论 不同的乳腺癌细胞株南于其分子生物学特性不同,对化疗敏感性、抗药性不同,与化疗药物对其诱导凋亡的能力差异有关,为乳腺癌的个体化治疗提供实验依据。     

瘤体内注射肿瘤坏死因子重组腺病毒对大鼠乳腺癌的治疗作用

目的:观察腺病毒重组肿瘤坏死因子(TNF)基因转染对大鼠乳腺癌细胞Walker256体内致瘤性的影响及瘤体内注射TNF重组腺病毒对Walker256荷瘤大鼠的治疗作用.方法:Walker256乳癌细胞感染人TNF重组腺病毒后,观察其体外增殖能力、皮下致瘤性的变化及进行肿瘤局部病理学检查;瘤体局部注射TNF重组腺病毒(Ad.hTNF),观察荷瘤大鼠的肿瘤生长情况及生存期.结果:Walker256感染人TNF重组腺病毒后,培养上清中24 h TNF的分泌量达5.2 ng/106细胞,细胞形态学无明显变化,体外增殖能力和皮下致瘤性显著下降,瘤体周围有大量淋巴细胞及单核细胞浸润;肿瘤局部注射Ad.hTNF能显著抑制Walker256的生长,并延长荷瘤大鼠的生存期.结论:重组腺病毒能有效介导TNF基因转染Walker256细胞,瘤体内局部注射Ad.hTNF对Walker256荷瘤大鼠具有明显的治疗作用.     

双自杀基因系统诱导乳腺癌细胞凋亡的体内外实验研究

目的探讨VEGF启动子驱动的双自杀基因体系对人乳腺癌细胞MCF-7靶向治疗作用以及该体系能否诱导体内外MCF-7细胞的凋亡。方法选择表达VEGF的MCF-7细胞和不表达VEGF的原代培养的乳腺上皮细胞，用重组腺病毒Ad—VEGFP—CD／TK感染之，荧光显微镜观察其感染效率。R．T—PCR．方法检测受感染细胞目的基因的表达，给予前药GCV和5-FC后于倒置显微镜观察，采用流式细胞仪检测细胞内DNA含量的变化。建立荷人乳腺癌的裸鼠动物模型，观察各治疗组的治疗效果，应用透射电镜观察移植瘤细胞超微结构。结果携带双自杀基因和报告基因（GFP）的重组腺病毒载体，感染复数为100时，95％以上的受感染MCF-7和乳腺上皮细胞中有GFP表达。RT—PCK检测发现MCF-7细胞有目的基因的表达。而乳腺上皮细胞无表达。倒置显微镜下观察用药组细胞出现凋亡征象；用流式细胞仪测定用药组出现典型的凋亡峰。在MCF-7裸鼠移植瘤模型中，治疗组裸鼠移植瘤的生长明显受到抑制，其余各组肿瘤生长情况无明显差别；在透射电镜下可见治疗组多量的凋亡细胞。结论体内外实验均表明VEGF启动子可调控双自杀基因体系靶向性诱导人乳腺癌细胞MCF-7细胞凋亡。     

细菌内同源重组制备重组腺病毒及其初步应用

目的通过细菌内同源重组方法构建重组腺病毒。方法质粒pAdTrack酶切线性化后，通过电转化方法转化AdEasier细菌，线性化的腺病毒重组质粒转染293包装细胞后获得重组腺病毒，观察腺病毒感染喉癌细胞Hep-2后的报告基因表达情况及病毒对培养细胞生长的影响。结果构建的重组腺病毒经酶切电泳鉴定正确；扩增的腺病毒转染培养的Hep-2细胞8 h后即开始表达报告基因，48 h后全部细胞均有报告基因表达；该重组的腺病毒对培养Hep-2细胞生长无明显影响。结论通过细菌内同源重组方法构建重组腺病毒，方法简单、成功率高、实验周期短。     

人p27kip1可调控性重组腺病毒载体的构建及其在PC-3细胞中的表达

目的:体外构建人p27kip1可调控性重组腺病毒载体,并观察其在前列腺癌细胞系PC-3细胞中的表达及其对细胞生长的影响.方法:采用Ad-X Tet-Off表达系统,将人全长p27kip1 cDNA经过穿梭载体,与可调控性腺病毒载体骨架连接,得到重组人p27kip1基因腺病毒(Ad-p27kip1),在HEK293细胞包装、扩增,获得高滴度病毒,采用空斑试验测定病毒滴度,体外转染PC-3细胞,RT-PCR、Western 杂交分别检测目的基因不同水平的表达,并通过MTT法观察转染前后细胞增殖力的变化.Ad-X-TRE-β gal病毒作为对照.结果:构建的Ad-p27kip1病毒滴度为1.2×109 pfu/ml,RT-PCR、Western 杂交检测有特异的高表达,转染后对细胞的生长有抑制作用.结论:体外连接法成功地构建携带人p27kip1基因的可调控性重组腺病毒载体,在人前列腺癌细胞系PC-3中有高表达并对细胞生长有抑制作用.     

hTERT启动子调控的CD基因对卵巢癌细胞株的选择性杀伤作用研究

目的探讨由人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子驱动的含胞嘧啶脱氨酶(CD)基因的复制缺陷型腺病毒对卵巢癌细胞的选择性杀伤作用。方法将自行构建的由hTERT启动子调控的携带CD基因的重组腺病毒分别感染人卵巢癌细胞株SKOV3及人胚肺成纤维细胞,通过MTT法检测受染细胞的存活率,观察分析腺病毒载体对细胞的杀伤作用。结果用不同滴度的重组腺病毒以及不同浓度的5-FC作用于SKOV3细胞后,MTT法检测到细胞的存活率随着病毒滴度和5-FC浓度的增加而不断降低;而同样的处理对人胚肺成纤维细胞的也有部分杀伤作用,但远较SKOV3细胞弱,差异有统计学意义(P<0.01)。结论本实验构建的复制缺陷型腺病毒Ad-hTERTp-CD对SKOV3细胞具有靶向杀伤的能力。     

人端粒酶逆转录酶启动子介导的E1A和IL-24表达及其对肝癌细胞生长的抑制作用

目的构建人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子介导的E1A和IL-24双基因靶向腺病毒载体,获得Ad-h-E1A-IL-24靶向重组病毒子,并探索其体外抑瘤作用。方法运用PCR扩增MCF-7乳腺癌细胞的DNA,XbaⅠ和HindⅢ酶切获得280 bp hTERT启动子,插入空载体构建成pTrack-hTERT;运用PCR及HindⅢ和XhoⅠ酶切获得E1A,与pTrack-hTERT构成pAdTrack-hTERT-E1A;运用PCR及NotⅠ和SalⅠ酶切获得IL-24,插入pTrack-PP-IRES;XbaⅠ和XhoⅠ酶切获得hTERT-E1A,与pTrack-PP-IL-24-IRES形成pTrack-hTERT-E1A-PP-IL-24-IRES,同源重组、包装和扩增获得Ad-h-E1A-IL-24重组靶向病毒子。用25 MOI重组靶向腺病毒感染SMMC-7721肝癌细胞,MTT法测定Ad-h-E1A-IL-24的细胞生长抑制作用。结果成功构建pTrack-hTERT-E1A-PP-IL-24-IRES,并获得Ad-h-E1A-IL-24重组病毒子。与非靶向双基因比较,Ad-h-E1A-IL-24组可明显抑制肿瘤细胞生长（P〈0.05或0.01）。结论Ad-h-E1A-IL-24靶向腺病毒载体的体外抑瘤作用优于非靶向双基因载体。     

人低氧诱导因子-1α重组腺病毒的构建和鉴定

目的 利用AdMax腺病毒载体系统构建人重组低氧诱导因子-1α(rhHIF-1α)基因腺病毒并在293细胞中扩增制备重组病毒. 方法 自先期构建的pcDNA4-rhHIF-1α真核表达载体中用RT-PCR法扩增出rhHIF-1α基因片段,将其克隆入线性化的pEGFP1-C1质粒中,用PCR法扩增EGFP-rhHIF-1α基因片段,将其克隆入PUC18质粒中.酶切构建好的pUC18-rhHIF-1α载体并克隆进入穿梭质粒PDC316中,将构建好的穿梭质粒PDC316-rhHIF-1α载体和骨架病毒pBHGlox△1,3Cre共转染293细胞,包装成重组的病毒颗粒.重组的病毒转染SG-7901细胞,荧光显微镜观察绿色荧光表达. 结果 经限制性内切酶检测和GFP表达证实成功地构建了携带重组人HIF-1α基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒. 结论 成功地构建了携带rhHIF-1α基因片段的重组腺病毒载体.     

外源性mIκBα基因在肝癌细胞Hep G2中的表达及对其生长的影响

目的观察mIκBα基因对肝癌细胞生长的影响。方法同源重组法构建含mIκBα基因的重组腺病毒质粒,经293细胞包装成含mIκBα的重组腺病毒。用此腺病毒感染肝癌细胞Hep G2,测定感染效率。通过集落形成实验、细胞生长曲线等方法观察目的基因对肝癌细胞生长的影响。结果重组腺病毒含有舳基因。重组腺病毒可在肝癌细胞中稳定地表达,感染的肝癌细胞形成的集落数明显少于对照组（P〈0．01）;重组腺病毒感染的肝癌细胞在软琼脂内存活,对照组细胞则无法存活;重组腺病毒感染的肝癌细胞生长速度减慢。结论含目的基因mIκBα的腺病毒重组体在293细胞中扩增并有效地转染Hep G2细胞;外源性mIκBα基因可以抑制肝癌细胞Hep G2的生长。     

重组hBMP7基因转染成纤维细胞及其表达

目的 探讨重组骨形态发生蛋白-7腺病毒载体(AdCMV-BMP7)在人真皮成纤维细胞获得稳定表达的可行性。方法 重组腺病毒载体AdcMV-BMP7经293细胞包装、扩增后，转染人真皮成纤维细胞。转染48h后以免疫组织化学、RT-PCR等方法检测hBMP7基因在人真皮成纤维细胞内的表达情况。结果 在合适的滴度下，重组腺病毒载体AdCMV-BMP7对成纤维细胞的增殖能力无明显影响。转染48h后免疫细胞化学显示已转染AdCMV-BMP7的成纤维细胞内有大量的hBMP7表达，RT-PCR也检测到特异的hBMP7基因片段的表达。结论 重组腺病毒载体AdcMV-BMP7能够被转导入成纤维细胞内。并稳定表达hBMP7。     

hTERT启动子调控腺病毒介导的CD基因治疗卵巢癌的实验研究

目的:构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子驱动的含胞嘧啶脱氨酶(CD)基因的复制缺陷型腺病毒载体,使CD基因只能在端粒酶阳性的细胞表达.方法:采用细胞内同源重组法构建出hTERT启动子调控的携带CD基因的复制缺陷型腺病毒Ad-hTERTp-CD,经PCR鉴定正确后进行扩增、纯化和滴度测定.分别将腺病毒感染人卵巢癌细胞株SKOV3及人胚肺成纤维细胞,MTT法检测受染细胞的存活率.结果:构建的重组腺病毒中带有hTERT启动子及CD基因.用不同滴度的重组腺病毒以及不同浓度的5-FC作用于SKOV3细胞后,MTT法检测到细胞的存活率随着病毒滴度和5-FC浓度的增加而不断降低;而同样的处理对人胚肺成纤维细胞的也有部分杀伤作用,但远较SKOV3细胞弱,差异有统计学意义(P＜0.01).结论:本实验构建的由hTERT启动子调控的携带CD基因的复制缺陷型腺病毒Ad-hTERTp-CD对SKOV3细胞具有靶向杀伤的能力.     

含人血红素氧化酶-1重组11P型腺病毒的构建及体外表达

目的构建含人血红素氧化酶-1重组11P型腺病毒,并使之转染人BJ细胞,测定其转染效率及目的蛋白表达情况。方法PCR目的基因序列,克隆成穿梭载体后转化大肠肝菌。扩增提取质粒,鉴定正确后与骨架载体重组,鉴定重组质粒正确并无野毒后在293细胞中扩增,CsCl密度梯度离心法纯化腺病毒,按不同梯度MOI值感染成纤维细胞,根据绿色荧光强度检测其转染效率。1周后用免疫组化方法检测目的蛋白HO—1表达情况。结采对重组腺病毒进行酶切和PCR鉴定,证实含人血红素氧化酶－1（HO－1）的11P型重组腺病毒构建成功,纯化后病毒滴度达到1．0×10^10pfu／ml。通过免疫组化检测可在成纤维细胞中观察到胞浆内有棕褐色目的蛋白阳性颗粒表达。结论可以成功构建含人血红素氧化酶－1（HO－1）的11P型重组腺病毒并表达目的蛋白。